Name: Preparación de ADN viral de nucleocápside (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Aprende a aislar ADN de nucleocápside de herpesvirus de alta pureza mediante ultracentrifugación y extracción con fenol-cloroformo. Este método permite obtener ADN concentrado sin contaminación del hospedero para secuenciación y transfecciones.

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Los autores agradecen las contribuciones de Greg Smith, Lisa Pomeranz, Lyman Matt, Eldridge Marlies, Halina Staniszewska Goraczniak, y los miembros del laboratorio de Enquist en el perfeccionamiento de este protocolo.

1. Primer Día: infección viral y preparación de tampones <ol><li> Preparar platos 50-10 (15 cm de diámetro) de las células de cultivo de tejidos para la infección, por ejemplo, células PK-15 para el virus de la pseudorrabia (PRV) o de células Vero de virus del herpes simple (VHS). </li><li> Cuando las células son de 95 - 100% confluentes, que infectan a un (MOI) de 5.10. Para ello, vacunar a cada plato con stock de virus en un volumen total de 4 ml por placa, y luego se incuban las placas durante 1 hora a 37 ° C. Placas de roca suavemente cada 15 minutos para asegurarse de que la monocapa celular sigue siendo totalmente recubierto por el inóculo de virus. Mientras tanto, calentar el medio para el siguiente paso. </li><li> Después de una hora de la infección, aspiración de inóculo viral de las placas, agregar 15 ml de medio caliente, y se incuba a 37 ° C durante 12-20 horas en un incubador humidificado. </li><li> Preparar buffers LCM (ver Tabla 1) y el rock la noche a 4 ° C para la mezcla completa. Prepare TNE para la resuspensión de ADN viral (ver Tabla 2). </li></ol> 2. Segundo día, Fase 1: lisis celular y ultracentrifugación <ol><li> Confirmar visualmente que la infección de las células ha causado un efecto uniforme citopático (CPE). Permitir la infección de progreso hasta que todas las células tienen rodeados, pero no han quitado la placa. </li><li> Raspar las células infectadas en el medio, y se combinan células y el medio en tubos de 50 ml cónicos. El número de tubos cónicos necesario para este paso dependerá de la cantidad de los platos utilizados para la infección en el Paso 1.2, por ejemplo, un tubo de 50 ml cónicos se puede utilizar para precipitar un máximo de tres platos de medio de 15 ml cada uno. Opcional: Enjuague el placas con 10 ml de PBS y se combinan con las células y medianas empresas. </li><li> Centrifugue las células y medio durante 10 minutos a 2000 la fuerza relativa centifugal (FCR) a temperatura ambiente, y aspirar el sobrenadante y resuspender cada pellet en 10 ml de PBS. Si el sedimento de una infección viral se extendió en varios tubos cónicos en el Paso 2.2, estos se pueden recombinar en un tubo cónico en este paso. Repetir la centrifugación y la aspiración. Opcional: Esta pastilla puede ser almacenado a -20 ° C y el protocolo seguido en un momento posterior. </li></ol> 3. Segundo día, Fase 2: Ultracentrifugación Mantener el sedimento celular y tampones LCM en hielo siempre que sea posible durante los siguientes pasos. <ol><li> Añadir β-mercaptoetanol al glicerol 0% - búfer LCM. Empieza a enfriar a la ultracentrífuga (para el paso por debajo de 3,9) mediante el establecimiento a 4 ° C y girando en el vacío. </li><li> Resuspender el botón celular en 5 ml de glicerina de 0% - búfer LCM hasta que ya no es abultada. Si es necesario, el tubo de vórtice para romper cualquier disolver el sedimento celular. </li><li> Extraer mediante la