Un procedimiento de punta STAGE para la desalinización y purificación de péptidos

Tome una extracción STop And Go o STAGE Tip, una columna de purificación miniaturizada.

La punta contiene pequeñas perlas de sílice unidas a largas cadenas de hidrocarburos para la purificación de péptidos basada en la interacción hidrofóbica.

Lavar con tampones que contengan un alto porcentaje de acetonitrilo, eliminando las impurezas de la resina.

Introduzca un tampón de unión y centrífuga, equilibrando la columna para una unión óptima de péptidos.

Cargue una muestra de péptidos predigeridos obtenida de células diferenciadas similares a neutrófilos, que contienen fragmentos de péptidos e impurezas, incluidas las sales.

Centrifugar para pasar la muestra a través de la columna. Los fragmentos peptídicos se unen a las cadenas de hidrocarburos a través de interacciones hidrofóbicas, mientras que las sales se eliminan.

Agregue el tampón aglutinante y centrifuge, eliminando las impurezas restantes.

Introducir el tampón con alto contenido de acetonitrilo para la elución.

Con una jeringa, pase el tampón a través de la columna. El acetonitrilo se une a las cadenas de hidrocarburos, desplazando los fragmentos de péptidos que eluyen con el tampón.

Realice perfiles proteómicos para identificar los péptidos purificados.

Para comenzar, empaque tres capas de resina C18 en una punta de pipeta de 200 microlitros para construir una punta STop And Go Extraction o STAGE para cada muestra de péptido.

Detenga la digestión enzimática de las muestras de péptidos previamente incubadas agregando 1 por 10 volúmenes de solución de parada. Centrifugar las muestras a 13.200 rpm durante 10 minutos y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 2 mililitros.

A continuación, lave las puntas STAGE con 100 microlitros de acetonitrilo 100 por ciento y centrifugue las puntas STAGE a 1000 g durante 2 minutos o hasta que todo el líquido pase a través de la resina C18.

Repita los lavados de puntas STAGE con 50 microlitros de tampón B seguidos de 200 microlitros de tampón A con las mismas condiciones de centrifugación.

Cargue las muestras en las puntas STAGE para centrifugar a 1000 g durante 3 a 5 minutos. A continuación, lavar las puntas STAGE con 200 microlitros de Buffer A centrifugando a 1000 g durante 3 a 5 minutos.

A continuación, agregue 50 microlitros de tampón B en cada punta STAGE y, con una jeringa, eluya las muestras que contienen tampón B en un tubo de PCR de 0,2 mililitros.

Una vez eluidas las muestras, seque los péptidos con una centrífuga al vacío durante 45 minutos. Ejecute las muestras en espectrometría de masas de alta resolución con las condiciones descritas en el manuscrito de texto.

Para procesar los datos para el perfil proteómico, cargue los archivos de datos sin procesar obtenidos de la espectrometría de masas en el software MaxQuant. Consulte el manuscrito del texto para conocer todos los parámetros del software y sus ajustes.

En parámetros globales, importe el archivo FASTA de Homo sapiens para la identificación de secuencias descargado de la base de datos Uniprot registrando la identificación del organismo, el número de proteínas y la fecha de descarga del archivo.

Establezca el número de núcleos de equipo para el procesamiento y seleccione Iniciar. Al finalizar MaxQuant, se genera una carpeta 'Combinada', junto con otros archivos necesarios para cargarlos en repositorios de datos.

Para analizar los datos, cargue el 'proteingroups.txt' en Perseus y seleccione todos los archivos de cuantificación o intensidad LFQ sin etiquetas en la ventana 'Principal'. Filtre las filas eliminando contaminantes, péptidos inversos y péptidos solo identificados por sitio y transforme los datos por log₂ (x).

Para observar el número de proteínas detectadas en cada réplica, construya un diagrama de Venn numérico y establezca anotaciones categoriales para cada muestra proporcionando el mismo nombre para todas las réplicas de una muestra biológica.

Filtre las filas según el valor válido con la proteína identificada en más del 50 por ciento de las réplicas y dentro de al menos un grupo. Para reemplazar los valores faltantes de LFQ, realice la imputación a partir de la distribución normal.

Agregue información de anotación descargada del sitio web de Perseus a las filas de proteínas agregando txt.gz archivos FASTA en las carpetas 'bin', 'conf' y 'annotation'. Introduce términos específicos como nombres de proteínas, nombres de genes y ontología de genes.

La matriz ahora está completa y se puede visualizar en herramientas como gráficos de análisis de componentes principales, mapas de calor y enriquecimiento de categorías. Realice pruebas estadísticas para determinar cambios significativos en la abundancia de proteínas entre las condiciones probadas.