La lesión del nervio Salvados (SNI) Modelo de alodinia mecánica inducida en ratones

El objetivo general de este procedimiento es establecer un modelo murino de dolor neuropático tras un daño nervioso periférico. Esto se logra primero anestesiando al ratón, colocando la pata trasera en la posición adecuada y exponiendo el nervio ciático. A continuación, se induce una lesión nerviosa definida mediante la sutura de dos ramas del nervio ciático, dejando la tercera rama intacta.

En este video, los nervios tibial y peroneo común se suturan y cortan, mientras que el nervio sural se conserva. Sin embargo, se pueden aplicar otras combinaciones tras una lesión nerviosa. La rata se coloca en un recipiente cilíndrico sobre una mesa de malla metálica y se le permite habituarse; luego se evalúa mediante el ensayo de Von Frey, que permite una medición cuantitativa de la alodinia mecánica inducida.

Los filamentos Von Frey calibrados se aplican en orden ascendente sobre la zona lateral del poro intervenido. Con el fin de detectar el umbral mecánico en la extremidad trasera intervenida frente a la no intervenida, se define una respuesta dolorosa como la retirada rápida del poro, espasmos y/o lamido del poro tras la estimulación con el filamento. En última instancia, el desarrollo de alodinia mecánica en la pata intervenida en comparación con el lado no intervenido puede visualizarse mediante la representación gráfica del umbral mecánico a lo largo del tiempo, lo que permite investigar diversas vías moleculares o tratamientos farmacológicos tras una lesión del nervio periférico.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la lesión del nervio periférico, como las vías moleculares implicadas en el desarrollo del dolor neuropático. Además, también se pueden probar fármacos destinados a impedir el desarrollo del dolor o a aliviar los síntomas del dolor. Dos días antes de la cirugía, coloque a los ratones en cilindros de plástico de color rojo colocados sobre una mesa de malla metálica en una habitación tranquila; habitúe a los ratones en los cilindros durante 15 minutos antes de la prueba. Tras 15 minutos, verifique que los ratones estén tranquilos y luego aplique filamentos von Frey en orden ascendente, comenzando con el filamento de 0,02 gramos. Aplique primero la fuerza en la zona lateral del poro izquierdo cinco veces durante un período total de 30 segundos, y evalúe la reacción del ratón tras cada aplicación. Repita con el mismo filamento y el poro izquierdo del otro ratón, y luego comience de nuevo con el poro derecho antes de pasar al siguiente filamento.

Se define una reacción positiva al dolor como la retirada repentina del poro, la separación de los dedos de los pies y/o el lamido excesivo del poro inducidos por el filamento, y se define el umbral del dolor como la respuesta positiva en tres de cinco estímulos repetitivos. Anestesiar a los animales mediante inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina y xilacina y colocar a los animales en un lugar tranquilo hasta que estén completamente anestesiados. Verificar los reflejos pellizcando la punta de la cola y la almohadilla con un par de pinzas, asegurándose de que los animales no respondan antes de continuar.

A continuación, inyecte subcutáneamente 0.5 mililitros de solución salina isotónica con antibióticos para evitar la deshidratación y prevenir infecciones; utilizando una afeitadora eléctrica, afeite el campo operatorio desde ligeramente por debajo de la rodilla hasta la zona de la cadera para diestros. Las personas que trabajen con la extremidad trasera izquierda pueden encontrar más conveniente este procedimiento. Aplique pomada en los ojos con un aplicador de algodón.

Coloque el animal sobre su lado derecho y coloque la extremidad trasera izquierda sobre una pequeña plataforma para mantenerla elevada y asegure la pata con cinta adhesiva. Una vez que el animal esté posicionado, desinfecte el campo operatorio con fricciones alternadas de etanol y Betadine, comenzando desde el sitio quirúrgico hacia afuera, y deje secar. Localice la rodilla con el pulgar de su mano izquierda y use un escalpelo para realizar una pequeña incisión en dirección longitudinal proximal a la rodilla. Abra la piel mediante disección roma utilizando la punta de un par de tijeras.

A continuación, coloque el ratón bajo un microscopio estereoscópico y localice el vaso sanguíneo claramente visible cerca del fémur. Luego separe la capa muscular mediante disección roma. Si se realiza correctamente, las capas musculares se separarán fácilmente sin sangrado, revelando el nervio ciático justo debajo de los músculos.

Si ocurre sangrado debido a daño en un vaso sanguíneo cercano, use hisopos de algodón o trozos de gasa para absorber la sangre mediante presión hasta que el sangrado se detenga. Separe cuidadosamente las capas musculares separadas con una pinza número dos. Para visualizar el nervio ciático, aplique retractor si es necesario e identifique el área donde el nervio sural se ramifica a partir del nervio ciático.

El nervio sural es el más pequeño de los tres ramas que se ramifican hacia la derecha en la pata izquierda. En ratones C57BL/6, aplicar una sutura 6-0 firmemente alrededor de las otras dos ramas, que aún corren en paralelo, teniendo mucho cuidado de no tocar la rama sural.

Agarre los nervios que se van a cortar por debajo de la sutura con una pinza número cinco y luego corte los nervios primero por encima y luego por debajo de la pinza con una pequeña tijera para evitar tirar de los nervios. Una vez que se hayan cortado los nervios, recorte los extremos de la sutura con una tijera y luego cierre suavemente la capa muscular. Normalmente no se necesita anillo de sutura.

Agregue una gota de lidocaína en la herida y suture con nudos quirúrgicos. Verifique si la pomada ocular sigue siendo suficiente, luego coloque al ratón en una jaula limpia con una toalla de papel. En una postura cómoda, proporcione agua y alimento de fácil acceso.

Si la habitación está fría, coloque una almohadilla térmica debajo de una parte de la jaula después de un día de recuperación postoperatoria y obtenga mediciones con von Frey de ambos grupos de ratones, los operados y los sometidos a cirugía simulada (sham), tal como se describió para la recolección de las mediciones basales. Aquí se muestran los resultados de la prueba de von Frey en grupos de cuatro a seis ratones, tanto un día antes de la cirugía como diariamente durante dos semanas posteriores a la cirugía. Al día siguiente de la cirugía, los animales desarrollaron una hipersensibilidad mecánica significativa en la pata operada o ipsilateral, mientras que la pata no operada o contralateral permaneció sin cambios.

El umbral en el lado contralateral se reduce ligeramente en comparación con los ratones sometidos a cirugía simulada, lo que indica que la alodinia por IM podría ocurrir en menor grado en los ratones operados. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo localizar y manipular las ramas del nervio S en un ratón anestesiado. El ensayo de deshilachado permite además una lectura funcional cuantitativa para evaluar la respuesta de animales transgénicos o de fármacos tras una lesión parcial del nervio periférico.