Name: Flash fotólisis de compuestos enjaulados en los cilios de las neuronas sensoriales olfativas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Aprende fotólisis flash de compuestos enjaulados en cilios de neuronas sensoriales olfativas de ratón usando patch-clamp. Este método permite estudiar la transducción de señales olfativas con control temporal preciso.

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<ol><li>Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caged+compounds%3A+photorelease+technology+for+control+of+cellular+chemistry+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology.</a> Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).</li>
<li>Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+nucleotide-gated+ion+channels+in+sensory+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction.</a> FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).</li>
<li>Bozza, T. C., Kauer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+response+properties+of+convergent+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons.</a> J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).</li>
<li>Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+and+Ultrafast+Phototriggers+for+cAMP+and+cGMP+by+Using+Long-Wavelength+UV%2FVis-Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).</li>
<li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).</li>
<li>Rapp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+lamp-based+irradiation+of+caged+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Flash lamp-based irradiation of caged compounds.</a> Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).</li>
<li>Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGurney%2C+AM+%22Microelectrodes%3A+Theory+and+Applications%22">Microelectrodes: Theory and Applications</a>. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. , Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).</li>
<li>Lagostena, L., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+recordings+and+photolysis+of+caged+compounds+in+olfactory+sensory+neurons+isolated+from+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse.</a> Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).</li>
<li>Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+adaptation+in+mouse+olfactory+sensory+neurons+does+not+require+the+activity+of+phosphodiesterase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase.</a> J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).</li>
<li>Boccaccio, A., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+development+of+cyclic+nucleotide-gated+and+Ca2%2B+-activated+Cl-+currents+in+isolated+mouse+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons.</a> J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).</li>
<li>Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+concentration+jumps+reveal+dynamic+ion+selectivity+of+calcium-activated+chloride+currents+in+mouse+olfactory+sensory+neurons+and+TMEM16B-transfected+HEK+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells.</a> J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).</li>
<li>Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+and+Functional+Analysis+of+Ion+Channels+Heterologously+Expressed+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells.</a> J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).</li>
<li>Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Responses+of+Mouse+Olfactory+Sensory+Neurons+Using+the+Air-phase+Electroolfactogram+Recording%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording.</a> J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).</li>
<li>Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+photolysis+using+a+light+emitting+diode%3A+an+efficient%2C+compact%2C+and+affordable+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Calcium%22%5BJournal%5D)">Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution.</a> Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Flash fotólisis de compuestos enjaulados en combinación con patch-clamp grabaciones es una técnica útil para obtener saltos rápidos y locales en la concentración de las moléculas fisiológicamente activas, tanto dentro como fuera de las células. Existen varios tipos de compounds1 enjaulados han sido sintetizados, y esta técnica se puede aplicar a diferentes tipos de células, incluyendo células cultivadas que expresan canales iónicos que pueden ser activadas o modulada por fotólisis de algunos de los compuestos disponible...

<table border="1"><tbody><tr><th> Equipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Adaptador de módulo de lámpara de flash a microscopio </td><td> Rapp optoelectrónica </td><td> FlashCube 70 </td><td></td></tr><tr><td> Aire mesa </td><td> TMC </td><td> MICRO-63-534 g </td><td></td></tr><tr><td> Digitalizador </td><td> Axon Instruments </td><td> Digidata 1322A </td><td></td></tr><tr><td> Software de Adquisición de Datos </td><td> Axon Instruments </td><td> pCLAMP 8 </td><td></td></tr><tr><td> Software de análisis de datos </td><td> WaveMetrics </td><td> Igor </td><td></td></tr><tr><td> Espejo para el módulo de adaptador </td><td> Rapp optoelectrónica </td><td> M70/100 </td><td></td></tr><tr><td> Portaelectrodos </td><td> Axon Instruments </td><td> 1-HL-U </td><td></td></tr><tr><td> Jaula de Faraday </td><td> Una medida que se </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cubo de filtro </td><td> Olimpo </td><td> U-UTH </td><td> Filtro de excitación eliminado </td></tr><tr><td> Lámpara de flash </td><td> Rapp optoelectrónica </td><td> JML-C2 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzas Dumont # 55 </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 14099 </td><td></td></tr><tr><td> Capilares de vidrio </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> PG10165-4 </td><td></td></tr><tr><td> Vidrio placa inferior </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> FD35-100 </td><td></td></tr><tr><td> Iluminador </td><td> Olimpo </td><td> Resalte 3100 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio invertido </td><td> Olimpo </td><td> IX70 </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipuladores </td><td> Luigs y Neumann </td><td> SM I </td><td></td></tr><tr><td> Micropipeta Extractor </td><td> Narishige </td><td> PP-830 </td><td></td></tr><tr><td> Monitor </td><td> HesaVision </td><td> MTB-01 </td><td></td></tr><tr><td> Filtros de densidad neutra </td><td> Omega Optical </td><td> varía </td><td></td></tr><tr><td> Objetivo 100X </td><td> Zeiss </td><td> Fluar 440285 </td><td> Ya sea Zeiss o Olympus </td></tr><tr><td> Objetivo 100X </td><td> Olimpo </td><td> UPLFLN 100XOI2 </td><td> Ya sea Zeiss o Olympus </td></tr><tr><td> Óptica UV filtro paso corto </td><td> Rapp optoelectrónica </td><td> SP400 </td><td></td></tr><tr><td> Patch-clamp amplificador </td><td> Axon Instruments </td><td> Axopatch 200B </td><td></td></tr><tr><td> Foto Asamblea Diodo </td><td> Rapp optoelectrónica </td><td> PDA </td><td></td></tr><tr><td> Guía de luz de cuarzo </td><td> Rapp optoelectrónica </td><td> varía </td><td> Nosotros utilizamos 600 m de diámetro </td></tr><tr><td> Alambre de plata </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> AGT1025 </td><td></td></tr><tr><td> Plata baja de pellets </td><td> Warner instrumentos </td><td> 64-1309 </td><td></td></tr><tr><td> Lámpara de arco de xenón </td><td> Rapp optoelectrónica </td><td> XBL-JML </td><td></td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><th> Reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> BCMCM-jaula AMPc </td><td> Biolog </td><td> B016 </td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino (BSA) </td><td> Sigma </td><td> A8806 </td></tr><tr><td> CaCl2 solución estándar de 0,1 M </td><td> Fluka </td><td> 21059 </td></tr><tr><td> Caged Ca: DMNP-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> D6814 </td></tr><tr><td> Cisteína </td><td> Sigma </td><td> C9768 </td></tr><tr><td> Concanavalina A de tipo V (ConA) </td><td> Sigma </td><td> C7275 </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> Sigma </td><td> C4036 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> DNAsa I </td><td> Sigma </td><td> D4527 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E9884 </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E4378 </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> Sigma </td><td> G5767 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P3911 </td></tr><tr><td> KOH </td><td> Sigma </td><td> P1767 </td></tr><tr><td> Leupeptina </td><td> Sigma </td><td> L0649 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> Fluka </td><td> 63020 </td></tr><tr><td> Papaína </td><td> Sigma </td><td> P3125 </td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma </td><td> P1274 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S9888 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td></tr><tr><td> NaPyruvate </td><td> Sigma </td><td> P2256 </td></tr></tbody></table>

