Autólogo de células progenitoras endoteliales-Siembra Tecnología y las pruebas de biocompatibilidad para dispositivos cardiovasculares en el modelo animal de gran

El objetivo general de este experimento consiste en sembrar implantes vasculares con células progenitoras endoteliales derivadas de sangre autóloga y luego observar el efecto de este tratamiento sobre la trombosis en un modelo animal de gran tamaño. Esto se logra obteniendo una muestra de sangre periférica de cerdo para aislar células progenitoras endoteliales porcinas de crecimiento tardío. A continuación, un dispositivo implantable.

El tubo de titanio en nuestro estudio de prueba de principio se implanta con las PC autólogas. A continuación, el dispositivo se implanta en la vena cava inferior del cerdo. Los resultados muestran protección contra la trombosis basada en la permeabilidad del tubo de titanio revestido con EPC, a diferencia del tubo de metal desnudo control que se ocluyó.

La cirugía de Duke se compromete a fomentar una investigación innovadora y pionera. La siguiente presentación es un ejemplo de cómo trabajamos entre departamentos y disciplinas para avanzar en la medicina. El Dr. EK ha estado liderando un esfuerzo de investigación para desarrollar una tecnología de acomodo celular que prevendrá la trombosis revistiendo la superficie de contacto sanguíneo de los dispositivos vasculares con las propias células progenitoras del paciente.

Dado que estas células se han obtenido de los mismos pacientes que recibirán el implante, evitamos el rechazo por parte del sistema inmunológico. Nuestro éxito y los métodos descritos aquí son el resultado de un gran esfuerzo conjunto. La implantación quirúrgica será demostrada por Sean Gage de la sección de cirugía vascular, Whitney Lane, una estudiante de medicina de Duke, y por mí mismo.

Ahora me gustaría presentar a Alexander Janssen, un estudiante de doctorado del Departamento de Ingeniería Biomédica, quien nos guiará a través del proceso de siembra celular en detalle. Demostraré cómo sembrar tubos de titanio con células progenitoras endoteliales derivadas de sangre poco antes de su implantación en un modelo porcino. Este método sirve como prueba de concepto, y los mismos principios básicos pueden aplicarse a muchos otros dispositivos implantables, como stents de nitinol y dispositivos mecánicos de asistencia circulatoria. Las CPE se aíslan sembrando la fracción de células mononucleares de sangre porcina y generalmente aparecen después de aproximadamente siete días.

Se pueden reconocer por su morfología típica en forma de adoquines. Amplíe las EPC hasta un número total de 9 millones de células en cultivo. Lave las EPC preparadas dos veces con medio sin suero, teniendo cuidado de limitar su exposición a la luz durante y después del marcado.

Luego cubra las células con una etiqueta fluorescente, PKH 26, y registre la cantidad de solución aplicada. Incube las células a temperatura ambiente durante cuatro minutos. Detenga la reacción de etiquetado agregando un volumen igual de suero porcino a la solución de colorante un minuto después.

Diluya las soluciones combinadas al uno a uno con medio de crecimiento completo. Luego aspire el líquido y enjuague las células tres veces con medio de crecimiento completo, seguido de dos lavados con DPBS sin cloruro de calcio ni de magnesio. A continuación, cubra las células con tripsina, anotando el volumen utilizado, e incube a 37 grados Celsius.

Después de tres minutos de incubación, utilice microscopía para verificar que las células se hayan desprendido, y en caso afirmativo, agregue el doble de volumen de solución de neutralización de tripsina del que se añadió inicialmente. Agregue tripsina, combine las soluciones celulares en un solo tubo y mida la densidad celular con un hemocitómetro. Por último, centrifugue la suspensión celular para formar un sedimento y resuspenda las células en al menos 4,5 mililitros de medio libre de suero.

Después de preparar al cerdo para la cirugía, haga una incisión en la línea media con una hoja de bisturí número 15 desde el segundo par de glándulas de memoria. Diríjase cranealmente hasta el penúltimo par, utilizando electrocauterización. Lleve la disección hasta la fascia abdominal.

Levante el peritoneo con pinzas mosquito y entré en él cuidadosamente con tijeras Metzenbaum, exteriorice la vejiga urinaria y coloque una sutura en bolsa de nudo con hilo Vicryl 3-0 en la pared de la vejiga. Realice una incisión punzante en su centro e introduzca un catéter Foley de 16 French en la incisión. Luego administre líquidos intravenosos para ajustar el flujo urinario a al menos un mililitro por kilogramo por hora durante la cirugía.

A continuación, exteriorice el intestino delgado ligeramente agrandado y coloque dos retractoras quirúrgicas Bour para exponer la cara posterior de la cavidad peritoneal e identifique la vena cava inferior mediante disección afilada y roma. Libere cuidadosamente la vena cava inferior de los tejidos circundantes. Luego, despegue el vaso desde la arteria renal derecha proximal hasta la bifurcación distal de la vena cava inferior.

Extremar la precaución durante la disección de la VCI, ya que incluso un defecto muy pequeño en la VCI puede provocar una hemorragia rápida y la exsanguinación del animal. Ligar todas las ramas laterales del segmento de la VCI, prestando especial atención a la disección y ligadura de las dos grandes venas lumbares posteriores inmediatamente proximales a la bifurcación de la VCI. A menudo hay una vena lumbar grande en la cara posterior.

