Hiperinsulinémico euglucémico abrazaderas en ratones conscientes, sin freno

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar la acción de la insulina específica de todo el cuerpo y el tejido en ratones conscientes no estresados sin manipularlos. Esto se logra mediante la implantación quirúrgica de un catéter en la vena yugular para infusiones y otro en la arteria carótida para obtener muestras de sangre. Después de un período de recuperación de cinco a siete días, los ratones que han estado en ayunas durante cinco horas reciben insulina para lograr la hiperinsulinemia fisiológica.

A continuación, se miden los niveles de glucosa desde el catéter arterial y la glucemia U se mantiene ajustando la tasa de infusión de glucosa. Este experimento permite medir las diferencias en la sensibilidad a la insulina de todo el cuerpo a partir de la relación directa entre la tasa de infusión de glucosa necesaria para mantener la glucemia U y la acción de la insulina. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes para la toma de muestras de sangre, como el corte de la cola, es que el catéter arterial que se implanta quirúrgicamente nos da acceso vascular al ratón para que podamos obtener muestras de sangre sin tener que manipular el ratón.

Esto nos permite realizar estos experimentos con ratones no estresados y sin restricciones. El catéter arterial se fabrica insertando una pieza biselada de tubo de PE 10 en una pieza de tubo astical de seis centímetros, de modo que el PE 10 se extiende 0,9 centímetros desde el sel. El catéter venoso es una pieza de tubo SEL con collar de seis centímetros.

La masa se construye insertando tres piezas de centímetros de PE 20 en cada uno de los dos conectores de acero inoxidable de calibre 25 de 1,3 centímetros, Ben, en un ángulo aproximado de 120 grados. Estos se insertan en una cucharada de adhesivo de silicona médica como se muestra aquí: Para comenzar la implantación del catéter, coloque un ratón anestesiado sobre una superficie de trabajo limpia utilizando una técnica estéril. Haz una incisión de cinco milímetros a la derecha de la línea media.

Aislar la vena yugular derecha. Ligar cuidadosamente el cefálico, terminar con una sutura de seda y atar sin apretar otro trozo de sutura en el extremo del codal. A continuación, corte justo debajo de la ligadura cefálica con unas tijeras de resorte e inserte el catéter hasta el cordón de sujeción.

Ate una sutura detrás de la cuenta y confirme que el catéter toma muestras conectando el extremo libre del catéter a una jeringa de muestreo. Para colocar el catéter arterial, haga una pequeña incisión, de cinco milímetros a la izquierda del esternón y cefálica hasta la primera incisión. Aislar la arteria carótida izquierda, luego ligar la cefálica.

Terminar con una sutura de seda y hacer un nudo sin apretar. Otra pieza de sutura en el extremo causal del vaso expuesto. A continuación, sujete el extremo del copo de la embarcación.

Y corta justo debajo del extremo ligado con unas tijeras de resorte. Inserte con cuidado el catéter hasta la pinza. Suelte con cuidado la pinza y avance el catéter hasta la unión Astic P.

Ate las ligaduras de forma segura al catéter y confirme que el catéter toma muestras conectando el extremo libre del catéter a una jeringa de muestreo. A continuación, voltee al animal y haga una pequeña incisión entre el túnel de los omóplatos, una aguja de calibre 14 debajo de la piel desde las incisiones en la parte delantera hasta esta incisión en la parte posterior. Pase los catéteres a través de la aguja para exteriorizarlos en la parte posterior del ratón.

Conecte los catéteres arteriales y venosos a los conectores apropiados en la antena del mouse para el acceso de muestreo o masa. A continuación, inserte la masa en la incisión entre los omóplatos. Cierre ambas incisiones con sutura de nylon.

Confirmar la permeabilidad de ambos catéteres. Coloque el ratón en una jaula cálida y limpia para su recuperación y permita que se recupere durante al menos cinco días antes de la pinza de insulina. El paso más difícil para realizar un pinzamiento hiperinsulinémico de U glucémico en ratones es tratar de mantener la glucemia U.

Los ratones tienen un metabolismo muy rápido y sus niveles de glucosa pueden cambiar apreciablemente durante la duración del experimento. Lo que esto requiere es algo de práctica para desarrollar una idea de cómo cambiarán los niveles de glucosa de un ratón a lo largo de un experimento, y luego cómo ajustar la tasa de infusión de glucosa para mantener la glucemia U. Aquí se muestra la configuración de una abrazadera estándar.

Tres ochos infundidos, glucosa, insulina y eritrocitos lavados están unidos a un conector de cuatro vías conectado a un eslabón giratorio y suspendido sobre el ratón. El puerto de infusión del eslabón giratorio está conectado al catéter venoso. Antes de conectar el ratón, rellene todas las ocho líneas de infusión con solución salina.

