Name: La manipulación experimental del tamaño del cuerpo para la estimación de las relaciones morfológicas de escala en Drosophila /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Aprende a estimar relaciones de escala morfológica en Drosophila mediante manipulación dietética que amplía la variación de tamaño corporal. Este método permite analizar cómo el tamaño del ala escala con el tamaño del cuerpo en insectos.

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La investigación descrita en este estudio fue apoyado por una beca de la Fundación Nacional de Ciencias (DEB-0805818) de WAF, AWS y la identificación de este estudio también fue apoyado por subvenciones del IOS-0845847 para AWS, IOS-0919855 de AWS y la identificación y IOS-0920720 para WAF

1. Crianza y manipulación de la dieta para producir una variación en el tamaño corporal y el tamaño del ala Racional y general. La expresión de las relaciones de escala en última instancia depende de los procesos de desarrollo normativo que producen variación en el órgano final y el tamaño del cuerpo. Estos procesos se describen mejor en el trabajo de insectos totalmente metamórficas (es decir, holometábolos), como D. melanogaster, donde los órganos crecer como indiferenciada "discos imaginales" en el grub-como larva 11,15-17. En Drosophila, el órgano final y el tamaño del cuerpo son regulados por el crecimiento durante la fase larvaria, las larvas crecen a través del estadio larval primera y la segunda hasta que alcancen un peso mínimo viable para la eclosión (MVW E) hacia el comienzo del tercer estadio larval de 18 años. Hambre antes de alcanzar MVW E impide la eclosión de adultos. Sin embargo, las larvas que están muertos de hambre en MVW E generar adultos viable, aunque a un tamaño muy pequeño. Esto se debe a reducción de la nutrición durante el desarrollo del cuerpo reduce el final y el tamaño del órgano, no sólo en las moscas, pero en casi todos los animales 19-21. Mediante la manipulación de la disponibilidad de alimentos después de MVW E se alcanza, pero antes de la pupación ocurre, es posible inducir la extrema plasticidad fenotípica en el tamaño corporal que es mucho más importante otras fuentes de variación (por ejemplo, la variación genética individual). <ol><li> Los huevos son recogidos de la población a ser fenotipo, dividido en lotes de 50 y se colocan en frascos que contienen 10 ml de alimentos marcha estándar. Debido a la oviposición ocurre continuamente, los huevos se recogen cada 24 horas durante tres días, la producción de tres grupos de edad. </li><li> Cuando la cohorte de más edad llega a la etapa errante o acaba de empezar para pupar, la manipulación de la dieta se aplica. En este punto, la cohorte de más edad es mucho más allá de la E MVW, la cohorte más joven está muy cerca de la E MVW y la cohorte restante está en algún lugar entre estos extremos. Por lo tanto, la eliminación de alimentos en este momento se producen los adultos de gran tamaño de la cohorte de más edad, los adultos muy pequeños de la cohorte más joven y los adultos de tamaño intermedio de la cohorte restante. Para eliminar las larvas de los viales, de aproximadamente 5 ml de solución de sacarosa al 40% se agrega a todos los viales. Para liberar a las larvas, los alimentos se agita durante 15-20 minutos sobre una mesa vibradora conjunto a una velocidad intermedia. </li><li> Las larvas flotantes se eliminan de la solución de sacarosa con una multa (00) pincel, se colocan en frascos que contienen un tapón de algodón mojado y se permite que se convierten en crisálidas. Por otra parte, las larvas pueden ser colocados sobre un aditivo alimentario no digerible como metilcelulosa 22. </li></ol> 2. Estimación del tamaño corporal Racional y general. Estudios previos indican que la longitud del tórax es una representación menor que el tamaño ideal para el total del cuerpo 22. En su lugar, utilizar el tamaño de pupa como una medida del tamaño del cuerpo. Tamaño corporal máximo se fija en el cese de la alimentación que precede a la fase de pupa. Como resultado, existe una estrecha correlación entre el tamaño de las pupas y el tamaño corporal adulto de 23. <ol><li> Las pupas están dispuestas lado ventral hacia arriba en el portaobjetos de vidrio y fotografiado con una cámara digital conectada a un microscopio de disección. Cada imagen es capturada, le asigna un código de identificación único y transferir al ordenador a través de una transmisión en vivo de conectar la cámara digital a la computadora. </li><li> Imágenes pupas se mueven al individuo 2 ml que contiene 1 ml epitubes de alimentos volar, etiquetados con el código único para ese individuo, y se punza con respiraderos para permitir el intercambio de gases. </li><li> Tamaño de las pupas se estima como el número de píxeles de la silueta de pupa. Otros indicadores de tamaño también puede ser utilizado. </li></ol> 3. Rasgo (ala) estimación del tamaño Racional y general. A las alas de la imagen, se utiliza un ala de grabber "24, que atrae y mantiene el ala de un perpendicular vivir, volar anestesiado a su cuerpo. Presionado entre dos piezas de vidrio, esto permite que el ala para ser captado como un objeto de dos dimensiones. <ol><li> Las moscas son anestesiados con un poco de CO 2 y se coloca en la posición de la pinza de mariposa en un microscopio de disección provisto de una cámara digital que se conecta a un ordenador. </li><li> El ala se crea una imagen y se guarda bajo el código único para cada individuo. </li><li> Tamaño de las alas se puede calcular utilizando el polígono convexo mínimo que circunscribe marginal referencias fijas o como el número de píxeles de la silueta de las alas. </li></ol> 4. Escala de estimación relación <ol><li> Los datos se agrupan en las cohortes, pero separados por sexo y transformación logarítmica. </li><li> Relaciones de escala se ajuste a los datos de tamaño con el Tipo II (es decir, el eje mayor reducido) de regresión (ver revisión en 12) y los parámetros estimados para cada grupo. </li></ol> 5. Los resultados representativos: tienda de campaña "&gt; Nuestros manipulación de la dieta se produce una amplia gama de tamaños de cuerpo (figura 1) y los tamaños de característica (Figura 2). Representación de los rasgos de registro se transformó uno contra el otro revela su patrón de covariación dentro de un determinado grupo biológico y permite colocar la relación de escala al grupo (Figura 3). Extracción de los parámetros de escala relación que describen cómo las escalas de forma con el tamaño corporal permite la comparación de la forma cómo covaría con el tamaño de los grupos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig1.jpg"> Figura 1. Pupa de los extremos de la distribución del tamaño producido a través de la manipulación de la dieta después de los individuos a alcanzar la E MVW. Real de las imágenes de pupa se muestra a la izquierda con su silueta correspondiente a la medición del tamaño de pupa a la derecha. Barra de escala es de 1 mm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig2.jpg"> Alas de la figura 2. Tomada de los extremos de la distribución del tamaño corporal producido por la manipulación de la dieta después de los individuos a alcanzar la E MVW. Las imágenes reales del ala se muestran a la izquierda con su silueta correspondiente a la medición del tamaño de las alas de la derecha. Barra de escala es de 1 mm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig3.jpg"> Figura 3. Wing-cuerpo escala de tamaño de Drosophila melanogaster por sexo. Los datos log-transformados para los individuos de cada sexo que fueron totalmente alimentado (ojeras), un muerto de hambre (círculos grises) o dos días (círculos abiertos) en forma de larvas. Tipo de línea de regresión II se muestra para cada sexo. Entre cada grupo de edad, la disminución de superficie alar promedio de ~ 0,1 mm (~ 7%) y ~ 0,2 mm (~ 8%) se produce, el aumento de la gama total de fenotipos observados. Las regresiones muestran que las hembras son ligeramente hypoallometric para esta relación de escala (pendiente de 0,96) mientras que los machos son ligeramente hyperallometric (pendiente 1,06).