Disecar esta vena libremente y controlarla con bucles para vasos. Ahora, paralelamente a la cirugía, comenzar a sembrar el implante con CEP antes de iniciar este procedimiento. Los andamios de asiento tisular de tubo de titanio deben estar completamente ensamblados y listos para usar en un campo estéril.

Abrir el ensamblaje de tubo de titanio esterilizado con gas en una jeringa de cinco cc. Luego retirar el émbolo de la jeringa de cinco cc, pero no desecharlo. Colocar una tapa fija al extremo de la jeringa. Utilizar una pipeta para llenar la jeringa con la suspensión de EPC.

Luego, reemplace el émbolo. Retire la tapa e inserte el extremo del embudo de la jeringa en el tubo de silicona abierto del ensamblaje hasta que quede ajustado, pero sin avanzar más. Elimine cualquier burbuja avanzando lentamente la solución celular hasta que alcance la parte superior de la pieza principal.

Luego, cierre el ensamblaje con una tapa cebo y sujételo con cinta adhesiva en un guante estéril. Introduzca todo el ensamblaje en un soporte mecanizado para jeringas y colóquelo en un incubador a 37 grados Celsius. Utilice un medidor para asegurarse de que las cámaras de asiento estén niveladas y permita que el ensamblaje incube con rotación suave.

Continúe la cirugía justo después de ligar la vena cava inferior administrando 100 unidades de heparina por kilogramo de cerdo. Luego, coloque inmediatamente un clamp sobre la vena cava inferior en un ángulo de 45 grados, distalmente sobre la vena cava inferior y la vena lumbar, y después proximalmente. A continuación, utilice una hoja de bisturí número 11 y tijeras de pot para realizar una venotomía longitudinal de cuatro centímetros entre los clamps proximal y distal.

Evacúe cualquier sangre de la VCI y lave su luz interna con DPBS estéril. A continuación, inserte el implante con EPC asentadas o un control de metal desnudo en la VCI para evitar que las células se sequen y para evacuar el aire. Llene la VCI con DPBS que contenga cloruro de calcio y cloruro de magnesio.

Luego, cierre la venotomía con una sutura continua de prolina 4-0 y retire una pinza proximal para desairear la vena cava inferior mediante un pequeño sangrado de retroceso. Después del sangrado, retire la pinza distal para mantener el implante en su lugar. Coloque una sutura de fijación en el tubo de PVC que atraviesa la pared venosa.

Cierre la fascia con OPDS en una aguja de CT. Cierre el espacio subcutáneo con dos puntos continuos de Vicryl. Luego cierre la piel con grapas.

Administre hasta 20 mililitros de Marcaine al 0,25 % por vía subcutánea a lo largo del sitio de la incisión y cubra la herida con gasa y Tegaderm para aliviar el dolor. Administre flu Nixon y oximorfona por vía subcutánea según sea necesario. Suspender la anestesia y, cuando el cerdo despierte, devuélvalo a su jaula durante los siguientes siete días.

Administre atri cada 24 horas como profilaxis antibiótica y asegúrese de que el parche de fentanilo aplicado antes de la cirugía permanezca adherido durante un total de tres días. Después de tres días, se retiraron los implantes de tubos de titanio colocados y se examinaron las superficies internas. Bajo una longitud de onda de excitación de 550 nanómetros, se encontró una capa confluyente de células marcadas con fluorescencia en otro tubo.

Las células de la sección se tiñeron adicionalmente con un marcador de adhesión de células endoteliales plaquetarias para visualizar los bordes celulares. Se puede utilizar una amplia variedad de coloraciones en este procedimiento. En contraste, un implante de tubo de titanio desnudo se ocluye completamente en el entorno protrombótico de baja tensión de cizallamiento de la vena cava inferior.

Como se ilustra en las imágenes A y C, el tubo de titanio con células adheridas se muestra en la imagen B y permaneció libre de coágulos tras nuestro procedimiento de aislamiento con sangre periférica. Las CEP aparecen tras un promedio de siete días en cultivo. Durante la realización del procedimiento quirúrgico, es muy importante despojar cuidadosa y suavemente de tejido el VCI, ya que incluso la más pequeña desgarro en el VCI o en sus ramas laterales puede provocar una exanguinación del cerdo. Tras este procedimiento, otros materiales en contacto con la sangre pueden ser rápidamente endotelializados para prevenir la trombosis.

Los stents vasculares endoteliales, por ejemplo, con nuestras CEP imitan el revestimiento nativo de la pared del vaso sanguíneo y podrían prevenir la restenosis y la trombosis del stent después de su implantación. Nuestra tecnología Quick See permitirá revestir dispositivos intravasculares con células progenitoras endoteliales derivadas de la sangre del propio paciente en cuestión de minutos, en el quirófano o en el laboratorio de cateterización. Por lo tanto, se evita el prolongado cultivo ex vivo.

Se evita el tiempo en el dispositivo mismo y la tecnología se vuelve práctica para su traslación a la práctica clínica.