Name: Flash fotólisis de compuestos enjaulados en los cilios de las neuronas sensoriales olfativas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Aprende fotólisis flash de compuestos enjaulados en cilios de neuronas sensoriales olfativas de ratón usando patch-clamp. Este método permite estudiar la transducción de señales olfativas con control temporal preciso.

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<ol><li>Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caged+compounds%3A+photorelease+technology+for+control+of+cellular+chemistry+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology.</a> Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).</li>
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<li>Lagostena, L., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+recordings+and+photolysis+of+caged+compounds+in+olfactory+sensory+neurons+isolated+from+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse.</a> Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).</li>
<li>Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+adaptation+in+mouse+olfactory+sensory+neurons+does+not+require+the+activity+of+phosphodiesterase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase.</a> J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).</li>
<li>Boccaccio, A., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+development+of+cyclic+nucleotide-gated+and+Ca2%2B+-activated+Cl-+currents+in+isolated+mouse+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons.</a> J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).</li>
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<li>Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+and+Functional+Analysis+of+Ion+Channels+Heterologously+Expressed+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells.</a> J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).</li>
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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Flash fotólisis de compuestos enjaulados en combinación con patch-clamp grabaciones es una técnica útil para obtener saltos rápidos y locales en la concentración de las moléculas fisiológicamente activas, tanto dentro como fuera de las células. Existen varios tipos de compounds1 enjaulados han sido sintetizados, y esta técnica se puede aplicar a diferentes tipos de células, incluyendo células cultivadas que expresan canales iónicos que pueden ser activadas o modulada por fotólisis de algunos de los compuestos disponible...

<table border="1"><tbody><tr><th> Equipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Adaptador de módulo de lámpara de flash a microscopio </td><td> Rapp optoelectrónica </td><td> FlashCube 70 </td><td></td></tr><tr><td> Aire mesa </td><td> TMC </td><td> MICRO-63-534 g </td><td></td></tr><tr><td> Digitalizador </td><td> Axon Instruments </td><td> Digidata 1322A </td><td></td></tr><tr><td> Software de Adquisición de Datos </td><td> Axon Instruments </td><td> pCLAMP 8 </td><td></td></tr><tr><td> Software de análisis de datos </td><td> WaveMetrics </td><td> Igor </td><td></td></tr><tr><td> Espejo para el módulo de adaptador </td><td> Rapp optoelectrónica </td><td> M70/100 </td><td></td></tr><tr><td> Portaelectrodos </td><td> Axon Instruments </td><td> 1-HL-U </td><td></td></tr><tr><td> Jaula de Faraday </td><td> Una medida que se </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cubo de filtro </td><td> Olimpo </td><td> U-UTH </td><td> Filtro de excitación eliminado </td></tr><tr><td> Lámpara de flash </td><td> Rapp optoelectrónica </td><td> JML-C2 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzas Dumont # 55 </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 14099 </td><td></td></tr><tr><td> Capilares de vidrio </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> PG10165-4 </td><td></td></tr><tr><td> Vidrio placa inferior </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> FD35-100 </td><td></td></tr><tr><td> Iluminador </td><td> Olimpo </td><td> Resalte 3100 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio invertido </td><td> Olimpo </td><td> IX70 </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipuladores </td><td> Luigs y Neumann </td><td> SM I </td><td></td></tr><tr><td> Micropipeta Extractor </td><td> Narishige </td><td> PP-830 </td><td></td></tr><tr><td> Monitor </td><td> HesaVision </td><td> MTB-01 </td><td></td></tr><tr><td> Filtros de densidad neutra </td><td> Omega Optical </td><td> varía </td><td></td></tr><tr><td> Objetivo 100X </td><td> Zeiss </td><td> Fluar 440285 </td><td> Ya sea Zeiss o Olympus </td></tr><tr><td> Objetivo 100X </td><td> Olimpo </td><td> UPLFLN 100XOI2 </td><td> Ya sea Zeiss o Olympus </td></tr><tr><td> Óptica UV filtro paso corto </td><td> Rapp optoelectrónica </td><td> SP400 </td><td></td></tr><tr><td> Patch-clamp amplificador </td><td> Axon Instruments </td><td> Axopatch 200B </td><td></td></tr><tr><td> Foto Asamblea Diodo </td><td> Rapp optoelectrónica </td><td> PDA </td><td></td></tr><tr><td> Guía de luz de cuarzo </td><td> Rapp optoelectrónica </td><td> varía </td><td> Nosotros utilizamos 600 m de diámetro </td></tr><tr><td> Alambre de plata </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> AGT1025 </td><td></td></tr><tr><td> Plata baja de pellets </td><td> Warner instrumentos </td><td> 64-1309 </td><td></td></tr><tr><td> Lámpara de arco de xenón </td><td> Rapp optoelectrónica </td><td> XBL-JML </td><td></td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><th> Reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> BCMCM-jaula AMPc </td><td> Biolog </td><td> B016 </td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino (BSA) </td><td> Sigma </td><td> A8806 </td></tr><tr><td> CaCl2 solución estándar de 0,1 M </td><td> Fluka </td><td> 21059 </td></tr><tr><td> Caged Ca: DMNP-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> D6814 </td></tr><tr><td> Cisteína </td><td> Sigma </td><td> C9768 </td></tr><tr><td> Concanavalina A de tipo V (ConA) </td><td> Sigma </td><td> C7275 </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> Sigma </td><td> C4036 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> DNAsa I </td><td> Sigma </td><td> D4527 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E9884 </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E4378 </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> Sigma </td><td> G5767 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P3911 </td></tr><tr><td> KOH </td><td> Sigma </td><td> P1767 </td></tr><tr><td> Leupeptina </td><td> Sigma </td><td> L0649 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> Fluka </td><td> 63020 </td></tr><tr><td> Papaína </td><td> Sigma </td><td> P3125 </td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma </td><td> P1274 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S9888 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td></tr><tr><td> NaPyruvate </td><td> Sigma </td><td> P2256 </td></tr></tbody></table>

