Imágenes en vivo de los axones de la raíz dorsal después de rizotomía

El objetivo general de este procedimiento es investigar la regeneración de la raíz dorsal con el fin de descubrir un medio para inducir una regeneración significativa después de lesiones de la raíz espinal. Esto se logra creando primero una hemilaminectomía espinal que expone la raíz dorsal L cinco derecha y permite la visualización de axones positivos marcados con YFP en la médula espinal y la raíz dorsal. A continuación, la raíz dorsal L five se tritura cuidadosamente para asegurar un sangrado mínimo.

A continuación, se obtienen imágenes del sitio de trituración después de la trituración para verificar la posición de la raíz dorsal lesionada en la lesión. En el transcurso de varios puntos de tiempo, se obtienen imágenes del sitio de la lesión y la zona de entrada de la raíz dorsal para determinar la capacidad de los axones dañados para regenerarse en la médula espinal. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran que los axones en regeneración se inmovilizan rápidamente y permanecen estacionarios cuando ingresan a la zona de entrada de la raíz dorsal o DREZ.

La principal ventaja de esta técnica sobre las técnicas existentes, como la obtención de imágenes en un animal muerto, es que podemos obtener imágenes de este sistema en un animal vivo repetidamente durante un período de semanas o incluso meses. Primero coloque una almohadilla térmica controlada termostáticamente debajo de un microscopio estereoscópico fluorescente y ajuste la salida a 32,5 grados Celsius en una almohadilla térmica, ajustada a 32,5 grados Celsius precaliente la solución estéril del timbre a 32,5 grados Celsius para la irrigación de la médula espinal Durante la cirugía, anestesiar al animal con una inyección intraperitoneal de un cóctel de xilacina y ketamina. También se administra una dosis inicial del analgésico buprenorfina por vía subcutánea.

Un nivel adecuado de anestesia se logra cuando el reflejo palpable está ausente y el animal no responde a un pellizco en el dedo del pie. Una vez que se haya confirmado la anestesia, afeite la parte superior de la espalda con cortaúñas para animales pequeños y extienda una pequeña gota de loción depilatoria sobre el área afeitada con hisopos con punta de algodón. Minutos después, retira la loción aplicada y el resto de pelo con agua jabonosa.

Por último, utilizar esponjas de gasa empapadas en etanol al 70% para limpiar completamente el campo quirúrgico. Coloque al animal sobre la almohadilla térmica y desinfecte la piel con hisopos empapados en etanol al 70%. Sin embargo, se debe aplicar un paño quirúrgico estéril con fines de demostración.

No se muestra en este video. Bajo la iluminación de campo claro del microscopio estereoscópico, haga una incisión de dos a tres centímetros en la línea media de la piel de la espalda. Si es necesario, use hisopos con punta de algodón para detener el sangrado.

Refleja la musculatura espinal con pinzas finas y mandíbulas óseas. Para exponer las vértebras lumbares subyacentes. Exponga los segmentos espinales L tres a S uno mediante hemilaminectomía del lado derecho utilizando jurados r pequeños y luego perfunda la cavidad con una solución de timbre estéril tibia.

Coloque al animal sobre un cojín de apoyo hecho de gasa de algodón enrollada. Para aplanar la columna vertebral. Use ganchos de retracción para ensanchar el área expuesta.

En este punto, aproximadamente 30 minutos después de la primera inyección de anestésico, se debe inyectar un suplemento para mantener al animal completamente anestesiado. Cambie a la excitación fluorescente para visualizar por qué FP marcó los axones. Con la punta de una aguja de calibre 27 y medio, realice una pequeña incisión en la duramadre que recubre la raíz dorsal L cinco, perfunde repetidamente con solución de timbre y limpie suavemente con hisopos con punta de algodón.

Identifique el sitio a triturar y capture imágenes de toda el área expuesta sin daños. Esto ayudará a identificar el sitio de la lesión en sesiones de imágenes posteriores. A continuación, inserte un lado de un par de pinzas finas.

Cierre debidamente las pinzas con suavidad pero con firmeza, sujetando la porción medial de la raíz L five durante 10 segundos y, a continuación, suelte suavemente las pinzas. Lavar repetidamente con solución fisiológica y limpiar suavemente con bastoncillos con punta de algodón. Obtenga múltiples imágenes de toda el área expuesta, incluido el sitio de trituración y el DREZ antes y justo después de la trituración con aumentos bajos y altos.

Después de obtener imágenes ajustadas, aplique un trozo de membrana de matriz sintética delgada seguida de duramadre artificial sobre la médula espinal expuesta, de modo que encajen con precisión en la ventana de la médula espinal expuesta. Cierre la musculatura con suturas estériles de cinco oh, y cierre la incisión de la línea media con pinzas para heridas. Inyectar soluciones de ringer por vía subcutánea y administrar buprenorfina como analgesia postoperatoria mediante inyección intramuscular cada 12 horas durante dos días.

Anestesiar al animal con xilacina y ketamina como se ha descrito anteriormente, y retirar las pinzas y suturas de la herida. Retire los parches de duramadre artificial y membrana de matriz sintética delgada y guárdelos en un tubo estéril que contenga solución de ringer para su posterior reutilización. A continuación, retire suavemente cualquier tejido cicatricial conectivo acumulado con la punta doblada de una aguja de calibre 26 y pinzas finas perfundiendo frecuentemente con una solución de timbre tibia.

Vuelva a exponer el campo operatorio, incluido el sitio de trituración y la zona de entrada de la raíz dorsal, y reubique los axones marcados con YFP de los que se obtuvieron imágenes en sesiones anteriores para obtener imágenes continuas sobre la regeneración. Aquí se muestran cuatro axones superficiales marcados con YFP indicados por flechas de colores inmediatamente después del aplastamiento. Tres días después del aplastamiento, los cuatro axones extienden una sola neurita que crece a través del sitio de aplastamiento, como se destaca en un dos cinco días después del aplastamiento.

Las neuritas permanecen estables y no hay crecimiento adicional de estos u otros axones proximales. Al cuarto día, las neuritas en regeneración son más delgadas y tenues que los axones preservados. Las imágenes repetidas de estos axones en sus puntas cada dos o tres días durante dos semanas más revelan que no crecieron hacia adelante ni se retrajeron, sino que permanecieron inmóviles con hinchazón de las puntas y los ejes de algunos axones.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo exponer, triturar y observar la raíz de L five para comprender mejor los mecanismos que prohíben o promueven la regeneración axonal.