Name: Lectina basado en Aislamiento y cultivo de motoneuronas embrionarias de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprende a aislar motoneuronas embrionarias de ratón mediante purificación basada en lectina. Este protocolo mejora la obtención de cultivos enriquecidos para estudiar enfermedades de neuronas motoras.

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Agradecemos a Sandra Bargen para el apoyo técnico excelente. Este trabajo fue apoyado por el departamento de investigación de proteínas (PRD, PT A1.2 (RC y TS), y la investigación RUB Fond, Rektoratsprogramme -. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK), los anticuerpos monoclonales y 39.4D5 F55A10 se obtuvieron a partir del hibridoma Estudios del Desarrollo Bank (DSHB, Iowa City, IA).

Para los reactivos especiales: ver Tab. 1. Todos los demás reactivos se enumeran en la calidad del grado de cultivo de células obtenidas de Sigma Aldrich. 1. PORN-H/laminin recubrimiento de platos / cubreobjetos <ol><li> Prepare una solución de trabajo de 0,5 mg / ml de poli-DL-ornitina bromhidrato (PORN-H) en 150 mM pH de borato 8,35. <ol><li> Una solución stock de 50 mg PORN / 1 ml de tampón borato se pueden preparar con antelación y almacenadas a -20 ° C. </li></ol></li><li> Esterilizar cubreobjetos de vidrio de fuego en el 100% de etanol y dejar secar al aire. </li><li> Cubrir la superficie con suficiente PORN-H solución de la noche a 4 ° C. </li><li> Al día siguiente, lavar tres veces con agua esterilizada y cubreobjetos se seque al aire. </li><li> Prepare una solución de trabajo de 2,5 mg / ml laminina en HBSS <ol><li> Alícuotas pueden ser almacenadas a -20 ° C. Descongelar a 4 º C inmediatamente antes de su uso. </li></ol></li><li> Cubra la superficie de los cubreobjetos PORN-H-cubierto con la solución de laminina y dejar que ellos se incuba durante al menos 2 horas a temperatura ambiente hasta su uso. </li></ol> 2. Recubrimiento de lectina de la purificación de placas <ol><li> Prepare una solución de 10 mM Tris en agua esterilizada, pH 9,5. </li><li> Añadir lectina (resolver la lectina (Sigma L9640) en polvo en HBSS) a una concentración final de 10 mg / ml. </li><li> Cubrir la superficie de una placa de cultivo celular de 10 cm con 8 ml de la solución de lectina y se deja incubar durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lavar la placa tres veces con HBSS y almacenar en HBSS hasta su uso. </li><li> Prepare un 30 mM KCl, 0,8% (w / v) NaCl despolarización solución. Esterilice por filtración y almacenar a temperatura ambiente (TA). </li></ol> 3. Motoneurona medio de cultivo <ol><li> Descongelar el suero de caballos durante la noche a 4 ° C e inactivar a 55 ° C durante 30 minutos, en alícuotas de 5 ml y almacenar a -20 ° C. Alícuota descongelar directamente antes de su uso a temperatura ambiente. </li><li> Tienda B27-suplemento en un aliqouts ml a -20 ° C. Descongelar a temperatura ambiente B27 suplemento inmediatamente antes del uso. Evitar ciclos de congelación y descongelación. </li><li> Glutamax alícuota en alícuotas de 0,5 ml y almacenar a -20 ° C y uso en 1:100. </li><li> Prepare una solución stock de 10 mg / ml CNTF en agua esterilizada con 0.1% de BSA. Almacenar a -20 ° C. </li><li> Mezcla de 46 ml de medio neurobasal con 2,5 ml de suero de caballos, 1 ml B27-complemento y 0,5 ml glutamax directamente antes de su uso. </li><li> Añadir CNTF a una concentración final de 10 ng / ml de medio y medio de pre-calentamiento a 37 º C. </li></ol> 4. La disección de la médula espinal <ol><li> Sacrificar un ratón E12.5 embarazada y la toma de embriones con cuidado. Añade suficiente HBSS RT para cubrir completamente los embriones. </li><li> Quitar la cabeza y la cola y el lugar de la parte posterior del embrión con los miembros a horcajadas. </li><li> Fijar el embrión con un fórceps y quitar la piel exterior con las pinzas de otros. </li><li> Eliminar la médula espinal por la perforación de las pinzas bajo, y la levante con ver como los movimientos en ambos lados de la médula espinal. </li><li> La transferencia de la médula espinal aislada de un nuevo plato con HBSS y abrir el canal central de la médula espinal en la parte dorsal. </li><li> Quitar los ganglios de la raíz dorsal mediante la eliminación de las meninges envolvente de la médula espinal. </li><li> Reúne las piezas lumbar de la