Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 3:06 min. • December 23rd, 2025
Comience con una suspensión fúngica de Cryptococcus. Agregue una solución de biopartículas derivadas de hongos conjugadas con un tinte fluorescente sensible al pH para teñir las células de Cryptococcus.
Lavar para eliminar el tinte no unido. Transfiera la suspensión fúngica teñida a una placa de varios pocillos con macrófagos adheridos, o células inmunitarias fagocíticas.
Introducir la concentración inhibitoria mínima de un fármaco, como aspirina o ibuprofeno, e incubar para facilitar la absorción del fármaco.
Las moléculas del fármaco interactúan con la ciclooxigenasa-2, una enzima sintetizadora de prostaglandinas, inhibiendo su actividad.
Esto evita la conversión del ácido araquidónico en prostaglandina, preservando los niveles de AMPc intracelular y potenciando la capacidad fagocítica de los macrófagos, facilitando la internalización de los hongos.
El fagosoma que contiene hongos se fusiona con el lisosoma, un orgánulo ácido, formando un fagolisosoma con un pH ácido y permitiendo que el tinte sea fluorescente.
Las células tratadas con fármacos exhiben una fluorescencia más alta que las células no tratadas, lo que sugiere la eficacia del fármaco para mejorar la capacidad fagocítica de los macrófagos.
Comience con un cultivo de la línea celular de macrófagos murinos, cultivada en medio RPMI 1640 completo, como se describe en el protocolo de texto.
Además, prepare un cultivo de Cryptococcus neoformans resuspendido en PBS a la concentración deseada, como se menciona en el protocolo de texto.
Para teñir las células criptocócicas con la tinción de fagocitosis, dispense 999 microlitros de las células en un tubo de microcentrífuga. Agrega 1 microlitro del tinte al tubo. Incube las células durante 1 hora a temperatura ambiente, en la oscuridad, con agitación lenta.
Después de la incubación, lave las células mediante una primera centrifugación. Luego, deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender las células con PBS y repita el paso de lavado dos veces más.
Dispense 100 microlitros de la suspensión celular de Cryptococcus neoformans en los pocillos de la placa de 96 pocillos que contiene los macrófagos cultivados.
Para estudiar el efecto de los fármacos de prueba sobre la fagocitosis de macrófagos, dispense 100 microlitros del fármaco de prueba deseado en los pocillos apropiados de la placa de 96 pocillos como se describe en el protocolo de texto.
Incube la placa en una incubadora de dióxido de carbono durante 2 a 6 horas. Al final de la incubación, mida la fluorescencia de la tinción fagocítica.