PDMS fabricación de dispositivos y modificación de la superficie

Me llamo Ken Kotz. Soy investigador posdoctoral en el Bio MAs Resource Center, afiliado al Hospital General de Massachusetts. Mi proyecto de investigación principal consiste en aislar neutrófilos utilizando un dispositivo de captura por afinidad inmunitaria con estructuras microfluídicas.

Utilizamos este dispositivo en cinco hospitales diferentes en todo el país para aislar ARN destinado a análisis genómicos posteriores. Básicamente, se tiene un molde maestro de resistencia fotolitográfica SU-8 sobre silicio. Vamos a verter un elastómero de dos componentes, PDMS, sobre ese molde maestro y el PDMS formará un molde.

Retiramos el molde maestro de su estuche y lo colocamos en una placa de Petri. El molde maestro se fija con cinta en la parte inferior de la placa de Petri. En la balanza pesamos una mezcla de PDMS, agente endurecedor y resina base.

La proporción es una parte de endurecedor por diez partes de resina. Típicamente, para nuestros dispositivos ya recortados, pesamos entre 20 y 30 gramos de resina y entre dos y tres gramos respectivamente de endurecedor. Después de verter tanto el endurecedor como la resina en el pequeño recipiente de plástico, utilizamos un tenedor plástico estándar para mezclarlos bien.

Debe asegurarse de mezclar enérgicamente y doblar la mezcla sobre sí misma para garantizar que el endurecedor se distribuya uniformemente dentro de la resina. Normalmente, controlamos qué tan bien se han mezclado ambos componentes. Al observar la cantidad de burbujas de aire, intentamos obtener una distribución uniforme de pequeñas burbujas de aire en todo el elastómero.

Luego vertemos el PDMS sobre el molde maestro SU-8 que se encuentra en la placa de Petri. Colocamos el molde con el PDMS encima en un frasco de campana al vacío y evacuamos la cámara para desgasificar el aire que hemos mezclado. Por lo general, el proceso de desgasificación tarda de 30 minutos a una hora.

Tras la desgasificación, retiramos los dispositivos de la cámara de vacío y los colocamos en un horno a una temperatura de 65 a 80 grados C. El tiempo mínimo de curado a estas temperaturas es de tres a seis horas. En nuestro laboratorio, normalmente dejamos los dispositivos en el horno durante toda la noche.

Normalmente, utilizamos un bisturí de acero quirúrgico número 11. Realizamos cortes rectos hacia abajo, aproximadamente medio centímetro desde el borde del molde matriz de silicona, y cortamos alrededor del borde de la matriz para formar un disco grande. Separamos el molde de PDMS de la matriz y colocamos el lado con las estructuras hacia arriba en una placa de Petri limpia.

Se retira el molde liberado de la placa de Petri y se coloca sobre una superficie de corte utilizando un cuchillo o un cuchillo montado en un riel lineal. Se seccionan los dispositivos contenidos en el molde. Cada dispositivo seccionado se devuelve luego a la placa de Petri para su posterior procesamiento.

Normalmente, para conectar nuestros dispositivos con fluidos, realizaremos perforaciones en el dispositivo de PDMS. El dispositivo que utilizamos para hacer los orificios es una jeringa estándar de tres milímetros. En la punta de la jeringa de tres milímetros hay una aguja de acero inoxidable con punta roma.

Dentro de la aguja de acero inoxidable hay un alambre que se ajusta al diámetro interno de la aguja. Ese alambre está unido al émbolo de la jeringa. Al tirar del émbolo y retraer la aguja, se puede perforar un orificio o insertar un tapón en el PDMS. Voltee el dispositivo de PDMS y expúlselo presionando el émbolo.

El secreto para utilizar los dispositivos de perforación consiste en mantener el émbolo lo más vertical posible y en no girar en absoluto el dispositivo de perforación. Cuando perfora a través del PDMS, levanta todo el dispositivo, todo el dispositivo de PDMS, con un par de pinzas, lo da vuelta y expulsa el tapón presionando hacia abajo el émbolo. Agarra el tapón con un par de pinzas y lo desecha.

Luego, vuelve a retraer el émbolo, gira el dispositivo nuevamente hacia abajo y saca el dispositivo de corte. Repita este procedimiento hasta que tenga todos los orificios perforados. Para el proceso de unión, unimos nuestros dispositivos de PDMS a portaobjetos de vidrio.

Para nuestros dispositivos, vamos a unir de forma no reversible o a fijar covalentemente el PDMS a portaobjetos de vidrio. Esto se logra colocándolos en un ashing de plasma y exponiéndolos a un plasma de oxígeno reactivo. Los pasos para hacer esto consisten en tomar el dispositivo de PDMS y colocarlo sobre la bandeja del ashing de plasma.

Con las características del dispositivo orientadas hacia arriba, puede utilizar cualquier portaobjetos de microscopio de vidrio estándar. Utilizamos un portaobjetos de microscopio ligeramente más grande, de una pulgada y media, para adaptarlo a nuestro dispositivo. Pueden usarse directamente tras sacarlos del paquete.

