JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 4:24 min • July 8th, 2025
Tome un tubo que contenga una suspensión de bacterias intestinales humanas.
Agregue partículas similares al virus del norovirus humano o VLP. Las VLP contienen una cápside viral intacta pero carecen de ARN genómico, lo que las hace no infecciosas para los humanos.
Durante la incubación, las proteínas de la cápside VLP se unen a carbohidratos específicos expresados en la superficie bacteriana, formando complejos VLP-bacterias.
Centrifugar para peletizar los complejos y desechar las VLP no unidas.
Introduzca una solución de bloqueo que contenga proteínas para bloquear los sitios de unión de anticuerpos no específicos, reduciendo la tinción de fondo en los pasos posteriores.
Agregue anticuerpos específicos de VLP marcados con fluorescencia e incube.
Los anticuerpos se unen a sus sitios diana en la cápside de VLP, marcando los complejos VLP-bacteria.
Centrifugar para peletizar los complejos. Deseche los anticuerpos no unidos y vuelva a suspender el sedimento en un tampón de citometría de flujo.
Usando un citómetro de flujo, detecte señales de fluorescencia emitidas por complejos VLP-bacterias, lo que permite la cuantificación del porcentaje de bacterias unidas en la muestra.
Después de preparar los reactivos, anticuerpos y bacterias como se describe en el manuscrito, ensamble todos los materiales en un gabinete de bioseguridad BSL II.
Las partículas similares a los virus para el norovirus humano están catalogadas como patógenos BSL II, y todo el trabajo realizado con VLP debe realizarse en un gabinete de bioseguridad certificado.
Agregue 10 microgramos de VLP de norovirus humano a cada tubo de bacterias y mezcle bien mediante pipeteo. Incube los tubos durante 1 hora a 37 grados centígrados con rotación constante. Después de la incubación, centrifugar los tubos a 10.000 veces g durante 5 minutos.
Aspire y deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo bacteriano en 1 mililitro de PBS. Después de repetir los pasos de lavado una vez, centrifugar los tubos nuevamente a 10,000 veces g durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo de bacterias VLP en 150 microlitros de tampón de bloqueo al 5%.
Un error común que ocurre es que se intercambian las trompas y se agrega el tratamiento incorrecto. Para evitar esto, coloque todos los tubos en líneas que correspondan al tratamiento correcto y agregue un tratamiento de una sola vez a los tubos.
Para cada muestra bacteriana, prepare 50 microlitros de anticuerpo G2 de norovirus humano diluido. Usando un tampón de bloqueo al 5%, diluya el anticuerpo 1 a 125 para muestras de casos de E. coli. Prepare 50 microlitros de anticuerpo isotipo diluido para cada muestra bacteriana utilizando las mismas proporciones de dilución. Divida cada muestra de ensayo de fijación en alícuotas de 350 microlitros transfiriéndolas a tubos de centrífuga limpios de 1,5 mililitros.
Para crear controles sin teñir, agregue 50 microlitros de tampón de bloqueo a la primera alícuota de cada muestra bacteriana. Para las muestras teñidas, agregue 50 microlitros de la dilución de anticuerpos G2 al segundo conjunto de alícuotas. Cree los controles de isotipo agregando 50 microlitros del anticuerpo isotipo diluido al tercer conjunto de alícuotas.
Incube todas las muestras en hielo y en la oscuridad durante 30 minutos. A continuación, centrifugar todas las muestras a 10.000 veces g durante 5 minutos. Deseche los sobrenadantes y vuelva a suspender cada muestra en 150 microlitros de FCSB. Nuevamente, centrifugar todas las muestras a 10,000 veces g durante 5 minutos. Nuevamente, deseche los sobrenadantes y vuelva a suspender las muestras en 100 microlitros de FCSB.
Después de centrifugar las muestras por última vez y desechar el sobrenadante, vuelva a suspender las muestras en 150 microlitros de FCSB. Transfiera cada muestra a un tubo que contenga 400 microlitros de FCSB para un volumen total de 550 microlitros. Almacene las muestras a 4 grados centígrados hasta que se analicen mediante citometría de flujo.