flash fotólisis de compuestos enjaulados en los cilios de las neuronas sensoriales olfativas

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Fotólisis de compuestos enjaulados permite la producción de aumentos rápidos y localizados en la concentración de diversos compuestos fisiológicamente activos 1. Compuestos enjaulados son moléculas hechas fisiológicamente inactivo por una jaula de sustancia química que puede ser rota por un destello de luz ultravioleta. Aquí, se muestra cómo obtener el patch-clamp grabaciones en combinación con la fotólisis de compuestos enjaulados para el estudio de la transducción olfativa en disociada del ratón neuronas sensoriales olfativas. El proceso de transducción olfativa (Figura 1) lleva a cabo en los cilios de las neuronas sensoriales olfativas, que une a los receptores odorantes conduce al aumento de AMPc que se abre de nucleótidos cíclicos-dependientes (GNC) 2 canales. Entrada de Ca a través de los canales de GNC activa Ca-Cl canales activados. Mostramos cómo disociar las neuronas del epitelio olfatorio de ratón 3 y la forma de activar los canales de GNC o Ca-Cl canales activados por fotólisis de AMPc jaula de 4 o 5 jaulas Ca &lt;/ Sup&gt;. Nosotros utilizamos una lámpara de flash 6,7 aplicar destellos ultravioleta a la región ciliar a desenjaular cAMP o Ca, mientras patch-clamp grabaciones se toman para medir la corriente en el conjunto de células voltaje-clamp configuración 08/11.

Fotólisis de compuestos enjaulados permite la producción de aumentos rápidos y localizados en la concentración de diversos compuestos fisiológicamente activos. Aquí, se muestra cómo obtener el patch-clamp grabaciones en combinación con la fotólisis de AMPc jaula o jaulas Ca para el estudio de la transducción olfativa en disociada del ratón neuronas sensoriales olfativas.

Flash fotólisis de compuestos enjaulados en los cilios de las neuronas sensoriales olfativas

La fotólisis de compuestos enjaulados permite producir incrementos rápidos y localizados en la concentración de diversos compuestos fisiológicamente activos1. ...

Nuestro sentido del olfato nos permite detectar y reconocer sustancias químicas volátiles en el entorno externo. Los olores se unen a receptores en el epitelio de las neuronas sensoriales olfativas y activan una cascada de transducción que conduce a la apertura de canales activados por nucleótidos cíclicos, seguida por canales de cloruro activados por calcio. El objetivo general de este procedimiento es mostrar cómo activar directamente estos canales mediante un destello de luz sobre compuestos encageados; los compuestos encageados son moléculas que se vuelven fisiológicamente inactivas debido a una estructura química protectora.Un destello de luz ultravioleta rompe una cápsula y libera el compuesto fisiológicamente activo atrapado. Cycl, mp o calcio encapsulado se incluyen en la solución intracelular, que llena una pipeta de registro y se difunde hacia el compartimento de las neuronas sensoriales olfativas. Se aplica un destello ultravioleta a la región Cary para activar un cycl, mp o calcio mientras se realizan registros mediante la técnica de parche fijo para medir la corriente en configuración de voltaje fijo en toda la célula.Hola. Hoy les mostraremos un procedimiento para gra

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Investigación

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Neurociencia

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Aprende fotólisis flash de compuestos enjaulados en cilios de neuronas sensoriales olfativas de ratón usando patch-clamp. Este método permite estudiar la transducción de señales olfativas con control temporal preciso.

Flash fotólisis de compuestos enjaulados en los cilios de las neuronas sensoriales olfativas

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