flash fotólisis de compuestos enjaulados en los cilios de las neuronas sensoriales olfativas

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Fotólisis de compuestos enjaulados permite la producción de aumentos rápidos y localizados en la concentración de diversos compuestos fisiológicamente activos 1. Compuestos enjaulados son moléculas hechas fisiológicamente inactivo por una jaula de sustancia química que puede ser rota por un destello de luz ultravioleta. Aquí, se muestra cómo obtener el patch-clamp grabaciones en combinación con la fotólisis de compuestos enjaulados para el estudio de la transducción olfativa en disociada del ratón neuronas sensoriales olfativas. El proceso de transducción olfativa (Figura 1) lleva a cabo en los cilios de las neuronas sensoriales olfativas, que une a los receptores odorantes conduce al aumento de AMPc que se abre de nucleótidos cíclicos-dependientes (GNC) 2 canales. Entrada de Ca a través de los canales de GNC activa Ca-Cl canales activados. Mostramos cómo disociar las neuronas del epitelio olfatorio de ratón 3 y la forma de activar los canales de GNC o Ca-Cl canales activados por fotólisis de AMPc jaula de 4 o 5 jaulas Ca &lt;/ Sup&gt;. Nosotros utilizamos una lámpara de flash 6,7 aplicar destellos ultravioleta a la región ciliar a desenjaular cAMP o Ca, mientras patch-clamp grabaciones se toman para medir la corriente en el conjunto de células voltaje-clamp configuración 08/11.

Fotólisis de compuestos enjaulados permite la producción de aumentos rápidos y localizados en la concentración de diversos compuestos fisiológicamente activos. Aquí, se muestra cómo obtener el patch-clamp grabaciones en combinación con la fotólisis de AMPc jaula o jaulas Ca para el estudio de la transducción olfativa en disociada del ratón neuronas sensoriales olfativas.

Flash fotólisis de compuestos enjaulados en los cilios de las neuronas sensoriales olfativas

La fotólisis de compuestos enjaulados permite producir incrementos rápidos y localizados en la concentración de diversos compuestos fisiológicamente activos1. ...

