Basados en células de calcio de ensayo para el medio a cribado de alto rendimiento de las funciones del PRT canal utilizando FlexStation 3
17 de agosto de 2011
Este video ofrece un protocolo detallado para estudiar el perfil farmacológico de humanos TRPA1 canales a través de FlexStation 3. El protocolo cubre los detalles de la preparación de la célula, la carga de tinte y el funcionamiento del lector de microplacas, FlexStation 3.
El objetivo general de este procedimiento es demostrar la aplicación del Flex Station tres para estudiar el perfil farmacológico del canal del receptor potencial transitorio o trip a uno. Esto se logra primero preparando células que expresan canales trip a uno en placas de microtitulación de 96 pocillos.
Después de lavar las células en un lavador de microplacas, se cargan las células con el colorante fluorescente sensible al calcio. Flu oh 4:00 AM un período de carga celular es seguido luego por varios lavados adicionales. El siguiente paso del procedimiento consiste en preparar la placa de compuestos, que incluye un agonista trip a uno y un antagonista trip a uno putativo.
Como paso final, se configuran los parámetros del software para la lectura de placas en el sistema Flex Station tres. En definitiva, se pueden obtener resultados que muestran relaciones de respuesta a la dosis para la activación de trip A uno por ácido flu fonémico, y su inhibición por el compuesto antagonista A. Aunque este método puede proporcionar información sobre los mecanismos de activación de 21 mediante la medición de la entrada de calcio, también puede aplicarse para estudiar funciones de otros canales oculares permeables al calcio y receptores acoplados a proteínas G, utilizando colorantes congelados sensibles al calcio o colorantes de potencial maly.
La principal ventaja de esta táctica frente a métodos existentes como la imagen de calcio y el mapeo manual por parche es que esta técnica ahorra tiempo y permite un cribado de alto rendimiento para evaluar la función y modulación del calcio, los canales de hierro y otros receptores movilizadores de Ca. Antes de comenzar este protocolo, cultive células HEK 293 transfectadas establemente con trip A uno hasta alcanzar una densidad del 70 al 90 %, tal como se describe en el protocolo escrito. Para iniciar la preparación celular para el ensayo de calcio, recubra placas de 96 pocillos pipeteando 50 microlitros de poli-L-ornitina en cada pocillo e incube las placas a 37 grados Celsius durante al menos 15 minutos.
Tras la incubación, enjuague las células una vez con solución salina tamponada con fosfato de KO. Después de la tripsina, transfiera la cantidad deseada de células HEC 2 93 a un tubo cónico estéril de 15 mililitros y centrifugue la muestra. Retire el sobrenadante y re suspenda el pellet celular resultante.
En el medio de cultivo DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor, distribuya 100 microlitros de la suspensión celular en cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Utilizando un pipetador multicanal, deje la placa en la cabina de flujo laminar durante al menos 30 minutos antes de colocarla en el incubador de cultivo celular humedecido durante 20 a 44 horas. Para la preparación del ensayo de calcio, primero prepare las soluciones según se describe en el protocolo escrito.
Una vez preparada, mezcle 10 microlitros de fluoh 4:00 AM de un milimolar con 10 microlitros de onic. F1 27, y transfiera todo el contenido a cinco mililitros de tampón de ensayo flu. Oh cuatro suplementado con 0,1 % de albúmina sérica bovina.
A continuación, lave las células cultivadas en placas de 96 pozos con HBSS a 80 microlitros por pozo dos veces utilizando un lavador de microplacas. Tras el lavado, agregue la solución de carga de flu oh 4:00 AM a 50 microlitros por pozo con una pipeta multicanal e incube la placa a 37 grados Celsius durante una hora. Durante el período de carga celular de una hora, prepare una serie de soluciones tres veces concentradas de agonistas, una serie de soluciones tres veces concentradas de antagonistas y un gran volumen de agonista 300 micromolar en el tampón de ensayo de flu oh cuatro.
300 microlitros de las soluciones diluidas del compuesto en una placa de compuestos de 96 pocillos. Organice de manera que la dilución en serie de un compuesto y los controles positivo y negativo correspondientes estén en la misma columna de la placa de compuestos siempre que sea posible. Como el Flex Station tres lee una sola columna a la vez, pipete 300 microlitros de la solución de agonista de 300 micromolar adyacente a cada pocillo que contiene el antagonista como paso final de preparación celular.
