Evaluación de anticuerpos neutralizantes funcionales contra el SARS-CoV-2

Comience con suero humano diluido en serie que contenga concentraciones variables de anticuerpos neutralizantes contra el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo o el SARS-CoV-2.

Introducir virus pseudotipados con ARN luciferasa, integrasa y transcriptasa inversa, encapsulados dentro de una bicapa lipídica que contiene proteínas de pico del SARS-CoV-2.

Los anticuerpos neutralizan los virus en función de la dilución sérica, y las diluciones más bajas exhiben la máxima neutralización.

Introducir células diana que expresen receptores de enzima convertidora de angiotensina-2 o receptores ACE2 y proteasa transmembrana serina-2 o TMPRSS2.

En diluciones séricas más altas, los virus no neutralizados interactúan con los receptores ACE2, mientras que TMPRSS2 escinde la proteína de pico, lo que permite la fusión del virus.

Al ingresar, el ARN de luciferasa se transcribe de forma inversa al ADN que se integra en el genoma del huésped y produce la enzima luciferasa.

Reemplace el medio con un tampón de ensayo que contenga sustrato de luciferasa y un agente lisante.

Las células se lisan, liberando luciferasa intracelular, que interactúa con el sustrato y produce una alta luminiscencia.

Cuantifique la luminiscencia a través de las diluciones séricas para determinar el porcentaje de neutralización viral: la dilución que logra una neutralización del cincuenta por ciento representa el título de neutralización.

Para comenzar, agregue 50 microlitros de DMEM con 10 por ciento de FBS y 1 por ciento de penicilina-estreptomicina a las filas B a H, columnas 1 a 12 de una placa blanca de 96 pocillos.

Agregue 5 microlitros de sueros convalecientes en pocillos de la fila A, columnas 2 a 10, en un volumen total de 100 microlitros de DMEM con 10 por ciento de FBS y 1 por ciento de penicilina-estreptomicina. Agregue 5 microlitros de antisueros positivos y negativos en los pocillos A11 y A12 como controles.

Retire 50 microlitros de la solución de los pocillos de la fila A y realice diluciones en serie dobles de todos los pocillos debajo de ella. Para cada dilución, utilice una pipeta multicanal para mezclar las soluciones de 5 a 10 veces pipeteando hacia arriba y hacia abajo sin crear burbujas de aire.

Después de completar la dilución en serie, deseche los últimos 50 microlitros del último pocillo de cada columna.

Centrifugue la placa durante 1 minuto a 500 rotaciones por minuto para asegurarse de que no quede líquido en las paredes del pozo. Calcule la cantidad de DMEM necesaria para diluir el SARS-CoV-2 PV como se describe en el manuscrito del texto.

Mezcle la solución fotovoltaica diluida en un recipiente de pipeta y alícuota 50 microlitros en cada pocillo, excepto los pocillos A6 a A12 que comprenden el control solo de celda. Los pozos A1 a A6 sirven como control solo fotovoltaico.

Centrifugar la placa durante 1 minuto a 500 rotaciones por minuto para asegurarse de que no quede ningún virus en las paredes del pozo. Luego, incube las placas a 37 grados Celsius con un 5 por ciento de dióxido de carbono durante 1 hora para permitir que el suero se una con la glicoproteína del SARS-CoV-2.

A continuación, prepare una placa de células diana HEK 293T / 17 transfectadas 24 horas antes con ACE2 y plásmidos TMPRSS2. Retire el medio de cultivo de la placa y lávelo dos veces con 2 mililitros de PBS, agregándolo a un lado de la placa para evitar el desprendimiento de células.

Deseche el PBS y agregue 2 mililitros de tripsina al plato. Coloque la placa en una incubadora hasta que se desprendan las células.

Después de que las células se hayan desprendido, agregue 6 mililitros de DMEM con 10 por ciento de FBS y 1 por ciento de penicilina-estreptomicina a la placa para apagar la actividad de tripsina y resuspender las células suavemente.

Cuente las células utilizando un contador de células automatizado o contando el portaobjetos de la cámara. Agregue 1 x 10 4 celdas alícuotas en un volumen total de 50 microlitros a cada pocillo e incube la placa a 37 grados Celsius con 5 por ciento de dióxido de carbono durante 48 a 72 horas.

Después de la incubación, retire los medios de cultivo de todos los pocillos y agregue 25 microlitros de una mezcla 1:1 de PBS y un reactivo comercial de ensayo de luciferasa. Lea la placa utilizando un sistema comercial de ensayo de luciferasa con un luminómetro de microplacas.

Utilizando los datos brutos generados por el luminómetro, calcule los títulos de anticuerpos neutralizantes IC50 como se describe en el manuscrito del texto.