adición de 1,5 ml de freón (1,1,2-tricloro-1 ,2,2-trifluoro) y agitación vigorosa. Inmediatamente se centrifuga durante 10 minutos a 2000 fcr a una temperatura de 4 ° C. Recoger la capa superior con una punta de pipeta de gran calibre (evitando la interfaz) y la transferencia a un nuevo tubo. Opcional: Si el pellet es un sólido gelatinoso, usted puede verter la capa superior en un nuevo tubo. </li><li> Repetir la extracción de freón y centrifugar de nuevo. </li><li> Recoger la capa superior (~ 5 ml) y transferir a un tubo de ultracentrífuga polyallomer nuevo. Añadir β-mercaptoetanol al glicerol dos restantes - buffers LCM. </li><li> Preparar un gradiente en el tubo de centrífuga polyallomer underlaying por el extracto de freón (capa superior) con 3 ml de glicerol al 5% - LCM (capa media), y luego underlaying de nuevo con 2,5 ml de 45% de glicerol - LCM (capa inferior). Use una pipeta fina para evitar el desbordamiento de los contenidos del tubo. </li><li> Si es necesario, prepare un tubo de equilibrio equivalente con las mismas proporciones de búferes de LCM. </li><li> La transferencia de los tubos en los cubos de ultracentrifugación. Balance de cubos de 0,1 g de cada uno, añadiendo lentamente glicerol extra 0% - búfer LCM a la capa superior (~ 50 a 100 l en un momento). </li><li> Usando una ultracentrífuga frío con un rotor de cubeta horizontal o basculante, girar las muestras equilibrada durante 1 hora a 77.000 RCF (por ejemplo, 25.000 rpm para un rotor SW41Ti) a una temperatura de 4 ° C. </li><li> Durante la ultracentrifugación, hacer un gancho de vidrio para capturar el ADN flotante en la etapa de precipitación con etanol (4.6). Sostenga los dos extremos de una pipeta Pasteur de vidrio y la suspensión de la sección media sobre una llama. Cuando una sección del vaso está casi fundido, tire suavemente para estirar el vidrio, doble suavemente para crear un gancho fuertemente inclinadas (&lt;90 grados), y tirar fuertemente para sellar el final. Si la punta del gancho de vidrio está abierta, mantenga la punta sobre la llama para que el vidrio se funde lo suficiente como para cerrarla. </li><li> Después de la ultracentrifugación, debería ver un fino precipitado opaco, con una mancha oscura en el centro. Con cuidado aspirar el líquido del tubo, incluyendo grasa a lo largo de los lados, pero evitando los pellets en la parte inferior del tubo. </li><li> Añadir 0,5 ml TNE a temperatura ambiente. </li><li> Deje que el pellet se siente por lo menos 10 minutos para permitir la hidratación de la pastilla. Opcional: La pastilla también podría volver a suspender en TNE noche a la mañana, si se conserva a 4 ° C. </li></ol> 4. Tercer Día: "Ghost" ADN Precipitaciones <ol><li> Romper el pellet con la pipeta con una punta de pipeta de pequeño calibre (por ejemplo, una punta de la pipeta p200). No te preocupes por corte en este paso, ya que el ADN viral es todavía contenida en cápsides en este momento. Añadir los siguientes reactivos al tubo que contiene el virus de pellets, a temperatura ambiente, para destruir cápsides: <ul><li> 4,25 ml TNE </li><li> 0,25 ml de 10% SDS </li><li> 2 mg de proteinasa K </li></ul> Agite suavemente para mezclar los reactivos. Debe haber un ligero aumento de la viscosidad. </li></ol> Tenga cuidado con los de corte a partir de ahora, por ejemplo, el uso de gran calibre pipetas y no agite el material viral <ol start="2"><li> Extracto de proteínas virales mediante la adición de 5 ml de fenol-cloroformo y empezar inmediatamente a invertir o agitación para