Lave las células cargadas tres veces con el tampón de ácido fluoroacético utilizando el lavador de microplacas después del último lavado. Deje 80 microlitros del tampón de ácido fluoroacético en cada pocillo. Para comenzar la lectura de la placa, encienda el sistema Flex Station 3 y abra el software Soft Max Pro 5.2.
Guarde el experimento con un nuevo nombre de archivo en la configuración. Seleccione el modo flex e introduzca los parámetros para medir el efecto del agonista y del antagonista según se indica en el procedimiento escrito. A continuación, coloque una caja nueva de puntas, la placa de compuestos y la placa de lectura en las bandejas correspondientes de la estación flex.Three.
Comience la lectura de la placa haciendo clic en el botón de lectura en el software Soft Max Pro. El Flex Station tres leerá una columna a la vez y agregará los compuestos en los puntos de tiempo preprogramados sin interrumpir la lectura. Una vez finalizada la corrida, los datos experimentales pueden procesarse directamente utilizando el software Soft Max PRO o copiarse y pegarse en cualquier programa de hojas de cálculo, como Microsoft Excel.
Para analizar los datos, genere curvas de respuesta frente a concentración para el trip, un agonista de ácido flufofénico, y para el compuesto putativo antagonista del trip a uno, el compuesto a, utilizando un ajuste por mínimos cuadrados como se describe en el procedimiento escrito del trip. A uno es un canal catiónico permeable al calcio cuya activación provoca una entrada de calcio que puede detectarse mediante el colorante sensible al calcio fluo-4 AM. Se muestran trazas representativas de los cursos temporales de los cambios de fluorescencia en respuesta a una serie de concentraciones de ácido flufofénico o FFA a concentraciones más altas. La FFA induce aumentos de fluorescencia con una cinética mucho más rápida que a concentraciones bajas, a pesar de niveles máximos de fluorescencia similares.
Para distinguir estas diferencias, se construyó la relación entre la concentración y la respuesta mediante la medición de las velocidades iniciales del aumento de fluorescencia. Tras la adición de concentraciones variables de FFA, se determinó que la concentración efectiva media máxima de FFA era de 55,4 micromolar. También se muestra la relación entre la concentración y la respuesta de inhibición de la respuesta de calcio inducida por FFA mediante un compuesto antagonista putativo del trip a uno, el compuesto A.
Una dosis redujo independientemente la respuesta de las células trip A one a FFA con una concentración inhibitoria máxima media de 4,3 micromolar. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar los perfiles farmacológicos de triple A one y los canales relacionados utilizando la flag station three.
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Descripción general
Este video demuestra un protocolo para estudiar el perfil farmacológico de los canales humanos TRPA1 utilizando el FlexStation 3. El procedimiento incluye la preparación de células, la carga con colorante y el manejo del lector de microplacas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Farmacología
- Biología celular
- Electrofisiología
Antecedentes
- Los canales TRPA1 son importantes en la transducción sensorial.
- Comprender su perfil farmacológico puede ayudar en el desarrollo de fármacos.
- El FlexStation 3 es una herramienta versátil para cribado de alto rendimiento.
- Se utilizan colorantes sensibles al calcio para medir la actividad del canal.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para el estudio de los canales TRPA1.
- Mostrar el uso del FlexStation 3 en estudios farmacológicos.
- Facilitar la comprensión de la modulación del canal TRPA1.
Métodos Utilizados
- Preparación de células que expresan canales TRPA1 en placas de microtitulación.
- Lavado de células utilizando un lavador de microplacas.
- Carga de células con un colorante fluorescente sensible al calcio (Fluo-4 AM).
- Preparación de placas de compuestos con agonistas y antagonistas del TRPA1.
Resultados principales
- Carga exitosa de células con el colorante fluorescente.
- Uso efectivo del FlexStation 3 para medir la actividad de TRPA1.
- Identificación de moduladores de TRPA1 mediante perfil farmacológico.
- Demuestra la aplicabilidad del protocolo en la investigación.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para estudiar los canales TRPA1.
