Medición de los niveles de inmunoglobulina G frente a una vacuna de prueba en un suero de ratón

Comience con una placa de pocillos múltiples recubierta con una vacuna de prueba y bloquee los sitios de interacción no específicos.

Adquiera una muestra de suero de un ratón inyectado con la vacuna de prueba.

Este suero contiene anticuerpos de inmunoglobulina G, o IgG, que reconocen la vacuna de prueba.

A los pocillos recubiertos de vacunas, agregue muestras de suero diluidas en serie.

Las IgG se unen a la vacuna. Lavar para eliminar los anticuerpos no unidos.

Agregue anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa que se unan a las IgG. Eliminar los anticuerpos secundarios no unidos.

Añadir un sustrato cromogénico. La peroxidasa interactúa con el sustrato, generando un producto de color azul.

Introduce un ácido para detener la reacción. El cambio en el pH hace que la solución se vuelva amarilla.

Con un espectrofotómetro, mida la intensidad del color de cada pocillo para determinar la concentración de IgG en la muestra de suero.

Para el recubrimiento de antígenos del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, o placa ELISA, diluya el antígeno de la proteína HI a 10 microgramos por mililitro con una solución de recubrimiento y agregue 100 microlitros del antígeno diluido por pocillo en la placa ELISA. Incube el plato a 4 grados centígrados durante la noche. Después de la incubación, lave la placa con 300 microlitros de PBST por pocillo.

Selle los pocillos con 300 microlitros de la solución de sellado por pocillo durante dos horas a 37 grados centígrados. Luego, diluya tres microlitros de suero de ratones de cada grupo experimental 100 veces agregando 297 microlitros de PBST y divida el suero diluido en vórtices. Agregue 100 microlitros de suero diluido por pocillo en la placa ELISA recubierta para cada muestra de suero. Del mismo modo, diluya los sueros de control positivo y negativo 100 veces con PBST, agregando 4 microlitros de suero de control positivo o negativo a 396 microlitros de PBST seguido de una mezcla de vórtice.

Para realizar una dilución de doble relación, agregue 200 microlitros del suero experimental previamente diluido a la primera fila de la placa ELISA recubierta. Luego, agregue 100 microlitros de PBST a todos los pocillos, excepto los de las filas uno y 12. A continuación, ajuste la pistola pipeta a 100 microlitros y transfiera 100 microlitros de suero de la primera fila a la segunda fila que contiene PBST.

Mezcle el contenido de la segunda fila 10 veces, usando la pistola pipeta. Del mismo modo, realice diluciones sucesivas 1:2 del suero hasta la fila 11. Una vez hecho esto, deseche 100 microlitros de líquido de la fila 11.

Agregue 100 microlitros de suero negativo y positivo diluido a cada pocillo correspondiente en la fila 12, siguiendo la plantilla de muestra. Selle la placa ELISA con una envoltura de plástico e incube a 37 grados centígrados durante una hora. Mientras tanto, diluya el anticuerpo secundario anti-ratón IgG HRP 10,000 veces agregando PBST. Después de la incubación de una hora, lave la placa ELISA con 300 microlitros de PBST por pocillo para limpiar los anticuerpos no unidos. Luego agregue 100 microlitros del anticuerpo secundario diluido a cada pocillo e incube la placa a 37 grados centígrados durante 40 minutos.

Lave la placa con 300 microlitros de PBST, por pozo. Luego agregue 100 microlitros de solución de desarrollo de color TMB a cada pocillo. Coloque los platos a 37 grados centígrados y lejos de la luz durante 10 minutos. Después de lo cual, termine la reacción inmediatamente con 50 microlitros de ácido sulfúrico molar 2. Detecte la densidad óptica o los valores de OD a 450 nanómetros, utilizando un marcador enzimático dentro de los 15 minutos posteriores a la terminación.