mantener una emulsión. Mezclar durante 10 segundos, centrifugar la emulsión durante 5 minutos a 2000 fcr a temperatura ambiente. Recoger la capa superior con una punta de gran calibre la pipeta, evitando la interfaz, y la transferencia a un nuevo tubo. Opcional: Use la fase de bloqueo de gel (PLG) en los tubos de este paso para evitar la contaminación de la interfaz. </li><li> Repetir la extracción con fenol-cloroformo y centrifugar de nuevo. </li><li> Después de la segunda extracción con fenol-cloroformo, recoger la capa superior en un tubo de 30 ml de cristal Corex y enfriar el tubo a -20 ° C durante 10-15 minutos, teniendo cuidado de que no se congela. </li><li> Añadir 10 ml de etanol helado, cubrir el tubo (por ejemplo, se extiende un trozo de Parafilm M en la parte superior), e invierta para mezclar inmediatamente. Esté atento a un ADN "fantasma" que aparecen, que consiste en un precipitado viscoso delgada. Invertir el tubo suavemente para mezclar aún más y hacer que el ADN pegajoso precipita a agruparse. </li><li> Utilice un gancho de vidrio para capturar el fantasma del ADN (s). Cuidadosamente blot el ADN para eliminar el exceso de líquido, a continuación, coloque el gancho (la punta hacia abajo) en un tubo de 1.5 ml y dejar secar. Añadir 0,25 a 0,5 ml de TE para disolver el fantasma del ADN. Permitir la resuspensión de ADN para proceder de al menos una hora. ADN se almacenan a 4 ° C. Opcional: Para maximizar el rendimiento de ADN, se rompe el gancho de vidrio en el tubo de 1.5 ml, de modo que la resuspensión de los fragmentos de vidrio pueden seguir el paso del tiempo. </li></ol> 5. Resultados representante Con un alto MOI suficiente, las células deben lograr la plena CPE dentro de ~ 18 horas post-infección (hpi) para cepas de tipo salvaje PRV, y ~ 24 hpi de tipo salvaje cepas de HSV-1 (Figura 1). Una vez que el pellet de células infectadas se cosecha, el resto de pasos del protocolo se puede completar en un día largo o llevado a cabo durante dos días (Figura 2). En la preparación de los ganchos de vidrio para capturar el fantasma del ADN, es importante que el ángulo de gancho de ser inferior a 90 grados, para que después pueda caber en la base de un tubo de 1.5 ml (Figura 3). Sellado de la punta de este gancho previene la pérdida de ADN dentro de la pipeta. Los fantasmas de ADN se forman durante la etapa de precipitación y aparecerá como hilos blancos, viscosa (Figura 4). Estos agregados y se adhieren entre sí y / o el gancho de vidrio utilizado para capturar el ADN. Así, el gancho de vidrio mismo se puede utilizar para reunir varios hilos de ADN dentro de la solución de precipitación. <table border="1"><tbody><tr><td> Elija columna basada en el volumen deseado: </td><td> 10 ml </td><td> 15 ml </td><td> 20 ml </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td> 1M KCl </td><td> 1,3 ml </td><td> 1,9 ml </td><td> 2,5 ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1M Tris (pH 7,4) </td><td> 300 l </td><td> 450 l </td><td> 600 l </td><td> 1,2 ml </td></tr><tr><td> MgCl2 1M </td><td> 50 l </td><td> 75 l </td><td> 100 l </td><td> 200 l </td></tr><tr><td> 0,5 EDTA </td><td> 10 l </td><td> 15 l </td><td> 20 l </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td> NP40/IGEPAL </td><td> 50 l </td><td> 75 l </td><td> 100 l </td><td> 200 l </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol (agregue inmediatamente antes del uso) </td><td> 4,3 l </td><td> 6,5 l </td><td> 8,6 l </td><td> 17,2 l </td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td