- FlexStation 3 es una herramienta eficaz para estudios farmacológicos.
- Comprender la modulación de TRPA1 puede conducir a avances terapéuticos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite el perfilado farmacológico de medio a alto rendimiento de los canales TRP mediante mediciones de flujo de calcio, apoyando la validación temprana de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas. Al cuantificar la potencia de agonistas y la inhibición de antagonistas en un formato reproducible y automatizado, proporciona una confiabilidad predictiva para priorizar moduladores de canales iónicos en las fases de descubrimiento. Este enfoque reduce la dependencia de la electrofisiología de bajo rendimiento, acelerando el proceso de identificación de compuestos activos hacia candidatos preclínicos para dianas sensoriales y fisiopatológicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Analiza la función del canal TRPA1 mediante la entrada de calcio dependiente de la dosis, lo que permite la confirmación mecanicista del compromiso del objetivo.
- Valor operativo: Utiliza células HEK293 que expresan TRPA1 humano para establecer un modelo de sobreexpresión trasladable para la interrogación farmacológica.
- Valor predictivo: Genera valores de CE50 y CI50 (55,4 µM y 4,3 µM, respectivamente) para apoyar la relación estructura-actividad desde las primeras etapas de la identificación de compuestos líderes.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Proporciona lecturas cuantitativas de fluorescencia en tiempo real mediante Fluo-4 AM, permitiendo la evaluación del factor Z' y la robustez del ensayo.
- Compatibilidad con alto rendimiento: Aprovecha la lectura columna por columna del FlexStation 3 con transferencia automática de líquidos para cribado en formato de 96 pocillos.
- Compatibilidad de reactivos: Demuestra el uso de colorantes sensibles al calcio y pipeteo multicanal para una carga uniforme del colorante y administración de compuestos.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: El papel de TRPA1 en la nocicepción respalda su uso como un indicador mecanicista para la modulación de las vías del dolor en ensayos preclínicos de seguridad y eficacia.
- Continuidad traslacional: Permite una consistencia entre diferentes formatos, desde modelos de sobreexpresión hasta la validación en tejidos nativos, utilizando el mismo principio de detección de flujo.
- Utilidad para reducir riesgos: Disminuye los falsos positivos al confirmar el flujo de calcio como lectura funcional antes de invertir en modelos de parche de membrana o modelos in vivo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el flujo de trabajo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco líder, proporcionando un paso intermedio escalable entre la confirmación por sobreexpresión y la validación electrofisiológica secundaria.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la modulación de canales TRP al aislar el flujo de calcio como un resultado funcional directo de la activación del canal.
- Selección: Permite la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante la adición automatizada de reactivos y lecturas cinéticas en modo Flex.
- Análisis: Genera curvas de respuesta-concentración basadas en la velocidad inicial, lo que permite discriminar cinéticamente la eficacia del agonista más allá de la amplitud máxima.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos al establecer una lectura conservada (flujo de calcio) aplicable en diversos sistemas modelo.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la selección de otros canales permeables al Ca2+ (por ejemplo, TRPV1, TRPM8) y receptores acoplados a proteínas G (GPCR) utilizando la misma configuración de colorante y lector.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona una reducción de riesgos mecanicista al confirmar la modulación del blanco mediante un segundo mensajero directo y cuantificable (Ca2+).
- Valor operativo: Ofrece estandarización, reproducibilidad y escalabilidad mediante la lectura automatizada de placas y el análisis cinético.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al generar perfiles farmacológicos tempranos con umbrales de potencia definidos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de moduladores de canales iónicos basada en la potencia funcional y la selectividad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular, transfección transitoria/estable y manejo de colorantes fluorescentes.
- Depende del FlexStation 3 con modo FLEX, SoftMax Pro y un lavador de microplacas para el manejo automatizado de líquidos.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de carga de colorantes y del formato de placas de compuestos para obtener resultados consistentes.
- La adaptación a células nativas o primarias puede requerir la optimización de los niveles de expresión y de la fluorescencia de fondo.
- Limitado a lecturas fluorescentes; incompatible con colorantes susceptibles de apagado o compuestos que interfieran con la excitación/emisión de Fluo-4 AM.
