Un inmunoensayo de electroforesis capilar para la detección de biomarcadores de proteínas

Para detectar un biomarcador proteico asociado a la enfermedad, tome una placa de inmunoensayo.

La placa contiene matrices de separación y apilamiento precargadas necesarias para la separación de proteínas basada en el tamaño.

Cargue las proteínas y los reactivos de inmunoensayo en distintos pocillos de placas.

Inicie la ejecución dentro de un analizador CEI. El cartucho capilar del analizador aspira las matrices para formar un gel dentro de cada capilar.

Luego, el capilar aspira las proteínas. Durante la electroforesis, las proteínas migran y se separan en función de sus pesos moleculares.

El analizador introduce luz ultravioleta, inmovilizando las proteínas en el capilar.

El tampón de lavado elimina las matrices y las proteínas no unidas. A continuación, el búfer de bloqueo fluye, bloqueando los sitios de interacción no específicos.

El analizador introduce anticuerpos primarios que se unen al biomarcador, seguidos de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa que interactúan con los anticuerpos primarios.

Lavar y luego agregar el sustrato de quimioluminiscencia. La peroxidasa oxida el sustrato, emitiendo luminiscencia.

Mida la intensidad de la luminiscencia y compárela con el estándar de proteínas para la detección de biomarcadores.

Después de recolectar 100 microlitros de lisados de plaquetas humanas de pacientes con ELA y sujetos sanos, complete plantillas generadas internamente para el diseño capilar y la preparación de la muestra. La tabla de preparación de la mezcla de muestras es dinámica y calculará automáticamente cuánto volumen debe eliminarse de la fuente. Coloque todos los reactivos del ensayo en hielo, excepto el paquete estándar que debe permanecer a temperatura ambiente.

Para preparar la mezcla maestra fluorescente, agregue 40 microlitros de agua desionizada a un tubo transparente de DTT y agregue 20 microlitros de tampón de muestra 10X y 20 microlitros de la solución de DTT de 400 milimolares preparada al tubo rosa del kit de ensayo.

Para preparar la escalera biotinilada, agregue 16 microlitros de agua desionizada, 2 microlitros de tampón de muestra 10X y 2 microlitros de la solución DTT de 400 milimolares preparada al tubo blanco provisto en el kit. Después de una mezcla suave, transfiera la solución de escalera a un tubo de PCR de 200 microlitros antes de desnaturalizar.

Agregue 1,5 microlitros de tampón de muestra 10X y 148,5 microlitros de agua desionizada a un tubo de microcentrífuga de 600 microlitros. y vórtice para mezclar, antes de colocar el tubo en hielo. Agregue los anticuerpos de interés directamente al diluyente, como se indica en la tabla, y enjuague la punta de la pipeta varias veces para obtener una solución de anticuerpos homogénea.

Para preparar la mezcla de muestras capilares, abra todos los tubos de PCR y agregue alícuotas de 1,6 microlitros de tampón de muestra fluorescente 5X a cada tubo, como se indica en la tabla, utilizando una técnica de pipeteo inverso, cerrando inmediatamente cada tubo a medida que se agrega el tampón. Cuando se haya agregado todo el tampón, abra todos los tubos y agregue un tampón de muestra de 0,1x en volúmenes como se indica en la tabla, cerrando inmediatamente cada tubo a medida que se agrega el tampón.

A continuación, abra todos los tubos, agregue las muestras de proteínas como se indica en la tabla e inmediatamente cierre cada tapa de tubo. Cuando se hayan agregado todas las muestras, centrifugue brevemente todos los tubos en una centrífuga de sobremesa. Vortex para mezclar y centrifugar las muestras nuevamente.

Al final de la segunda centrifugación, coloque todos los tubos en un termociclador con tapa calentada y desnaturalice las muestras en las condiciones indicadas. Al final de la desnaturalización, centrifuga, mezcla y centrifuga las muestras nuevamente, y coloca todos los tubos en una gradilla de tubos sobre hielo.

Usando la figura como guía, agregue 10 microlitros de estreptavidina peroxidasa de rábano picante al pocillo D1, 10 microlitros del anticuerpo secundario apropiado a los pocillos D2 a D5, 10 microlitros de diluyente de anticuerpos a cada pocillo en la fila B y al pocillo C1, 10 microlitros del anticuerpo primario apropiado a los pocillos C2 a C25, 5 microlitros de escalera biotinilada desde el tubo de PCR número 1 hasta el pocillo A1, 3 microlitros de muestra en las filas A2 a A25, y 15 microlitros de peróxido de luminol recién preparado en cada pocillo de la fila E.

Pipetear la mezcla de muestra y los reactivos en el pequeño pocillo en el orden correcto es fundamental para el éxito del experimento, por lo que debe hacerse con mucho cuidado.

Luego agregue 500 microlitros de tampón de lavado a cada pozo de tampón de lavado designado y gire el contenido de la placa por centrifugación.