médula espinal de un máximo de 6 embriones por placa de lectina en un tubo eppendorf reacción llena de un HBSS ml y almacenar en hielo hasta que la preparación se lleva a cabo. </li></ol> 5. Enriquecimiento de las motoneuronas por lectina basado en la purificación Nota: Antes de comenzar los pasos a seguir, la última que le preparan y precalentar el medio (ver paso 3). <ol><li> Prepare una solución de tripsina por la solución de 1 g de tripsina en 100 ml HBSS, almacenar a -20 ° C y descongelar a 4 ° C. </li><li> Mezclar 1 g de tripsina inhibidor con 98 ml de HBSS y 2 ml de 1 M pH 7,4 HEPES, alícuotas de 1 ml deben ser almacenados a 4 ° C. </li><li> Transferir el tubo con la médula espinal a una campana de cultivo de células y retirar con cuidado 700 l de la HBSS. </li><li> Añadir 7,5 l de solución de tripsina y mezclar cuidadosamente invirtiendo el tubo. </li><li> Realizar tripsinización durante 8 minutos a 37 ° C. </li><li> Detener la reacción añadiendo 30 l inhibidor de la tripsina y la pipeta hacia arriba y hacia abajo (triturar) cuidadosamente 10-15 veces con una pipeta 1.000 l hasta que no haya más agregados de células son visibles. Repita la trituración con una pipeta de 20 a 200 l, y la punta correspondiente. </li><li> Pipeta la solución de células en la placa de lectina HBSS y lleno de dispersar las células suavemente girando el plato. </li><li> Guarde la placa de la lectina de 60 min a temperatura ambiente sobre una superficie libre de vibraciones. Cúbralo para evitar la contaminación. </li><li> Retire la HBSS muy suavemente y se lava la placa con cuidado 4 veces con pre-calentado HBSS para eliminar fragmentos de células y las células no se adjunta / solteras. </li><li> Inmediatamente después de la última etapa de lavado, añadir 500 l solución de la despolarización de la placa y se deja incubar durante 1 minuto. </li><li> Facilitar el desprendimiento de las células de la lectina obligado por agitación ytocando la placa. </li><li> Llenar el plato con 2 ml de medio de la cultura pre-calentado y transferir a un tubo Falcon de 15 ml. </li><li> Contar el número de células con una cámara de recuento Neubauer. </li><li> Placa de la celda de la laminina cubreobjetos recubiertos o placas en un número adecuado dependiendo de la aplicación. </li><li> Realizar un intercambio de soportes en el día 1 y, posteriormente, cada dos días por el reemplazo cuidadoso de un 50% de la mediana edad. Utilice siempre pre-calentado, medio recién preparado una nueva cultura. </li></ol> 6. Los resultados representativos: Motoneuronas embrionarias se pueden obtener de embriones de ratón en el E12 a E14. 2.3% de la población total de células de la médula espinal lumbar consiste en neuronas motoras y, como las neuronas ganglionares raíz dorsal se p75 NTR-positivas, así, es importante para deshacerse de estas células antes de iniciar el procedimiento preplating lectina basado en ( Para información general véase la Figura 1 y Figura 2). En segundo lugar, las meninges son las células con fuerza divisoria que debe ser excluido, así, ya que no pueden ser eliminados correctamente por el procedimiento basado en preplating lectina (Figura 2 y Figura 3). En el peor de los casos, estas células pueden crecer demasiado las placas de cultivo. Las imágenes de representación en la figura 3B y 3D también dar una impresión acerca de la densidad celular más baja después de los procedimientos de lavado se han realizado (véase el paso 5.9 del protocolo). Los cultivos de motoneuronas embrionarias de ratón son por lo general se mantiene hasta para cinco o siete días. Durante este período de tiempo las células establecer sus axones hasta una longitud máxima (Figura 4). Longitudes de las neuritas, dependen fuertemente del sustrato en el 8 placas. El sustrato típico es la laminina, que se aplica sobre PORN-H placas de cultivo cubierto. Motoneuronas también puede crecer en otros sustratos o menos definidas, como las matrices extracelulares generados por la lisis del agua 8. En los casos de recubrimiento óptimo de longitud, las neuritas y el área del cono de crecimiento se redujo y la muerte celular por lo general aumenta. Soporte trófico juega un papel crucial para la supervivencia de las motoneuronas de embriones de ratón en cultivo. Supervivencia de las células inicialmente plateado en el día siete caída de 10% a 20% sin el apoyo trófico 6. Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y el factor neurotrófico ciliar (CNTF) son los factores más comúnmente utilizado, pero otros pueden promover la supervivencia, así [el factor inhibidor de leucemia (LIF), cardiotrofina-1 (CT-1), factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF ), similar a la insulina factor de crecimiento 1 (IGF-1) 9]. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Flujo esquema para la preparación de las neuronas motoras de embriones de ratón. El esquema ilustra los diferentes pasos para el aislamiento y la cultura de las neuronas motoras de embriones de ratón. Abreviaturas: SC: la médula espinal; HBSS: solución salina equilibrada de Hanks, MN: motoneurona. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 El aislamiento de la parte lumbar de la médula espinal de ratón E12.5 A:.. E12.5 embrión de ratón. Para el siguiente paso, la cabeza y la cola se eliminan y el cuerpo es colocado en una posición dorsal B-up: Embrión en posición dorsal-up. Pinzas en la parte izquierda y derecha de la médula espinal son la fijación del cuerpo del embrión en su posición. Uno de los fórceps se utilizan posteriormente para cortar la piel y cortar debajo de la médula espinal de la otra se utiliza para fijar el embrión en su posición C:. Médula espinal aisladas de embriones de ratón E12.5. Las partes de la médula espinal (cervical, dorsal, lumbar) se indican. La médula espinal está rodeada por las meninges y parte de los ganglios de la raíz dorsal todavía se adhieren a ellas D:. La médula espinal es cortada longitudinalmente en la parte dorsal para abrirla hacia el canal central E:. Las meninges en la cara ventral están tomadas de la médula espinal aplanado. Nota: Aunque retirado, la región lumbar se caracteriza por un pequeño corte. F: Sólo la parte lumbar de la médula espinal es llevado por otros procedimientos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 Determinación y aislamiento de islotes de células positivas a partir de la médula espinal lumbar de E12.5 embriones de ratón A:.. Las etiquetas Islet-1 / 2 de anticuerpos columnas de las motoneuronas en la médula espinal lumbar embrionarias (rojo, flecha) y las etiquetas de todos los Hoechst núcleos dentro de la sección. Sección transversal de un cable de E12.5 lumar espinal. E12.5 embriones de ratón se fija inmersión en paraformaldehído al 4% durante 6 h, se lavaron 3 veces con tampón fosfato salino y tratados con sacarosa de acuerdo con los procedimientos estándar. Cryosections de 20 micras fueron tomadas con un criostato y las secciones se manejan para la tinción immunhistochemical de acuerdo con los procedimientos estándar de 11. El software posteriormente las secciones marcadas con Hoechst para la localización de los núcleos celulares. Tenga en cuenta quelas neuronas ganglionares raíz dorsal se Islet-1/2-positive así y que el procedimiento de preparación no incluye esta parte de tejido del procedimiento de aislamiento B:. Islet-1 / 2 etiqueta (rojo, flecha) disociar las células de la médula espinal lumbar de E12. 5 embriones, a la izquierda - y antes de la derecha - después de lectina basado preplating. Las células fueron contrastados con Hoechst para visualizar todos los núcleos de las células C:. Cuantificación de células Islet-1/2-positive antes y después de lectina basado preplating D:. Nkx6.1 motoneuronas etiqueta de E12.5 embriones después de un día en la cultura. Las células fueron contrastados con Hoechst para cisualieze todos los núcleos. Tenga en cuenta que el 90% de todas las células son Nkx6.1 positivo. Abreviaturas: SC: la médula espinal, MN: motoneurona; DRG: ganglio de la raíz dorsal. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4 Caracterización de las motoneuronas E12.5 ratón A y B:.. Enriquecido aislados E12.5 ratón lumbar motoneuronas espinales expresar p75 NTR a 0 días in vitro (0div) y el día 2 in vitro (2DIV). Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4% y posteriormente teñidos para p75 NTR acuerdo con los procedimientos estándar. Las células fueron counterstained con Hoechst para visualizar todos los núcleos de C:. Motoneuronas enriquecido después de 5 días in vitro (5div) en el PORN y la laminina-H como sustratos de cultivo y en la presencia de manchas CNTF de β-III-tubulina. Tenga en cuenta que las células han desarrollado a partir neuritas largas y mostrar la morfología típica de las motoneuronas con un tiempo (ramas) del proceso y uno o más procesos más cortos (axones y dendritas). Abreviaturas: MN: motoneurona, div: días in vitro. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="3"> Después de la disociación, sin lectina basado preplating </td></tr><tr><td> Número total de células / SC </td><td> El azul tripán de células positivas [%] </td><td> Islet-1/2- células positivas [%] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 995.0 </td><td> 13,1 </td><td> 9,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 889.4 </td><td> 8,0 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 1.180.0 </td><td> 11,0 </td><td> 10,8 </td></tr><tr><td> Media ± DE </td><td> 1.021.0 ± 147,1 </td><td> 10,7 ± 2,6 </td><td> 10,1 ± 0,7 </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td> Con lectina basado preplating </td></tr><tr><td> Número de células después de preplating / SC </td><td> El azul tripán de células positivas [%] </td><td> Islet-1/2- células positivas [%] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 189.6 </td><td> 9,9 </td><td> 70,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 168.8 </td><td> 3,7 </td><td> 76,1 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 125.0 </td><td> 0,0 </td><td> 72,5 </td></tr><tr><td> Media ± DE </td><td> 161,1 ± 33,0 </td><td> 4,5 ± 5,0 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Resumen de resultados de los procedimientos de aislamiento representante de las neuronas motoras de embriones de ratón de la etapa E12.5. A partir de 3 diferentes procedimientos de aislamiento especialmente para este fin se dan como el número total de números o porcentaje ± SD. Abreviatura: SC: la médula espinal; SD: desviación estándar. <table border="1"><tbody><tr><td> Islet-1 / 2 células positivas a p75 paneo [%] </td><td> Islet-1 / 2 células positivas con lectina basado paneo [%] </td></tr><tr><td> 92,0 ± 3,5 1 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Resultados de la comparación de la lectina base y p75 basada en un encuadre números de las motoneuronas de la célula. Se dan los números de porcentaje ± SD.

<ol><li>Vallstedt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+repressor+activity+assign+redundant+and+specific+roles+to+Nkx6+genes+in+motor+neuron+and+interneuron+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification.</a> Neuron. 31, 743-755 (2001).</li>
<li>Tsuchida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+organization+of+embryonic+motor+neurons+defined+by+expression+of+LIM+homeobox+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes.</a> Cell. 79, 957-970 (1994).</li>
<li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+related+motor+neuron+pool+and+muscle+sensory+afferent+subtypes+defined+by+coordinate+ETS+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression.</a> Cell. 95, 393-407 (1998).</li>
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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La ventaja de esta técnica basada en preplating lectina es que es menos costoso que el p75 NTR un procedimiento basado en paneo, y la lectina es más estable que los anticuerpos. El enriquecimiento que figuran en la figura. 2 y Tab. 1 muestra que el procedimiento permite a la purificación de un número similar de células y que la mayoría de estas células expresan el marcador de las motoneuronas Islet-1 / 2. El paso más crítico es el procedimiento de aislamiento de la médula espinal lumbar. La eliminación de las meninges y el GRD (Fig. 2) es esencial para el procedimiento de purificación después de lectina basado preplating. Si esto ha sido manejado correctamente, casi todas las células expresan el p75 NTR (para la imagen representativa ver fig. 3a). La razón de la diferencia entre la expresión de Islet-1 / 2 y p75 NTR es muy probablemente debido a las motoneuronas lumbar expresan diferencialmente los niveles superior e inferior de Islet-1 / 2 10. En el caso de los bajos niveles de Islet-1 / 2 esta expresión podría haber escapado a nuestra atención en la tinción immuncytochemical y contando posteriores a medida que eran estrictos con respecto a las células positivas frente a los negativos (Tabla 1). Además, el cuadro 1 muestra claramente que las células aisladas sobreviven al procedimiento en una condición saludable, ya que sólo hay unos pocos tripán azul células positivas que indican que las células son irreversiblemente dañados. Este procedimiento alterativo también permite el aislamiento de las neuronas motoras a partir de embriones individuales y por lo tanto, de camadas mixtas genotipo de ratones embrionarios. En conclusión, esta alternativa al procedimiento de la panorámica con el anticuerpo p75 NTR 6 tiene similares si no idénticas capacidades en términos de rangos de posible aplicación y proporciona un método alternativo de purificación barato y eficiente para las motoneuronas embrionarias de ratón.