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<li>Mirth, C. K., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+assessment+and+growth+control%3A+How+adult+size+is+determined+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Size assessment and growth control: How adult size is determined in insects.</a> BioEssays. 29, 344-355 (2007).</li>
<li>Thissen, J. P., Ketelslegers, J. M., Underwood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+regulation+of+the+insulin-like+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Nutritional regulation of the insulin-like growth factors.</a> Endocr. Rev. 15, 80-101 (1994).</li>
<li>Boots, M., Begon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resource+limitation+and+the+lethal+and+sublethal+effects+of+a+viral+pathogen+in+the+Indian+meal+moth%2C+Plodia+interpunctella%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Resource limitation and the lethal and sublethal effects of a viral pathogen in the Indian meal moth, Plodia interpunctella.</a> Ecol. Entomol. 19, 319-326 (1994).</li>
<li>Shingleton, A. W., Mirth, C. K., Bates, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+model+of+static+allometry+in+holometabolous+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Developmental model of static allometry in holometabolous insects.</a> Proc. R. Soc. B. 275, 1875-1885 (2008).</li>
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<li>Emlen, D. J., Allen, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype+to+phenotype%3A+Physiological+control+of+trait+size+and+scaling+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Comp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genotype to phenotype: Physiological control of trait size and scaling in insects.</a> Integr. Comp. Biol. 43, 617-634 (2003).</li>
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No hay conflictos de interés declarado.

