Una técnica de inmunofluorescencia para la localización de proteínas virales en células infectadas

Comience con un portaobjetos que contenga células huésped adheridas.

Agregue virus y déjelos ingresar a las células huésped.

Retire el medio gastado. Agregue medio fresco para permitir la síntesis y el transporte de proteínas virales.

Use paraformaldehído para preservar la morfología celular y la ubicación de las proteínas.

Agregue moléculas de detergente para hacer que las células sean permeables.

Aplique un búfer de bloqueo para bloquear sitios de enlace que no sean de destino.

Agregue anticuerpos primarios que se unan a las proteínas virales objetivo. Eliminar los anticuerpos no unidos.

Superposición con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo rojo para marcar fluorescentemente las proteínas virales. Eliminar los anticuerpos no unidos.

Agregue un medio de montaje que contenga un tinte nuclear fluorescente para teñir los núcleos.

Usando microscopía confocal, observe la ubicación de las proteínas virales fluorescentes rojas y los núcleos del huésped fluorescentes azules.

Una señal roja más fuerte alrededor del área azul indica localización citoplasmática, mientras que una señal más fuerte en el interior sugiere localización nuclear.

Los niveles de señal iguales en y alrededor del área azul indican que las proteínas se encuentran tanto en el núcleo como en el citoplasma.

De 20 a 24 horas antes de la infección por el virus, siembre 5 x 10⁴ células de fibroblastos HEL o pulmón embrionario humano por pocillo en un portaobjetos escalonado de 4 pocillos y 11 milímetros en medio de crecimiento para incubación nocturna a 37 grados Celsius, con 5% de dióxido de carbono.

Es importante balancear bien el portaobjetos para asegurar una distribución uniforme de las células y tener cuidado de evitar derramar el medio de cultivo. Al día siguiente, reemplace los sobrenadantes de los cultivos confluentes del 70% al 80% con Medium-199 que contiene de 4 a 10 unidades formadoras de placa por celda, y coloque el portaobjetos a 37 grados Celsius agitando durante 1 hora.

Al final de la incubación, reemplace los sobrenadantes con medio de crecimiento fresco y devuelva las células a la incubadora para el período de infección experimental apropiado. Para la tinción de inmunofluorescencia de las células infectadas por el virus, lave rápidamente las células tres veces con PBS, seguido de una incubación de 8 a 10 minutos en 200 microlitros de paraformaldehído al 4% en PBS por pocillo. Al final de la fijación, lavar las células tres veces con 200 microlitros de PBS por lavado y permeabilizar las células con 100 microlitros de tensioactivo no iónico al 0,2% por pocillo durante 5 a 10 minutos.

Lave las células permeabilizadas tres veces en PBS como se demuestra, y agregue 200 microlitros de tampón de bloqueo a cada pocillo para una incubación de 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, agregue la concentración adecuada del anticuerpo primario de interés a cada pocillo para una incubación a temperatura ambiente de 2 horas.

Al final de la incubación, retire cualquier anticuerpo primario no unido con tres lavados de 10 minutos en tampón de bloqueo nuevo y agregue un anticuerpo secundario apropiado a cada pocillo para una incubación de 1 hora a temperatura ambiente, protegido de la luz.

Al final de la incubación, lave las células tres veces en un tampón de bloqueo como se demuestra, seguido de un lavado en PBS, y agregue una gota de medio de montaje antidecoloración, complementado con DAPI a cada pocillo. Luego coloque un cubreobjetos sobre el portaobjetos y selle el cubreobjetos con esmalte de uñas transparente.

Aplicar una presión suave mientras se monta el cubreobjetos eliminará cualquier exceso de medio de montaje, lo que ayudará a garantizar la adquisición de imágenes de alta calidad.

Para analizar la distribución nuclear y citoplasmática de ICP0, abra el proyecto en el software de aplicación confocal y seleccione una imagen. Abra la pestaña Cantidad y seleccione Ordenar regiones de interés en el menú Herramientas. Seleccione Dibujar línea y dibuje una línea longitudinal a través de la celda que se va a analizar. Aparecerá un histograma que muestra la intensidad de fluorescencia a lo largo de la línea tanto para la proteína de interés como para DAPI.

Con base en la tinción de fondo, establezca un umbral constante para la intensidad de la proteína de interés para el análisis de la distribución subcelular de la proteína en cada experimento. Si la señal de la proteína, en promedio, está por debajo del umbral en la región nuclear, pero está por encima del umbral más allá del límite DAPI, clasifique la señal de la proteína como predominantemente ubicada dentro del citoplasma.

Si la señal de la proteína está por encima del umbral en todo el núcleo y más allá del límite de la señal DAPI, agrupe la señal de la proteína como un núcleo más localización citoplasmática. Si la señal de la proteína está por encima del umbral en el núcleo, pero en promedio está por debajo del umbral fuera del límite de la señal DAPI, agrupe la señal de la proteína como una localización nuclear.