Imágenes de inmunofluorescencia multiplexadas para analizar subpoblaciones de células T resistentes a la inmunoterapia

Tome una criosección de tejido de carcinoma de células renales que exhibe células T CD8+ infiltrantes en su microambiente tumoral.

Trátelo con acetona para fijar y permeabilizar el tejido. Lavar para eliminar el exceso de acetona.

Agregue avidina para saturar la biotina del tejido endógeno. A continuación, agregue biotina para bloquear los sitios de unión de avidina inmovilizados, minimizando las interacciones no específicas.

Aplicar suero que contenga inmunoglobulinas para bloquear los receptores Fc de las células inmunitarias, evitando la unión inespecífica de anticuerpos.

Agregue un cóctel de anticuerpos primarios dirigido a CD8, un marcador de células T citotóxicas, y PD-1 y Tim-3, receptores inhibidores expresados por subpoblaciones de células T CD8+ resistentes a la inmunoterapia.

Introducir distintos anticuerpos secundarios marcados con fluoróforo dirigidos a anticuerpos anti-CD8 y anti-Tim-3.

Agregue anticuerpos secundarios biotinilados dirigidos a anticuerpos anti-PD-1 y una estreptavidina marcada con fluoróforo diferente que se une a la biotina.

Aplique un medio de montaje que contenga colorante para teñir los núcleos celulares y coloque un cubreobjetos.

Adquiera imágenes de fluorescencia multiespectral para identificar las células T CD8+ que infiltran tumores y las subpoblaciones resistentes a la inmunoterapia que expresan PD-1, Tim-3 o ambas.

Después de descongelar, use una toalla de papel para secar cuidadosamente los portaobjetos alrededor de las secciones de tejido y rodee los tejidos con un bolígrafo de barrera hidrofóbico. Cuando la barrera se haya secado, fije las muestras en acetona al 100% durante 5 minutos, seguido de 2 minutos de secado al aire. Luego, lave los portaobjetos en TBS durante 10 minutos.

Trate previamente los portaobjetos con tres gotas de avidina al 0,1% durante 10 minutos en la oscuridad. Luego, toque o mueva los portaobjetos para cubrir el tejido con la solución de avidina. Agregue tres gotas de biotina al 0,01% a cada muestra y toque o mueva la biotina a través de las muestras, seguido de un lavado TBS, como se acaba de demostrar. Luego, bloquee cualquier unión inespecífica con 100 microlitros de suero normal al 5% en TBS durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Al final de la incubación, golpee los portaobjetos para eliminar el exceso de suero e incube los portaobjetos en 100 microlitros del cóctel de anticuerpos primarios de interés durante 1 hora en una cámara humidificada. Lave los portaobjetos marcados con anticuerpos en TBST durante 5 minutos.

Después del secado, etiquete las células con 100 microlitros del cóctel de anticuerpos secundarios de interés durante 30 minutos en la cámara humidificada, seguido de un lavado de 10 minutos en TBS. Incube los portaobjetos marcados con anticuerpos secundarios secos con 100 microlitros del cóctel de anticuerpos terciarios de interés durante 30 minutos, seguido de un lavado final de TBS de 10 minutos.

Al final del lavado, seque los portaobjetos y monte los pañuelos con el medio de montaje suplementado con DAPI. Luego, cubra cada portaobjetos con un cubreobjetos y deje que el medio de montaje se asiente durante al menos 2 horas.

Para escanear los portaobjetos, abra el software del microscopio y cargue el protocolo de escaneo de imágenes. Cargue el primer portaobjetos en la platina del microscopio. Luego, en la barra de control, haga clic en Establecer exposición y ajuste el tiempo de exposición para cada filtro hasta obtener una señal suficiente pero no saturada.

Haga clic en Inicio en el panel superior y abra la carpeta de ID de laboratorio. Introduzca el ID de la primera diapositiva y haga clic en Siguiente.

Para obtener la descripción general del portaobjetos bajo luz de campo brillante con un aumento de 4x, haga clic en Imágenes monocromáticas y Buscar muestra. Para seleccionar el área de tejido que se va a escanear, presione la tecla Control y use el cursor para seleccionar o anular la selección de las regiones de interés que se escanearán con el aumento de 4x.

Para obtener una imagen fluorescente roja-azul-verde de cada región, haga clic en Imágenes de baja potencia. Para la selección de campos de alta potencia, presione la tecla Control y seleccione al menos cinco regiones de interés que correspondan a las áreas del tejido que se escanearán con un aumento de 20x.

A continuación, para obtener una adquisición de imagen multiespectral de cada campo, haga clic en Imágenes de alta potencia y haga clic en Almacenamiento de datos para almacenar las imágenes en la carpeta de ID de laboratorio adecuada.