colspan="5"> Usar proporciones para el glicerol por ciento deseado (0, 5, o 45%) </td></tr><tr><td> 0% de glicerol </td><td> Ninguno </td><td> Ninguno </td><td> Ninguno </td><td> Ninguno </td></tr><tr><td> de agua </td><td> 8,3 ml </td><td> 12,5 ml </td><td> 16,7 ml </td><td> 33,4 ml </td></tr><tr><td> 5% de glicerol </td><td> 0,5 ml </td><td> 0,8 ml </td><td> 1,0 ml </td><td> 2,0 ml </td></tr><tr><td> de agua </td><td> 7,8 ml </td><td> 11,7 ml </td><td> 15,7 ml </td><td> 31,4 ml </td></tr><tr><td> 45% glycerol </td><td> 4,5 ml </td><td> 6,8 ml </td><td> 9,0 ml </td><td> 18,0 ml </td></tr><tr><td> de agua </td><td> 3,8 ml </td><td> 5,7 ml </td><td> 7,7 ml </td><td> 15,4 ml </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Recetas para la preparación de tampones LCM <table border="1"><tbody><tr><td> Por volumen de 50 ml </td></tr><tr><td> 5 ml de NaCl 1M </td></tr><tr><td> 2,5 ml de 1M Tris, pH 7,5 </td></tr><tr><td> Una de 0,5 ml con EDTA </td></tr><tr><td> 41,5 ml de H 2 O </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Preparación de la TNE (0,1 M NaCl, 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA) <table border="1"><tbody><tr><td> Para el volumen 1 L </td></tr><tr><td> 0,2 g de KCl </td></tr><tr><td> 0,2 g de KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 8 g de NaCl </td></tr><tr><td> 1,15 g de Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> H 2 O a 1 litro </td></tr></tbody></table> Tabla 3. Preparación de PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4 pH 7,0) <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. PK15 células (A) antes de la infección, (B) a mitad de la infección, y (C) en el efecto citopático (CPE), después de una multiplicidad de infección. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Descripción general del protocolo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Tres ejemplos representativos de vidrio anzuelos utilizados para recoger los fantasmas del ADN viral. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Ejemplo representativo de un ADN bien formado y abundante "fantasma".

<ol><li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li>
<li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins%3A+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li>
<li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li>
<li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li>
<li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus%2C+an+alphaherpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+virology%22">Principles of virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pseudorabies+virus%3A+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li>
<li>Roizman, B., Pellett, P. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , 2 ed, Lippincott Williams & Wilkins. 2381-2397 (2001).</li>
<li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li>
<li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li>
<li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Algunas partes de este protocolo fueron desarrollados originalmente para el aislamiento de ADN viral en BSL4 condiciones, pero se adapta igualmente bien a los no-BSL condiciones. 4 Se suelen usar este protocolo para aislar el ADN de la PRV alfa-herpesvirus y el VHS-1, que tienen genomas de ADN encerrado en una cápside proteica y rodeado por una envoltura lipídica. 7,8 Sin embargo, es probable que directamente adaptables a otras grandes virus de ADN, incluyendo beta-y gamma-herpesvirus y adenovirus....

