Basados ​​en células de calcio de ensayo para el medio a cribado de alto rendimiento de las funciones del PRT canal utilizando FlexStation 3

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la aplicación de la Estación Flex tres para estudiar el perfil farmacológico del potencial receptor transitorio o disparo a un canal. Esto se logra preparando primero las células que expresan el viaje a uno de los canales en 96. Placas de microtitulación de pozos.

Después de lavar las células en una lavadora de microplacas, las células se cargan con el tinte fluorescente sensible al calcio. Gripe a las 4:00 a.m., un período de carga celular es seguido por varios lavados adicionales. El siguiente paso del procedimiento es preparar la placa compuesta, incluyendo un viaje, un agonista y un viaje putativo, un antagonista.

Como paso final, se configuran los parámetros del software para la lectura de placas en el sistema Flex Station tres. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran relaciones de dosis-respuesta para el viaje A uno, la activación por el ácido fonémico de la gripe y la inhibición por el compuesto antagonista A, aunque este método puede proporcionar información sobre 21 mecanismos de activación mediante la medición de la afluencia de calcio. También se puede aplicar para estudiar las funciones de otros canales oculares permeables al calcio y receptores profundos acoplados a proteínas utilizando colorantes congelados sensibles al calcio o colorantes con potencial maly.

La principal ventaja de esta táctica sobre los métodos existentes, como las imágenes de calcio y el mapeo manual de parches, es que esta técnica que ahorra tiempo proporciona un cribado de alto rendimiento para la función y la modulación de la fórmula de calcio, los canales de hierro y otros receptores movilizadores de ca. Antes del inicio de este protocolo, cultive células HEC 2 93 transfectadas de manera estable con el viaje A uno a una densidad del 70 al 90%, como se describe en el protocolo escrito. Para comenzar la preparación celular para el ensayo de calcio, cubra placas de 96 pocillos pipeteando 50 microlitros de poli L ornitina en cada pocillo, incube las placas a 37 grados centígrados durante al menos 15 minutos.

Después de la incubación, enjuague las células una vez con solución salina tamponada con fosfato de KO Después de la tripsina, las células HEC 2 93 transfieren la cantidad deseada de células a un tubo de fondo cónico estéril de 15 mililitros y una centrífuga. La muestra. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular resultante.

En el medio de cultivo DMEM, suplementado con suero fetal bovino inactivado al 10% con calor, dispense 100 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Con una pipeta multicanal, deje reposar la placa en la campana durante al menos 30 minutos antes de colocarla en la incubadora de cultivos celulares humidificados durante 20 a 44 horas. Para la preparación del ensayo de calcio, primero prepare las soluciones como se describe en el protocolo escrito.

Una vez preparado, mezcle 10 microlitros de un milimolar a las 4:00 AM con 10 microlitros de ónico. F1 27, transfiera todo el contenido a cinco mililitros de gripe. Oh tampón de cuatro ensayos suplementado con 0,1% de albúmina sérica bovina.

A continuación, lave las células cultivadas en 96. Placas de pocillos con HBSS a 80 microlitros por pocillo dos veces usando una lavadora de microplacas después del lavado, agregue la solución de carga de gripe a las 4:00 a.m. a 50 microlitros por pocillo con una pipeta multicanal e incube la placa a 37 grados Celsius durante una hora. Durante el período de carga celular de una hora, prepare una serie de tres soluciones x de agonistas, una serie de tres soluciones x de antagonista y un gran volumen de 300 agonistas micromolares en la pipeta tampón de ensayo de gripe oh cuatro veces.

300 microlitros de las soluciones de compuesto diluido en una placa de compuesto de 96 pocillos. Disponga que la dilución en serie de un compuesto y los controles positivos y negativos correspondientes estén en la misma columna de la placa de compuesto siempre que sea posible. A medida que la estación Flex tres lee una sola columna a la vez, pipetee 300 microlitros de la solución de agonista de 300 micromolares adyacente a cada pocillo que contiene el antagonista como paso final de preparación celular.

Lave las celdas cargadas tres veces con el tampón de ácido flu oh four usando la lavadora de microplacas después del último lavado. Deje 80 microlitros de tampón de ácido en cada pocillo. Para comenzar la lectura de placas, encienda el sistema Flex Station three y abra el software soft max Pro 5.2.

Guarde el experimento con un nuevo nombre de archivo en la configuración. Elija el modo flex e introduzca los parámetros para medir el efecto agonista y antagonista tal y como se indica en el procedimiento escrito. A continuación, coloque una nueva caja de puntas, la placa compuesta y la placa de lectura en las bandejas correspondientes de la estación flex. Tres.

Comience la lectura de placas haciendo clic en el botón de lectura en el software Soft Max Pro. La Flex Station tres leerá una columna a la vez y agregará compuestos en los puntos de tiempo preprogramados sin interrumpir la lectura. Una vez completada la ejecución, los datos experimentales pueden procesarse directamente utilizando el software Soft Max PRO o copiarse y pegarse en cualquier programa de hoja de cálculo como Microsoft Excel.

Para analizar los datos, genere curvas de concentración y respuesta para el viaje, un ácido fonémico agonista de la gripe, y para el viaje putativo un compuesto antagonista utilizando el ajuste de mínimos cuadrados como se describe en el procedimiento escrito del viaje. A uno es un canal catiónico permeable al calcio, cuya activación conduce a la afluencia de calcio que puede ser detectada por el colorante sensible al calcio gripe a las 4:00 AM. Se muestran trazas representativas de los cursos de tiempo de los cambios de fluorescencia en respuesta a una serie de concentraciones de ácido fonémico de la gripe o FFA a concentraciones más altas. La fluorescencia evocada por FFA aumenta con una cinética mucho más rápida que a concentraciones más bajas, a pesar de niveles máximos de fluorescencia similares.

Para distinguir estas diferencias, se construyó la relación concentración-respuesta midiendo las tasas iniciales del aumento de fluorescencia. Tras la adición de concentraciones variables de FFA, se determinó que la concentración efectiva máxima media de FFA era de 55,4 micromolares. También se muestra la relación de concentración y respuesta de la inhibición de FFA provocada por una respuesta de calcio putativa a un compuesto antagonista A.

Una dosis redujo de forma independiente la respuesta de las células del viaje A a FFA con una concentración inhibitoria máxima media de 4,3 micromolares. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar los perfiles farmacológicos de triple A uno y canales relacionados utilizando la estación de bandera tres.