Escala morfológica ha sido objeto de intenso estudio de la biología evolutiva durante casi un siglo. Más recientemente, la base inmediata de la regulación del crecimiento y la ampliación se ha convertido cada vez más importante en el desarrollo, la fisiología y la genética (por ejemplo, ver en comentarios 12,15,23-25). Nuestra metodología permite la estimación de las relaciones de escala morfológica en toda la gama de rasgos y tamaños corporales. Esto puede ser importante, como el tamaño del rasgo no puede escalar de manera lineal con el tamaño del cuerpo (por ejemplo, 13,14). Sin embargo, esto puede no ser evidente cuando los animales se crían sólo en condiciones de laboratorio ideal. Aunque el protocolo ha sido desarrollado expresamente para permitir la estimación de la relación de tamaño de las alas del cuerpo de escala en Drosophila, que puede ser utilizado con el rasgo específico de modificación para estimar la relación de escala para cualquier rasgo morfológico de las moscas. Del mismo modo, la manipulación de la dieta probablemente puede ser utilizada para producir toda la gama de tamaños de los rasgos y cuerpo metamórfico de otros insectos en su totalidad; aplicaciones sólo requieren saber cuando el E MVW se logra y la aplicación de la manipulación en ese momento en la ontogenia.

la manipulación experimental del tamaño del cuerpo para la estimación de las relaciones morfológicas de escala en drosophila</em

Experimental Manipulation of Body Size to Estimate Morphological Scaling Relationships in Drosophila

La escala de las partes del cuerpo es una característica central de la morfología de los animales 7.1. Dentro de las especies, las características morfológicas deben ser correctamente proporcionada al cuerpo para que el organismo funcione, las personas mayores suelen tener más partes del cuerpo y los individuos más pequeños por lo general más pequeñas partes del cuerpo, de tal manera que la forma del cuerpo en general se mantiene en un rango de tamaños de cuerpo de un adulto. El requisito de que las proporciones correctas significa que los individuos dentro de cada especie por lo general presentan poca variación en el tamaño de carácter familiar. En contraste, el tamaño de rasgo familiar puede variar enormemente entre las especies y es un mecanismo principal por el cual se produce la diversidad morfológica. Más de un siglo de trabajo comparativo ha establecido estas intra e interespecíficas patrones de 3,4. Quizás el método más ampliamente utilizado para describir esta variación es calcular la relación de escala entre el tamaño de dos rasgos morfológicos mediante la ecuación alométrica y = bxα, donde x e y son del tamaño de los dos rasgos, como el órgano y el tamaño corporal 8 , 9. Esta ecuación describe la intra-grupo (por ejemplo, las especies, la población) relación de escala entre los dos rasgos que ambos varían en tamaño. Transformación logarítmica de esta ecuación produce una simple ecuación lineal, log (y) = log (b) + αlog (x) y log-log parcelas del tamaño de los rasgos diferentes entre los individuos de la misma especie suelen revelar la escala lineal con un intercepto de log (b) y una pendiente de α, denominado &quot;coeficiente alométrico&quot; 9,10. La variación morfológica entre los grupos se describe por las diferencias en intercepta relación de escala o pistas para un par determinado rasgo. En consecuencia, la variación en los parámetros de la ecuación alométrica (b y α) elegantemente describe la variación de la forma capturado en la relación entre el órgano y el tamaño del cuerpo dentro y entre los grupos biológicos (ver 11,12). No todos los rasgos de escala linealmente entre sí o con el tamaño del cuerpo (por ejemplo, 13,14) Por lo tanto, las relaciones morfológicas de escala son más informativos que los datos son tomados de la amplia gama de tamaños de rasgo. Aquí se describe cómo una simple manipulación experimental de la dieta puede ser utilizada para producir toda la gama del tamaño del cuerpo de los insectos. Esto permite una estimación de la relación de escala completa de dos determinados rasgos, lo que permite una descripción completa de la forma cómo covaría con un tamaño y una comparación robusta de los parámetros de relación de escala entre los grupos biológicos. Aunque nos centramos en Drosophila, la metodología debe ser aplicable a casi cualquier insecto totalmente metamórficas.