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Freón (1,1,2-tricloro-1 ,2,2-trifluoro) </td><td> Pescador </td><td> T178-4 </td><td> Verifique con su institución para las instrucciones sobre la eliminación adecuada de los desechos que contengan freón, o ver Mendez et al. alternativas posibles freón. 9 </td></tr><tr><td> Fase de bloqueo de los tubos de gel, la capacidad de 15ml pesado </td><td> 5 PRIME </td><td> 2302850 </td><td> Opcional </td></tr><tr><td> Polyallomer tubos de ultracentrífuga </td><td> Beckman * </td><td> 331372 * </td><td> * Seleccione los tubos adecuados para su propia ultracentrífuga, los cuales se incluyen a título de ejemplo </td></tr><tr><td> NP-40 / IGEPAL </td><td> Sigma </td><td> I-3021 </td><td></td></tr><tr><td> Células PK-15 </td><td> ATCC </td><td> CCL-33 </td><td></td></tr><tr><td> Las células Vero </td><td> ATCC </td><td> CCL-81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> HyClone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de adn viral de nucleocápside

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Los virus son parásitos obligados celular, y por lo tanto el estudio de su ADN requiere aislar material viral de distancia de los contaminantes de la célula huésped y el ADN. Varias aplicaciones posteriores requieren grandes cantidades de ADN viral pura, que es proporcionada por este protocolo. Estas aplicaciones incluyen la secuenciación del genoma viral, donde la extracción de ADN del huésped es crucial para optimizar la salida de datos de secuencias virales, y la producción de nuevas cepas virales recombinantes, 1,2, donde la co-transfección de ADN purificado viral y plásmido lineal facilita la recombinación., 3 Este procedimiento utiliza una combinación de extracción y la densidad basado en la centrifugación para aislar ADN purificado herpesvirus nucleocápside lineal de las células infectadas. 4,5 Los pasos de la purificación inicial objetivo de aislar a cápsidas virales purificados, que contienen y protegen el ADN viral en las extracciones y los pasos de centrifugación que eliminan las proteínas celulares y el ADN. Lisis de la nucleocápside libera el ADN viral, y dos finales de fenol-cloroformo pasos eliminar las proteínas restantes. El final de ADN capturado de la solución está muy concentrado y puro, con un promedio de 260/280 OD de 1,90. Dependiendo de la cantidad de células infectadas, los rendimientos de la gama de ADN viral 150 a 800 mg o más. La pureza de este ADN hace que sea estable durante el almacenamiento a largo plazo a 4 ° C. Este ADN es por lo tanto ideal para el alto rendimiento de secuenciación de alta fidelidad de las reacciones de PCR, y transfección. Antes de comenzar el protocolo, es importante conocer el número promedio de células por plato (por ejemplo, un promedio de 8 x 10 6 células PK-15 en un plato cm confluentes 15), y el título de la acción viral para ser utilizado ( por ejemplo, 1 x 10 8 unidades formadoras de placas por ml). Estos son necesarios para calcular la multiplicidad apropiado de la infección (MOI) para el protocolo. 6 Por ejemplo, para infectar a un plato de 15 cm de células PK-15 con la acción viral por encima, en una MOI de 5, se utiliza 400 l de stock viral y la mezclan con 3,6 ml de medio (volumen de inoculación total de 4 ml para una placa de 15 cm). Múltiples preparaciones de ADN viral se puede preparar al mismo tiempo. El número de preparaciones simultáneas está limitado sólo por el número de tubos en poder del rotor ultracentrífuga (uno por virus, consulte el paso 3.9 más adelante). A continuación se describe el procedimiento como si se hace por un virus.

Se describe el proceso de aislamiento de ADN de alta pureza herpesvirus nucleocápside de las células infectadas. El final de ADN capturado de la solución es de alta concentración y pureza, por lo que es ideal para la secuenciación de alto rendimiento, alta fidelidad de las reacciones de PCR, y transfecciones para producir nuevas recombinaciones virales.

Preparación de ADN viral de nucleocápside

Los virus son parásitos celulares obligatorios y, por lo tanto, el estudio de su ADN requiere aislar el material viral de los contaminantes y del ADN de la célula huésped. ...