Nuestro sentido del olfato nos permite detectar y reconocer sustancias químicas volátiles en el entorno externo. Los olores se unen a receptores en el epitelio de las neuronas sensoriales olfativas y activan una cascada de transducción que conduce a la apertura de canales activados por nucleótidos cíclicos, seguida por canales de cloruro activados por calcio. El objetivo general de este procedimiento es mostrar cómo activar directamente estos canales mediante un destello de luz sobre compuestos encageados; los compuestos encageados son moléculas que se vuelven fisiológicamente inactivas debido a una estructura química protectora.Un destello de luz ultravioleta rompe una cápsula y libera el compuesto fisiológicamente activo atrapado. Cycl, mp o calcio encapsulado se incluyen en la solución intracelular, que llena una pipeta de registro y se difunde hacia el compartimento de las neuronas sensoriales olfativas. Se aplica un destello ultravioleta a la región Cary para activar un cycl, mp o calcio mientras se realizan registros mediante la técnica de parche fijo para medir la corriente en configuración de voltaje fijo en toda la célula.Hola. Hoy les mostraremos un procedimiento para grabaciones de parche de membrana combinado con pulsos de luz de compuestos enjaulados. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar canales activados por CMP y canales de colina activados por calcio en neuronas sensoriales olfativas. Así que comencemos.El sistema de registro de parche de membrana utilizado aquí incluye un microscopio invertido, un sistema de perfusión, un micromanipulador, un electrodo de registro y un electrodo de referencia conectado al cabezal del amplificador de parche de membrana, todo montado sobre una mesa antivibratoria dentro de una jaula de Faraday. El amplificador de parche de membrana está conectado a un digitalizador en el ordenador con software para la adquisición de datos. Para generar un destello de luz ultravioleta de alta intensidad, utilizamos una lámpara de destello Excelon.El destello de luz puede activarse manualmente o mediante la computadora utilizando el mismo software que controla la adquisición electrofisiológica. Las mejores longitudes de onda para experimentos fotónicos se seleccionan insertando un filtro UV en una ranura de salida o en la lámpara de destello. La intensidad del destello de luz puede modificarse cambiando el voltaje o la capacitancia de la lámpara de destello.Un control más preciso de la intensidad luminosa se obtiene colocando filtros de densidad neutra en una segunda ranura de salida de la lámpara de carne. El destello de luz se dirige hacia la neurona cultivada en placas con fondo de vidrio a través de una guía de luz óptica de fibra de cuarzo. La guía de luz está conectada al accesorio de fluorescencia en epí del microscopio invertido.Mediante un adaptador, un cubo de filtro modificado sin filtro de excitación dirige un haz UV hacia la neurona mediante un espejo divisor. La luz se enfoca a través de un objetivo de inmersión en aceite de 100x. El área cubierta por el tejido se visualiza insertando la guía de luz en un iluminador.La imagen se visualiza en un monitor mediante una cámara CCD conectada al microscopio. Se dibuja en el monitor el control del área para localizar la zona de luz UV antes de la disección; prepare tres placas con fondo de vidrio recubiertas con con A y poli. Para preparar la disección, llene dos placas de Petri de 50 milímetros recubiertas con azúcar con solución de Ringer.Colóquelos en hielo. Enfríe también. Mezcle firmemente 0,5 mililitros de la solución de parada y la jeringa que contiene aproximadamente 10 mililitros de solución de Ringer.Comience con el ratón sacrificado. Retire la piel que recubre el cráneo, corte a lo largo de las líneas de la mandíbula y coloque la cabeza en una placa de Petri recubierta de plata. Coloque la placa bajo un microscopio estereoscópico y utilice un escalpelo para realizar un corte sagital.Disecte la cabeza a lo largo de la línea media. Gire la mitad de la cabeza con el lado medial hacia arriba. Retire cuidadosamente el tabique para exponer los terminales.Aquí mostramos una imagen ampliada mientras se elimina el tabique utilizando pinzas número tres en el bisturí. Retire cuidadosamente los extremos revestidos con su epitelio adiposo. Transfiera a otro plato de Petri recubierto de plata utilizando pinzas superfinas número 55 y el bisturí.Separar los fragmentos del epitelio