A continuación, llene la línea de muestreo con solución salina heparinizada. Deje una jeringa con solución salina heparinizada conectada a la parte superior de la jeringa giratoria para aclarar. Comience a ayunar ratones de cinco a seis horas antes del inicio del pinzamiento.

Estudie tres horas en ayunas, pese al ratón y conecte los catéteres venosos y arteriales a las líneas de infusión y muestreo, respectivamente. 15 minutos antes del inicio de la pinza, inserte un goteo de glucosa en blanco en un glucómetro de mano. A continuación, extraiga aproximadamente 50 microlitros de sangre en la jeringa de limpieza para eliminar la solución salina de la vía y desprenda la jeringa de limpieza.

Mida el nivel de glucosa en sangre tocando la tira de glucosa con la gota de sangre que se forma en el extremo del tubo. A continuación, inserte una jeringa con una aguja roma en la línea de muestreo y extraiga 50 microlitros de sangre. Dispense la sangre en un tubo recubierto de EDTA y centrifugue el tubo para recolectar el plasma para mediciones de hormonas basales y metabolitos.

En este punto, vuelva a insertar la jeringa de limpieza y extraiga el émbolo. Para eliminar las burbujas de aire, vuelva a infundir los 50 microlitros de sangre que se extrajeron originalmente. Anote el valor de glucosa en sangre del glucómetro.

10 minutos después, use el glucómetro y la jeringa de limpieza para repetir la medición de glucosa en sangre y luego extraiga otros 50 microlitros de sangre para obtener otra muestra de plasma. Después de tomar las mediciones de la segunda línea de base, llene las líneas de infusión de glucosa, insulina y eritrocitos lavados con solución salina hasta el conector de cuatro vías. Conecte el conector de cuatro vías al tubo conectado al puerto de infusión giratorio.

Comience por infundir los eritrocitos lavados con solución salina. Establezca la velocidad de infusión para reemplazar el volumen total de sangre que se muestrea durante la duración del estudio. Una vez que la infusión de eritrocitos llega al ratón, se comienzan las infusiones de insulina y glucosa.

Es decir, el tiempo es igual a cero minutos. La insulina se infunde a una tasa constante predeterminada. La tasa inicial de infusión de glucosa se calcula en función de los niveles basales de glucosa en sangre y la experiencia previa.

Durante las próximas dos horas, tome lecturas de glucosa en sangre con el glucómetro y ajuste la velocidad de infusión de glucosa para mantener la glucemia objetivo u A intervalos de 10 minutos, registre las nuevas lecturas de glucosa y las tasas de infusión de glucosa a 100 minutos y 120 minutos, recoja sangre adicional para la medición de la insulina plasmática y cualquier otra hormona o metabolito. Aquí se muestra el curso temporal de los niveles de glucosa a lo largo del procedimiento de pinzamiento, lo que demuestra lo bien que se mantuvo la glucemia U tanto en ratones alimentados con comida como en ratones alimentados con alto contenido de grasa durante todo el pinzamiento. Un curso temporal de la tasa de infusión de glucosa muestra que la tasa necesaria para mantener la glucemia es significativamente menor en el grupo alimentado con alto contenido de grasa, lo que indica un deterioro en la acción de la insulina en todo el cuerpo.

Tanto los niveles de insulina en ayunas como los de pinzamiento también son más altos en el grupo alimentado con alto contenido de grasa, lo que respalda aún más la presencia de un fenotipo resistente a la insulina. En estos ratones, la glucosa tritiada se utiliza para estimar la tasa de aparición de glucosa endógena. Endo a un índice de producción de glucosa hepática, mientras que la insulina suprime completamente el endo A en ratones control.

La supresión se ve afectada en ratones alimentados con una dieta alta en grasas. Del mismo modo, la glucosa TRID se utiliza para estimar la tasa de desaparición de glucosa en todo el cuerpo. La capacidad de la insulina para estimular la RD se ve comprometida en los ratones alimentados con una dieta alta en grasas.

Se utilizan dos desoxiglucosa que contienen carbono 14 para evaluar el índice metabólico de glucosa RG, una medida de la absorción de glucosa específica de los tejidos. Como se ve en este ejemplo, la absorción de glucosa estimulada por insulina en el músculo esquelético se ve afectada en ratones alimentados con una dieta alta en grasas. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con la microcirugía necesaria para implantar los catéteres arteriales y venosos.

La cirugía requiere habilidades muy especializadas y necesita una práctica constante durante varios meses para llegar a ser muy hábil en la cirugía de la pinza glucémica U hiperinsulinémica, la dificultad nuevamente es tratar de mantener la glucemia U en un modelo animal con un metabolismo muy alto.