Este video demuestra un procedimiento para aislar con alta pureza el nucleocápsido viral y el ADN a partir de células infectadas. Primero, las membranas lipídicas se desnaturalizan utilizando una extracción doble con fenol. Luego, la muestra se ultracentrifuga para sedimentar los nucleocápsidos virales y separarlos de los componentes celulares y virales más livianos.Se añaden detergentes y proteína K para liberar el ADN viral de los nucleocápsides sedimentados. Luego, se realizan extracciones duales con fenol-cloroformo para eliminar todas las proteínas restantes. Finalmente, el ADN viral se precipita en solución.En última instancia, los resultados muestran que se ha aislado ADN viral altamente concentrado y puro a partir de estas células infectadas. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes que no implican extracciones libres de enzimas o ultracentrifugación, es que el ADN viral obtenido presenta niveles muy bajos de contaminación con ADN del huésped, lo que lo hace ideal para procedimientos posteriores como la PCR y la secuenciación profunda de genomas virales. Utilizamos este método por primera vez en los inicios del trabajo con ADN recombinante, cuando eran de gran importancia medidas preventivas adicionales.Desarrollamos este procedimiento para aislar ADN viral mientras trabajamos en una cabina de flujo laminar bajo condiciones BSL-4. La demostración visual de este método es fundamental porque la formación del gradiente y los pasos de precipitación del ADN fantasma son difíciles de aprender. Esto se debe a que la estratificación del gradiente requiere una mano extremadamente firme y el ADN fantasma que precipita en la solución puede ser difícil de observar si no se tiene experiencia previa en su identificación.Comience este procedimiento preparando de cinco a diez placas de 15 centímetros de diámetro con células de cultivo celular para la infección. Aquí, las células PK 15 se preparan para la infección con el virus de la pseudorrabia cuando las células alcancen una confluencia del 95 al 100 %; sustituya el medio por cuatro mililitros de medio que contenga el virus. Con una MOI de cinco a diez, incube las placas durante una hora en un incubador húmedo a 37 grados Celsius con 5 % de CO₂, agitando cada 15 minutos.Agite suavemente las placas para asegurar que la monocapa celular permanezca completamente recubierta por el inóculo viral. Durante la incubación, caliente el medio para el siguiente paso. Tras una hora de infección, aspire el inóculo viral de las placas.Luego, agregue 15 mililitros de medio tibio e incube a 37 grados Celsius durante 12 a 20 horas en un incubador humedecido. Finalmente, en preparación para los experimentos del día siguiente, prepare un lote fresco de tampones LCM y TNE. Tenga en cuenta que la adición de NP 40 provocará la formación de cintas en la solución acquis.Coloque las soluciones preparadas sobre un agitador rotatorio a cuatro grados Celsius durante la noche. Para el día siguiente, las soluciones deben estar completamente integradas. Coloque la placa en la platina de un microscopio compuesto y confirme visualmente que la infección de las células ha provocado un efecto citopático uniforme.Todas las células deben haberse redondeado, pero no deben haberse desprendido de la placa. Si las células aún no se han redondeado, continúe la incubación hasta observar efectos citopáticos. A continuación, raspe las células infectadas hacia el medio y combine las células en el medio en tubos cónicos de 50 mililitros para aumentar el rendimiento.Lave las placas con 10 mililitros de PBS y combínelas con las células en medio, luego centrifugue las células y el medio durante 10 minutos a 2000 RCF a temperatura ambiente para eliminar cualquier medio y suero restantes. Aspire el sobrenadante y resuspenda el precipitado en 10 mililitros de PBS. Repita la centrifugación y la aspiración. Si el experimento no se continuará el mismo día, almacene el precipitado a menos 20 grados Celsius hasta que se utilice en los pasos mostrados en esta sección.Es importante mantener el botón celular y los tampones LCM sobre hielo siempre que sea posible. Prepárese para la ultracentrifugación añadiendo etanol Beamer capto al tampón