olfatorio del tejido subyacente. Transferir los fragmentos de epitelio olfatorio a un tubo que contenga un mililitro de solución de Ringer sin iones divalentes. Luego añadir la papaína.El uso de tijeras microquirúrgicas implica que el epitelio incube a temperatura ambiente durante tres minutos; a continuación, se mezcla suavemente nuevamente con tijeras microquirúrgicas. Espere cinco minutos adicionales, luego utilice una pipeta Pasteur con punta de gran diámetro pulida con llama para transferir la muestra a un tubo que contenga la solución de paro. Centrifugue durante cinco minutos y deseche el sobrenadante. Añada aproximadamente un mililitro de solución de Ringer filtrada e incube suavemente con una pipeta Pasteur pulida con llama que tenga un diámetro de orificio de aproximadamente un mililitro.Coloque la solución que contiene las células en el centro de tres platos de vidrio. Deje que las células sedimenten durante aproximadamente una hora a cuatro grados Celsius en platos con fondo de vidrio. Luego agregue la solución de Ringer.Trabaje con luz tenue para evitar la degradación de los compuestos de jaula por la luz ambiental. Aplique una gota de aceite de inmersión en el objetivo de 100 x. Coloque un platillo con fondo de vidrio que contenga neuronas sensoriales orales disociadas sobre la platina del microscopio invertido perfu.Con solución de Ringer. Proteja la jeringa que contiene la solución intracelular con compuestos en jaula de la luz mediante papel de aluminio y manténgala refrigerada. Busque una neurona sensorial olfativa aislada con cilios intactos.Mueva la platina del microscopio para posicionar la región Cary dentro del área dibujada en el monitor. Para localizar el área del destello UV, llene una pipeta de registro con solución intracelular que contenga el compuesto enjaulado. Introduzca la pipeta en el soporte de la etapa de la cabeza del amplificador Apache Clamp.Utilizando técnicas estándar de registro por parche. Acérquese al soma de la neurona con una pipeta de parche y obtenga un sello gigaseal. Luego alcance el modo de célula completa en la computadora.Inicie un protocolo de estimulación y registre la respuesta. Un protocolo de estimulación típico mantiene el voltaje en un valor constante y desencadena la liberación de un destello de luz ultravioleta para la lisis del compuesto enjaulado. Ahora le mostraremos algunas grabaciones representativas; aquí se muestra la respuesta de una neurona sensorial aislada de grasa de ratón a la lisis del ciclompc enjaulado.La flecha en la parte superior indica el momento de liberación de un destello UV. Se registró la corriente activada por Cycl MP a menos 60 milivoltios en una solución de Ringer extracelular con bajo contenido de calcio. La fase ascendente de la corriente fue rápida y se ajustó mediante una función exponencial simple.Aquí observamos una grabación del mismo neutrón bañado en una solución normal de Ringer, que contiene un milimolar de calcio. La fase ascendente de la corriente a menos 60 milivoltios se volvió mucho más baja y multifásica. Esto se debe a la acción del calcio que entra en los canales regulados por C de reciclaje P y activa una corriente secundaria de cloruro.En este ejemplo, fijamos el voltaje en +60 milivoltios. Esta es otra forma de reducir la entrada de calcio. La fase ascendente de la respuesta debida a la liberación de ciclona PN a +60 milivoltios se describió adecuadamente mediante una exponencial simple, lo que indica la presencia de un solo componente de corriente.Un ejemplo de las respuestas obtenidas mediante la liberación fotoinducida de calcio dentro del Celia se muestra; esta corriente es transportada por iones cloruro. El voltaje fue de menos 50 milivoltios. Se indujeron respuestas de amplitudes crecientes mediante la liberación fotoinducida de calcio atrapado con destellos de luz ultravioleta de intensidades crecientes.Acabamos de mostrarle cómo realizar grabaciones de neuronas sensoriales de fábrica disociadas al llevar a cabo este procedimiento. Es importante recordar tener mucha paciencia. Gracias por ver este video y buena suerte con el experimento.

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Aprende fotólisis flash de compuestos enjaulados en cilios de neuronas sensoriales olfativas de ratón usando patch-clamp. Este método permite estudiar la transducción de señales olfativas con control temporal preciso.

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