Hiperinsulinémico euglucémico abrazaderas en ratones conscientes, sin freno

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar la acción de la insulina a nivel corporal completo y específico de tejidos en ratones conscientes y sin estrés, sin manipularlos. Esto se logra mediante la implantación quirúrgica de un catéter en la vena yugular para infusiones y otro en la arteria carótida para obtener muestras de sangre. Después de un período de recuperación de cinco a siete días, se infunde insulina en ratones ayunados durante cinco horas para alcanzar una hiperinsulinemia fisiológica.

Los niveles de glucosa se miden entonces a partir del catéter arterial, y la glucemia basal se mantiene ajustando la velocidad de infusión de glucosa. Este experimento permite medir las diferencias en la sensibilidad a la insulina a nivel corporal completo, basándose en la relación directa entre la velocidad de infusión de glucosa necesaria para mantener la glucemia basal y la acción de la insulina. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes para obtener muestras de sangre, como cortar la cola, es que el catéter arterial implantado quirúrgicamente nos proporciona acceso vascular al ratón, lo que nos permite obtener muestras de sangre sin necesidad de manipular al animal.

Esto nos permite realizar estos experimentos con ratones sin estrés y sin restricciones. El catéter arterial se fabrica insertando un trozo de tubo PE 10 con bisel en un trozo de tubo astic de seis centímetros, de modo que el PE 10 sobresalga 0,9 centímetros desde el sel. El catéter venoso es un trozo de tubo SEL de seis centímetros con collarín.

La masa se construye insertando trozos de tres centímetros de PE 20 en cada uno de los dos conectores de acero inoxidable de calibre 25 y 1,3 centímetros, Ben, formando un ángulo aproximado de 120 grados. Estos se insertan en una gota de adhesivo de silicona médica como se muestra aquí. Para comenzar la implantación del catéter, coloque un ratón anestesiado sobre una superficie de trabajo limpia utilizando técnica estéril. Haga una incisión de cinco milímetros a la derecha de la línea media.

Aislar la vena yugular derecha. Ligar cuidadosamente la cefálica, terminando con sutura de seda, y atar sueltamente otra porción de sutura en el extremo caudal. A continuación, cortar justo por debajo de la ligadura cefálica con tijeras de resorte e insertar el catéter hasta la estrangulación de sujeción.

Ate un hilo de sutura detrás del gránulo y confirme que el catéter muestrea conectando el extremo libre del catéter a una jeringa de muestreo. Para colocar el catéter arterial, realice una pequeña incisión, cinco milímetros a la izquierda del esternón y cefálica respecto a la primera incisión. Aísle la arteria carótida izquierda y luego ligue la porción cefálica.

Finalice con sutura de seda y haga un nudo suelto. Coloque otro trozo de sutura en el extremo causal del vaso expuesto. A continuación, sujete con pinza el extremo caudal del vaso.

Corte justo debajo del extremo ligado con tijeras de resorte. Inserte cuidadosamente el catéter hasta el pinza. Suelte cuidadosamente la pinza y avance el catéter hasta la unión de Astic P.

Amarre las ligaduras firmemente al catéter y confirme que el catéter permite el muestreo conectando el extremo libre del catéter a una jeringa de muestreo. A continuación, dé la vuelta al animal y realice una pequeña incisión entre los omóplatos para crear un túnel, utilizando una aguja de calibre 14 bajo la piel desde las incisiones del frente hasta esta incisión en la parte trasera. Pase los catéteres a través de la aguja para exteriorizarlos en la espalda del ratón.

Conecte los catéteres arterial y venoso a los conectores correspondientes en la antena del ratón para obtener acceso de muestreo o para insertar el masa. A continuación, inserte el masa en la incisión entre los omóplatos. Cierre ambas incisiones con sutura de nylon.

Confirme la permeabilidad de ambos catéteres. Coloque el ratón en una jaula limpia y cálida para su recuperación y permita que el ratón se recupere durante al menos cinco días antes del clamp de insulina. El paso más difícil al realizar un clamp hiperglucémico e hiperinsulinémico en ratones consiste en tratar de mantener la glucemia en niveles elevados.

Los ratones tienen un metabolismo muy rápido y sus niveles de glucosa pueden cambiar considerablemente durante la duración del experimento. Lo que se requiere es algo de práctica para desarrollar una sensación de cómo cambiarán los niveles de glucosa de un ratón a lo largo de un experimento, y luego cómo ajustar la tasa de infusión de glucosa para mantener la glucemia constante. La configuración para una sujeción estándar se muestra aquí.

Tres líneas de infusión, con glucosa, insulina y eritrocitos lavados, se conectan a un conector de cuatro vías unido a un conector giratorio suspendido sobre el ratón. El puerto de infusión del conector giratorio se conecta al catéter venoso. Antes de conectar el ratón, llene todas las líneas de infusión con solución salina.