LCM con glicerol al 0 % de modo que la concentración final de etanol Beamer capto sea del 0,043 %. También prepare la ultracentrífuga ajustándola a cuatro grados Celsius y encendiendo el vacío mientras la ultracentrífuga se enfría. Añada cinco mililitros del tampón LCM al 0 % de glicerol con etanol Beamer capto al 0,043 % al botón celular y pipetee hacia arriba y hacia abajo para resuspender el botón.Asegúrese de deshacer todos los grumos si es necesario. Vortexe el tubo para deshacer cualquier pellet de células no disuelto. A continuación, para extraer las membranas celulares y virales, agregue 1.5 mililitros.Agregue Freon y vortexe vigorosamente de inmediato. Centrifugue durante 10 minutos a 2000 RCF a cuatro grados Celsius. Después de la centrifugación, habrá dos capas.La capa superior acuosa contiene ácidos nucleicos virales, cápsides y proteínas, mientras que la capa inferior de Freón contiene membranas virales y celulares. Utilizando una punta de pipeta de gran diámetro, recoja la capa superior evitando la interfase y transfiérala a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Es importante evitar tocar la capa de Freón y arrastrar ese disolvente orgánico a la capa acuosa en el nuevo tubo.Agregue freón y vortexee como antes para repetir la extracción con freón tras la centrifugación. Recolecte la capa superior, aproximadamente cinco mililitros, y transfiera a un tubo fresco de ultracentrífuga de polímero. Agregue etanol beamr capto hasta un 0,043 % a los dos tampones de LCM de glicerol restantes.A continuación, para preparar un gradiente en el tubo de centrífuga de polímero, utilice una pipeta delgada para superponer por debajo el extracto de Freon con tres mililitros de LCM de glicerol al 5%. Luego, agregue por debajo de esta una capa de 2,5 mililitros de LCM de glicerol al 45%. Asimismo, si es necesario, prepare un tubo de equilibrio equivalente utilizando las mismas proporciones de tampones LCM.Coloque los tubos en los portamuestras de la ultracentrífuga y equilíbrelos entre sí con una diferencia máxima de 0,1 gramos, agregando cuidadosamente pequeñas cantidades de 50 a 100 microlitros de tampón LCM con glicerol al 0 % a la capa superior. Gire las muestras equilibradas durante una hora a 77.000 RCF y cuatro grados Celsius durante la ultracentrifugación. Utilice una pipeta Pasteur de vidrio para formar un gancho y capturar el ADN flotante en el paso de precipitación con etanol.Sostenga ambos extremos de la pipeta y suspenda la sección media sobre la llama. Cuando una sección del vidrio esté tibia, tire suavemente para estirar el vidrio. Doble suavemente para crear un gancho con un ángulo agudo menor a 90 grados y tire bruscamente para sellar el extremo.Si la punta del gancho de vidrio está abierta, sostenga la punta sobre las llamas para que el vidrio se derrita lo suficiente como para cerrarla. Después de la ultracentrifugación, habrá un pellet delgado y opaco con un punto oscuro en el centro, que contiene el nucleo viral. Aspire cuidadosamente el líquido del tubo, incluyendo las gotas a lo largo de las paredes, pero evitando el pellet en el fondo del tubo.Añada 0,5 mililitros de TNE a temperatura ambiente. Deje reposar el pellet durante al menos 10 minutos para permitir la hidratación del pellet. Si el procedimiento no se continuará hasta el día siguiente, coloque el pellet resuspendido a cuatro grados Celsius.Utilizando una punta P 200, desintegre el pellet hidratado pipeteando hacia arriba y hacia abajo. No se preocupe por la fragmentación en este paso, ya que el ADN viral aún está contenido dentro de los cápsidos en este momento. Para romper los cápsidos, agregue al pellet viral lo siguiente: 4,25 mililitros de TNE, 0,25 mililitros de SDS al 10 % y dos miligramos de proteína EK a temperatura ambiente.Agite suavemente. Para mezclar estos reactivos. Debe observarse un ligero aumento de la viscosidad ahora que las cápsides han sido destruidas; tenga cuidado para evitar romper el ADN, utilice puntas de pipeta de gran apertura y no vortex el material viral para extraer las proteínas virales.Transfiera la muestra a un tubo con gel de bloqueo de fases y agregue cinco mililitros de fenol-cloroformo. Inmediatamente, comience a