JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
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Comience con células de mamíferos infectadas por virus que producen múltiples caspasas, incluida la caspasa-3.
Agregue un medio de crecimiento al pocillo de control y un medio suplementado con inhibidor de caspasa-3 al pocillo de prueba.
En el pozo de control, la caspasa-3 reconoce y degrada las nucleoproteínas virales y las proteínas del huésped esenciales para la propagación viral.
En el pozo de prueba, el inhibidor ingresa a la célula, inhibiendo la actividad de la caspasa-3 y evitando la degradación de la proteína.
Desaloje las células de la placa. Agregue un reactivo de lisis y caliente para inducir la lisis celular, liberando proteínas intracelulares.
Cargue ambas muestras en un gel de poliacrilamida SDS y electroforesa para separar las proteínas según el tamaño.
Después de la electroforesis, transfiera el gel a una membrana secante.
Tratar la membrana con anticuerpos primarios contra las nucleoproteínas virales y las proteínas del huésped.
Lavar y recubrir con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos que se unen a anticuerpos primarios, generando bandas fluorescentes.
La mayor fluorescencia en la muestra de prueba indica una reducción de la escisión de la proteína viral y del huésped mediada por caspasa-3 en comparación con el control.
Para comenzar, siembre células MDCK o A549 en una placa de cultivo celular de 12 pocillos, incube las células durante la noche a 37 grados Celsius bajo una atmósfera de dióxido de carbono al 5%. Al día siguiente, retire el medio de cultivo viejo de las células y lave las células en cada pocillo dos veces con 1 mililitro de MEM sin suero.
Luego infecte las células agregando 400 microlitros de inóculo del virus de la influenza A y coloque la placa para incubación durante una hora. Después de la incubación, retire el inóculo del virus y lave las células con MEM. Agregue 1 mililitro de MEM sin suero a cada pocillo e incube las células como se muestra en el paso anterior.
Después de 24 horas, recolecte las células raspándolas con un émbolo de jeringa de 1 mililitro y transfiéralas a un tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar el tubo a 12.000 g durante dos minutos a temperatura ambiente, y recoger el sobrenadante. Lave el sedimento celular con 250 microlitros de solución salina tamponada con fosfato y centrifugue. Retire el sobrenadante y agregue 100 microlitros de tampón de lisis celular. Mezcla por vórtice.
Caliente el tubo a 98 grados centígrados durante 10 minutos para lisar completamente las células. Luego, resuelva cantidades iguales de proteína de muestras infectadas y no infectadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS estándar. Después de la electroforesis, transfiera el gel de proteína a una membrana de nitrocelulosa o PVDF y realice western blot. Compare los niveles de proteína en las líneas de muestra infectadas tratadas con simulacros y tratadas con inhibidores.