Relaciones morfológicas escala capturar y describir la forma del organismo. Se presenta un método para medir las relaciones morfológicas de escala a través del área de distribución natural de los tamaños de cuerpo de los insectos totalmente metamórficas. Utilizando una sencilla manipulación de la dieta se aumenta la distribución de tamaños de característica, que permite la descripción exacta de cómo la forma y el tamaño de co-varían.

La manipulación experimental del tamaño del cuerpo para la estimación de las relaciones morfológicas de escala en Drosophila</em

El escalamiento de las partes del cuerpo es una característica central de la morfología animal1-7. Dentro de una especie, los rasgos morfológicos deben estar proporcionados correctamente con respecto al cuerpo...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en utilizar una manipulación cronometrada desde el punto de vista del desarrollo en la disponibilidad de alimento para generar un amplio rango de tamaños corporales, que luego pueda emplearse para estimar la relación de escala entre rasgos morfológicos. Primero, se recolectan huevos de la misma población de moscas durante tres días, creando tres cohortes de edad. Cuando la cohorte más vieja de larvas comienza a empupar, se retiran las larvas de todas las cohortes del alimento.El resultado de esta modificación dietética es un mayor rango de variación en el tamaño de las pupas. A continuación, se toman imágenes de las alas de la pupa y del adulto de todos los individuos para permitir la estimación de la relación alométrica morfológica entre el tamaño del cuerpo y el tamaño del ala. Finalmente, se obtienen resultados que muestran cómo el tamaño del ala se escala con todo el rango posible de tamaños corporales mediante el ajuste de una regresión lineal de tipo dos a los datos.En este estudio, utilizamos una manipulación temporal del desarrollo en el acceso a la nutrición para aumentar experimentalmente la variación del tamaño corporal entre moscas adultas. Esto permite estimar las relaciones alométricas morfológicas a lo largo del rango completo de tamaños corporales. Este método puede ayudar a responder cuestiones clave sobre la expresión y evolución de la alometría morfológica, como identificar la base inmediata de la variación en los parámetros de las relaciones alométricas entre grupos biológicos.Trasladar una población de moscas a una cámara de apareamiento y luego recolectar huevos cada 24 horas durante tres días. Finalmente, crear tres cohortes de edad con la ayuda de un microscopio estereoscópico. Colocar lotes de 50 huevos de cada cohorte en viales que contienen 10 mililitros de alimento estándar para moscas.Incube los viales a la temperatura deseada para el desarrollo de las larvas. Cuando el grupo más viejo alcance la etapa de errabundeo, es momento de aplicar la manipulación de la dieta retirando las larvas del alimento. En este punto, las larvas del grupo más viejo ya superan ampliamente el peso mínimo viable para la oclusión y estarán cercanas al tamaño corporal máximo natural.Las larvas del grupo intermedio han superado el peso mínimo viable, pero producirán adultos más pequeños que las larvas del grupo más viejo. Las larvas del grupo más joven están muy cerca del peso mínimo viable y, por lo tanto, producirán adultos muy pequeños. Para retirar las larvas del alimento.Agregue aproximadamente cinco mililitros de solución de sacarosa al 40 % a los viales y luego agite durante 15 a 20 minutos en una mesa agitadora a velocidad media. Después de la agitación, retire las larvas flotantes de la solución de sacarosa con un pincel fino y colóquelas por cohortes en viales que contengan un tapón de algodón húmedo para mantener la humedad. Incube a la temperatura deseada hasta que ocurra la pupación.Coloque las pupas sobre un portaobjetos con el lado ventral hacia arriba. Una vez que las pupas estén en posición, capture imágenes utilizando una cámara digital conectada al microscopio. Asegúrese de configurar los ajustes para que cada pupa aparezca como una silueta oscura sobre un fondo blanco.Después de la obtención de imágenes, transfiera cada pupa a un tubo epit individual de dos mililitros que contenga un mililitro de alimento para moscas. Estime el tamaño de la pupila como el número de píxeles de la silueta de la pupila. Otras métricas de tamaño, como la longitud o la anchura, también podrían utilizarse bajo un microscopio estereoscópico.Anestesie ligeramente la mosca utilizando dióxido de carbono y colóquela usando un sujetador de alas, un dispositivo de succión que tira del ala entre dos piezas de vidrio y la mantiene perpendicular al cuerpo de la mosca. Para la obtención de imágenes, aunque en este estudio se utiliza un sujetador de alas para imaginar alas de moscas vivas, las alas y otros caracteres pueden diseccionarse e imaginar con herramientas normales. Capture la imagen del ala usando la cámara del microscopio conectada al ordenador y anote el sexo de la mosca. Después de obtener y guardar la imagen del ala, estime el tamaño del ala utilizando ya sea el polígono convexo mínimo que circunscribe los puntos de referencia fijos marginales como mediciones lineales, o bien el recuento de píxeles de la silueta del ala. Aquí, las pupas imaginales mostraron los extremos de la distribución de tamaño debido a la manipulación de la dieta.Después de que la pupa ha alcanzado el peso mínimo viable para la oclusión. También se muestran las siluetas correspondientes para la medición del tamaño de la pupila. Las imágenes correspondientes de las alas de esos mismos individuos en los extremos de la distribución de tamaño se muestran aquí junto con la silueta.Se utiliza para estimar la extracción del tamaño del ala de la relación de escala. Los parámetros que describen cómo el tamaño del ala se escala con el tamaño del cuerpo permiten la comparación de cómo la forma general co-varía con el tamaño entre grupos. Aquí, se muestran datos para individuos de cada sexo que fueron completamente alimentados o privados de alimento un día o dos días durante la etapa larval.Aunque los componentes individuales de este procedimiento son rápidos, en conjunto puede ser laborioso. En general, se necesitan aproximadamente 350 horas-persona para procesar alrededor de 3.500 moscas desde el huevo hasta el adulto. Con práctica, las personas pueden mejorar considerablemente sus tiempos de manipulación de las moscas, y este procedimiento puede utilizarse para medir otras características morfológicas, lo que permite estimar relaciones adicionales de escalamiento morfológico.