invertir el tubo para mantener una mezcla en emulsión mediante inversiones continuas o durante al menos 10 segundos. Luego, centrifugue la emulsión durante cinco minutos a 2000 RCF a temperatura ambiente.Tras la centrifugación, tome la capa superior y transfiérala a un nuevo tubo con gel de bloqueo de fases. Repita la extracción con fenol-cloroformo y vuelva a centrifugar tras la segunda extracción con fenol-cloroformo. Recopile la capa superior en un tubo de vidrio coex de 30 mililitros y enfríe el tubo a menos 20 grados Celsius durante 10 a 15 minutos.Teniendo cuidado de que no se congele. Añada 10 mililitros de etanol frío al dispositivo. Tape el tubo e inviértalo para mezclar.Observe inmediatamente la aparición de un fantasma de ADN, que consiste en un precipitado delgado y filamentoso. Invierta suavemente el tubo para mezclar más y hacer que los precipitados pegajosos de ADN se agrupen. Finalmente, utilice un gancho de vidrio para extraer cuidadosamente los fantasmas de ADN y seque el ADN presionándolo ligeramente con una toallita kim para eliminar el exceso de líquido.Luego, coloque la punta del gancho hacia abajo en un tubo de 1,5 mililitros. Para maximizar el rendimiento de ADN, rompa el gancho de vidrio dentro del tubo de 1,5 mililitros para que la suspensión de re-sus pueda desprenderse de los fragmentos de vidrio progresivamente con el tiempo. Deje secar y agregue 0,25 a 0,5 mililitros de TE para disolver el fantasma de ADN.Permita que la resuspensión del ADN continúe durante al menos una hora y almacene el ADN a cuatro grados Celsius. El ADN viral se preparó a partir de nucleocápsides según se describe en este artículo de video; aquí se muestra un ejemplo representativo de un "fantasma de ADN" bien formado y abundante, que consiste en ADN genómico viral lineal precipitado en solución. Las hebras se agrupan juntas y requerirán tiempo para rehidratarse una vez colocadas en una solución acuosa. El ADN viral preparado de cepas de PRV, Becker, Bartha y otras cuatro cepas adicionales se electroforizó durante una hora en un gel de agarosa al 0,5 % y se tiñó con bromuro de etidio.Cada muestra de PRV utiliza un microlitro de una preparación de nucleocápside de ADN viral en un volumen total de 250 microlitros a la izquierda. Un marcador de tamaño de ADN de fago lambda. La digestión con la enzima de restricción uno muestra el gran tamaño del ADN de lambda sin digerir de 48,5 pares de kilobases y del ADN genómico de PRV de aproximadamente 140 pares de kilobases.A continuación, una serie de dilución con cantidades conocidas de ADN Lambda demuestra que la concentración de las muestras de PRV en la derecha varía entre 50 y 200 nanogramos por microlitro, para un rendimiento total de 12 a 50 microgramos por virus. Las preparaciones de ADN viral prepararon muestras de ADN de cuatro cepas de PRV que fueron digeridas durante la noche con BAM H uno o KPN uno. Las muestras de ADN digeridas con enzimas de restricción se separaron mediante electroforesis nocturna en un gel de agarosa al 0,8 % y se tiñeron con bromuro de etidio.Las carreras H uno incluyen ocho microgramos de nucleocápside viral, ADN, mientras que las carreras KPN uno incluyen cuatro microgramos de ADN viral. Cada cepa diferente de PRV puede distinguirse por sus respectivos patrones de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la secuenciación profunda para obtener datos sobre el contenido del genoma viral tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la virología caracterizaran el ADN viral mediante polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción o R fps, hibridación Southern, clonación, construcción de virus recombinantes de ADN y otras manipulaciones de virus del herpes y otros tipos de virus.No olvide que trabajar con fon puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como trabajar en una campana extractora al realizar este procedimiento. Después de la centrifugación, la capa de fon puede cambiar rápidamente de un semisólido gelatinoso a un líquido, por lo que cada tubo debe evaluarse individualmente antes de decidir si es mejor verter o usar una pipeta para recoger la capa superior acuosa.

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