A continuación, llene la línea de muestreo con suero salino heparinizado. Deje una jeringa con suero salino heparinizado conectada a la parte superior del conector giratorio, la jeringa de purga. Comience a ayunar a los ratones entre cinco y seis horas antes del inicio del clamp.

Transcurridas tres horas de ayuno, pese el ratón y conecte los catéteres venoso y arterial a las líneas de infusión y muestreo, respectivamente. 15 minutos antes del inicio del clamp, inserte una gota de glucosa en blanco en un glucómetro portátil. A continuación, aspire aproximadamente 50 microlitros de sangre en la jeringa de purga para eliminar cualquier solución salina de la línea y desconecte la jeringa de purga.

Mida el nivel de glucosa en sangre tocando la tira reactiva con la gota de sangre que se forma al extremo del tubo. A continuación, inserte una jeringa con aguja roma en la línea de muestreo y aspire 50 microlitros de sangre. Deposite la sangre en un tubo recubierto con EDTA y centrifugue el tubo para recoger el plasma destinado a las mediciones de hormonas y metabolitos basales.

En este momento, vuelva a insertar la jeringa de purga y tire del émbolo. Para eliminar las burbujas de aire, reinfunda los 50 microlitros de sangre que se extrajeron inicialmente. Anote el valor de glucosa en sangre obtenido del glucómetro.

Diez minutos después, utilice el glucómetro y la jeringa de limpieza para repetir la medición de glucosa en sangre y luego extraiga otros 50 microlitros de sangre para obtener otra muestra de plasma. Después de tomar las segundas mediciones basales, llene las líneas de infusión de glucosa, insulina y eritrocitos lavados con suero salino hasta el conector de cuatro vías. Conecte el conector de cuatro vías al tubo unido al puerto de infusión con colector giratorio.

Comience infundiendo los eritrocitos lavados con solución salina. Ajuste la velocidad de infusión para reemplazar el volumen total de sangre muestreada durante la duración del estudio. Una vez que la infusión de eritrocitos alcance al ratón, inicie las infusiones de insulina y glucosa.

Este es el tiempo igual a cero minutos. Se infunde insulina a una tasa constante predeterminada. La tasa inicial de infusión de glucosa se estima en función de los niveles basales de glucosa en sangre y la experiencia previa.

En las próximas dos horas, tome lecturas de glucosa en sangre con el glucómetro y ajuste la velocidad de infusión de glucosa para mantener la euglucemia objetivo. Registre cada 10 minutos las nuevas mediciones de glucosa y las velocidades de infusión de glucosa a los 100 y 120 minutos, y recoja sangre adicional para la medición de insulina plasmática y cualquier otra hormona o metabolito. Aquí se muestra la evolución temporal de los niveles de glucosa durante todo el procedimiento del clamp, lo que demuestra qué tan bien se mantuvo la euglucemia tanto en ratones alimentados con dieta estándar como en ratones alimentados con dieta rica en grasas. La evolución temporal de la velocidad de infusión de glucosa muestra que la velocidad necesaria para mantener la euglucemia es significativamente menor en el grupo alimentado con dieta rica en grasas, lo que indica un deterioro en la acción sistémica de la insulina.

Tanto los niveles de insulina en ayunas como durante la prueba de bloqueo son también más altos en el grupo alimentado con alta grasa, lo que refuerza aún más la presencia de un fenotipo resistente a la insulina. En estos ratones, se utiliza glucosa tritiada para estimar la tasa de aparición endógena de glucosa. Endo a es un índice de la producción hepática de glucosa, mientras que la insulina suprime completamente el endo A en ratones control.

La supresión está deteriorada en ratones alimentados con una dieta alta en grasas. De manera similar, la glucosa TRID se utiliza para estimar la velocidad de desaparición de glucosa en todo el cuerpo. Rd, la capacidad de la insulina para estimular RD está comprometida en ratones alimentados con una dieta alta en grasas.

Se utiliza dos desoxiglucosa que contiene carbono 14 para evaluar el índice metabólico de glucosa RG, una medida de la captación de glucosa específica del tejido. Como se observa en este ejemplo, la captación de glucosa estimulada por insulina en el músculo esquelético está alterada en ratones alimentados con una dieta alta en grasas. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con la microcirugía necesaria para implantar los catéteres arteriales y venosos.

La cirugía requiere habilidades muy especializadas y necesita práctica constante durante varios meses para dominarla completamente en el modelo de clamp hiperglucémico e hiperinsulinémico; la dificultad, nuevamente, consiste en intentar mantener la glucemia U en un modelo animal con un metabolismo muy elevado.