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Aquí describimos un método para reducir el tamaño de los embriones de pez cebra sin interrumpir los procesos normales de desarrollo. Esta técnica permite el estudio de la escala del patrón y la robustez del desarrollo contra el cambio de tamaño.

Reducción de tamaño quirúrgico del pez cebra para el estudio de la escala de patrón embrionario

Los productos químicos disruptores endocrinos (EDC) representan un problema grave para los organismos y para los entornos naturales. Drosophila melanogaster representa un modelo ideal para estudiar los efectos de la EDC in vivo. Aquí, presentamos métodos para investigar la interrupción endocrina en Drosophila, abordando los efectos de la EDC sobre la fecundidad, fertilidad, tiempo de desarrollo, y la vida útil de la mosca.

Métodos para probar la interrupción endocrina en Drosophila melanogaster

Aquí, se presenta un protocolo para la implementación de microscopía de expansión en embriones tempranos de Drosophila para lograr imágenes de superresolución utilizando un microscopio confocal convencional de barrido láser.

Uso de microscopía de expansión para agrandar físicamente embriones de Drosophila de montaje completo para obtener imágenes de superresolución

Aquí, presentamos un flujo de trabajo rápido y de bajo costo para obtener imágenes de alta resolución de ojos de Drosophila adultas para cuantificar los patrones y los defectos de crecimiento. Describimos nuestro protocolo para la preparación de muestras mediante montaje en punto, adquisición de imágenes de alta resolución y análisis de imágenes.

Un flujo de trabajo rápido y sencillo para la cuantificación de estructuras externas de Drosophila adulta

Describimos un método de constricción física para producir mini embriones a partir de embriones de Xenopus laevis de 1 célula.

Manipulación física para generar embriones de Xenopus Mini

Métodos experimentales para la Ingeniería de Tejidos

Aprende a estimar relaciones de escala morfológica en Drosophila mediante manipulación dietética que amplía la variación de tamaño corporal. Este método permite analizar cómo el tamaño del ala escala con el tamaño del cuerpo en insectos.

La manipulación experimental del tamaño del cuerpo para la estimación de las relaciones morfológicas de escala en Drosophila /em (Video) | JoVE Journal

La manipulación experimental del tamaño del cuerpo para la estimación de las relaciones morfológicas de escala en Drosophila

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