Preferimos tratarlos con una solución piraña. Esto elimina cualquier contaminante orgánico que pueda estar presente en la superficie del portaobjetos de vidrio. Después de colocar el dispositivo y el portaobjetos sobre la bandeja del plasma ashing, deslice la bandeja dentro del plasma ashing y expóngalos al plasma de oxígeno reactivo.

Tras finalizar el programa del ashing de plasma, abrimos la cámara y retiramos la placa con nuestros dispositivos hacia la bancada. Utilizando pinzas, levantamos cuidadosamente el dispositivo de PDMS, teniendo cuidado de no tocar las superficies de unión con los dedos. Giramos el lado de unión hacia abajo sobre el vidrio, sobre la laminilla de vidrio, y luego verificamos que no haya burbujas de aire entre el PDMS y la laminilla de vidrio.

Colocamos el dispositivo de PDMS, ahora unido al vidrio, sobre una placa calefactora a 65-75 grados C durante 10 minutos para lograr un enlace químico más fuerte. En esta parte, en esta sección, vamos a modificar químicamente las superficies del PDMS en el vidrio tras la unión en la sala limpia; como resultado, obtenemos una superficie de PDMS que presenta grupos OL reactivos en la superficie. Esta superficie reactiva es hidrofílica y eventualmente difundirá hacia el interior del PDMS.

Por lo tanto, la química superficial se realiza mejor inmediatamente después del tratamiento con plasma; vamos a utilizar una solución al 5% de un mecapto. Es un tres mecapto, propil, trimetoxi. Es una solución al 5% en volumen, y básicamente lo que hacemos es inyectarla en la entrada y asegurarnos de llenar completamente el dispositivo sin burbujas de aire.

Si hay burbujas de aire, elimínelas con pinzas. Una vez que haya inyectado el slan, déjelo reposar de 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. Típicamente, inyectamos un segundo volumen del slan 10 minutos después de iniciada la reacción.

Entonces, después de que el cilindro haya reaccionado durante aproximadamente media hora, tomaremos, lavaremos todos los dispositivos con tres a cuatro volúmenes del dispositivo de etanol puro. El exceso que expulsemos simplemente lo limpiaremos con una toallita química. Tras enjuagar los dispositivos, los tomamos y los colocamos sobre una placa calefactora, que está ajustada a cien grados C, y básicamente permitiremos que el etanol que está dentro se evapore. Esto ayuda a limpiar la superficie de sellado.

Una vez que el dispositivo esté seco, puede almacenarse en un ambiente desecado durante meses o puede tomar el dispositivo y proceder inmediatamente al siguiente paso. Después de que los dispositivos hayan curado, habrán curado con un recubrimiento de silano en ambas superficies, la de vidrio y la de PDMS. El silano es un silano aminopropil con un grupo tiol, el cual reaccionará con nuestro entrecruzador heterobifuncional, que es GMBS.

Se diluye en etanol puro. Es reactivo al agua, por lo que debe tener cuidado de no exponerlo a condiciones acuosas. Lo inyectamos en los dispositivos y eliminamos cualquier burbuja de aire con pinzas, como estoy haciendo aquí, para asegurarnos de que todas las superficies queden revestidas con esta molécula.

Lo cubrimos y dejamos que reaccione durante media hora. Después de que el GMBS haya reaccionado durante media hora, vamos a lavar los dispositivos con agua desionizada para eliminar cualquier rastro de etanol presente en ellos. Luego, haremos pasar neu travain, que es una proteína de unión a biotina.

La neu travaina se pre-diluye entonces a una concentración de 10 microgramos por mil. Si, por accidente, se inyecta aire en el dispositivo, será necesario volver a lavar el dispositivo con etanol para eliminar eficazmente todo el aire; el etanol humedece mejor las superficies del dispositivo y permite eliminar cualquier burbuja de aire que se haya introducido accidentalmente en él. Y una vez que los dispositivos se han lavado con agua ionizada, normalmente llenamos el dispositivo con dos a cuatro volúmenes del dispositivo de la solución diluida de neu travaina T neutra.

El Nutt travain reaccionará con el GMBS, que se inmoviliza sobre la superficie mediante cualquier método primario en el Nutt travain. Este proceso puede realizarse a temperatura ambiente durante una hora. Normalmente, coloco los dispositivos en la cámara frigorífica a cuatro grados C durante la noche.

Antes de añadir el anticuerpo, sin embargo, queremos eliminar cualquier Aden libre en solución. Y lo hacemos pasando una solución al 1% de BSA diluida en PBS. Dado que estas placas se utilizarán para análisis genómicos posteriores, todas las soluciones que usamos son libres de ARN.

Normalmente, lo que hacemos es lavar el dispositivo con cuatro a cinco volúmenes de la solución de BSA al 1 %. Y posteriormente, agregamos nuestro anticuerpo. El anticuerpo para este experimento es CD66b y anticuerpos específicos para granulocitos en sangre total.

Utilizamos una concentración que varía entre 10 y 25 microgramos por mil, e inyectaremos el anticuerpo. Inyectaremos 200 microlitros de anticuerpo en cada dispositivo. Realizaremos dos inyecciones de cien microlitros cada una, una en cada puerto del dispositivo.

Normalmente, inyectaremos cien microlitros en un puerto y esperaremos 30 minutos para inyectar otros cien microlitros adicionales en el puerto opuesto.