Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 4:02 min. • July 8th, 2025
Tome tubos de ensayo que contengan muestras bacterianas.
En la muestra de prueba, agregue moléculas inhibidoras para bloquear la bomba de salida de antibióticos de las bacterias.
Centrifugar y desechar el sobrenadante.
Agregue sondas de antibióticos conjugadas con fluoróforos que ingresan a las células bacterianas.
En la muestra de control, la bomba de salida extruye las sondas en el medio extracelular.
En la muestra tratada con inhibidor, la bomba de salida bloqueada no puede expulsar las sondas, lo que provoca su acumulación.
Centrifugar las muestras. Deseche el sobrenadante que contiene sondas extracelulares.
Agregue tampón de lisis seguido de lisozima para debilitar la pared celular bacteriana.
Realice ciclos de congelación y descongelación, sonicación y exposición a altas temperaturas para lisar las células.
centrífuga. Transfiera el sobrenadante a una membrana filtrante.
Lave y recoja el filtrado que contiene las sondas.
Mida la intensidad de fluorescencia del filtrado.
Una mayor intensidad de fluorescencia en las muestras bacterianas tratadas con inhibidores sugiere una pérdida de la función de salida, lo que lleva a la acumulación de sondas intracelulares.
Para el análisis de acumulación de sonda, raye las existencias de glicerol de las cepas bacterianas en placas de agar LB para una incubación nocturna a 37 grados Celsius. A la mañana siguiente, elija una sola colonia del plato para cultivar durante la noche en caldo de lisogenia a 37 grados centígrados. A la mañana siguiente, diluya el cultivo durante la noche aproximadamente 50 veces en medio fresco.
Cuando el cultivo alcance la fase logarítmica media, granular las bacterias por centrifugación y decantar el medio. Vuelva a suspender las bacterias en 1 mililitro de PBS y centrifugue las bacterias nuevamente. Decantar el sobrenadante y volver a suspender el gránulo lavado en PBS a una densidad óptica de 600 nanómetros de dos.
Agregue 10,1 microlitros de CCCP de 10 milimolares en PBS a 1 mililitro de bacterias e incube las bacterias a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Al final de la incubación, recolecte las bacterias por centrifugación y vuelva a suspender el gránulo en 1 mililitro de solución antibiótica fluorescente micromolar de 10 a 100 en PBS.
Después de una incubación de 30 minutos a 37 grados centígrados, lave las células por centrifugación cuatro veces en 1 mililitro de PBS frío por lavado. Después del lavado, lisar las bacterias con 180 microlitros de tampón de lisis y 70 microlitros de lisozima.
Después de 30 minutos a 37 grados Celsius, congele y descongele las bacterias tres veces a menos 78 grados Celsius durante 5 minutos y 34 grados Celsius durante 15 minutos respectivamente. Después de la última ronda de congelación y descongelación, sonique la muestra durante 20 minutos, seguida de una incubación de 30 minutos a 65 grados centígrados.
Al final de la incubación, recoger la muestra lisada por centrifugación y colar el contenido del tubo a través de una membrana filtrante de 10 kilodalton. Lave el filtro cuatro veces con 100 microlitros de agua por lavado y alícuota cada lavado en pocillos individuales de una placa negra de fondo plano de 96 pocillos. Luego mida la intensidad de fluorescencia en un lector de placas con longitudes de onda de excitación y emisión apropiadas para el fluoróforo.