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Poli-DL-ornitina bromhidrato </td><td> Sigma </td><td> P8638 </td><td></td></tr><tr><td> Laminina </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos de vidrio </td><td> Thermo </td><td></td><td> Ø 10 o 14 mm </td></tr><tr><td> Lectina </td><td> Sigma </td><td> L5142 </td><td></td></tr><tr><td> Placa de cultivo celular </td><td> Nunc </td><td> 150350 </td><td> Nunclon delta superficie </td></tr><tr><td> Suero de caballo </td><td> Linaris </td><td> SHD3250ZK </td><td> Cada lote tiene que hacerse la prueba de MN cultura </td></tr><tr><td> B27 Suplemento </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-038 </td><td></td></tr><tr><td> CNTF </td><td> Sigma </td><td> N0513 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Applichem </td><td> A1391 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-041 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps </td><td></td><td></td><td> De acero inoxidable, tamaño 4 o 5 </td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Worthington </td><td> LS003707 </td><td></td></tr><tr><td> Inhibidor de tripsina </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Islet-1 </td><td> DSHB </td><td> 39.4D5 </td><td> Sobrenadante del cultivo celular </td></tr><tr><td> Anti-Nkx6.1 </td><td> DSHB </td><td> F55A10 </td><td> Sobrenadante del cultivo celular </td></tr><tr><td> Anti-p75 NTR </td><td> Abcam </td><td> Ab8874 </td><td></td></tr></tbody></table> La tabla 3. Tabla de reactivos y equipos específicos.

lectina basado en aislamiento y cultivo de motoneuronas embrionarias de ratón

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Motoneuronas espinales evolucionar hacia estadios postmitóticas hasta principios de desarrollo embrionario del sistema nervioso y, posteriormente, crecen las dendritas y los axones. Células neuroepiteliales del tubo neural que expresan Nkx6.1 son las únicas células precursoras de las neuronas motoras espinales 1. A pesar de las motoneuronas postmitóticas avanzar hacia su posición final y se organizan en columnas a lo largo del tracto espinal 2,3. Más del 90% de todas estas motoneuronas diferenciado y posicionado expresar los factores de transcripción Islet 1 / 2. Que inervan los músculos de las extremidades, así como las del cuerpo y los órganos internos. Entre otras, las neuronas motoras suelen expresar los receptores de alta afinidad para el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y la neurotrofina 3 (NT-3), la tropomiosina relacionadas quinasa B y C (TrkB, TrkC). Ellos no expresan la quinasa tropomiosina relacionados A 4 (TrkA). Junto a los dos receptores de alta afinidad, las motoneuronas no expresan la baja afinidad por los receptores de neurotrofinas p75 NTR. El p75 NTR puede unir a todos neurotrofinas con afinidad similar, pero menor a todas las neurotrofinas que los receptores de alta afinidad que se unen las neurotrofinas maduras. Dentro de la médula espinal embrionaria, la p75 NTR se expresan exclusivamente en las neuronas motoras espinales 5. Esto ha sido utilizado para desarrollar técnicas de aislamiento de las motoneuronas para purificar las células de la gran mayoría de las células que rodean 6. Motoneuronas aislar con la ayuda de anticuerpos específicos (panning) en contra de los dominios extracelulares de p75 NTR ha resultado ser un método costoso como la cantidad de anticuerpo utilizado para un solo experimento es alta debido al tamaño de la placa utilizada para el desplazamiento lateral. Una alternativa mucho más económica es el uso de lectinas. Lectina se ha demostrado que se unen específicamente a p75 NTR y 7. El método siguiente describe una técnica alternativa utilizando aglutinina de germen de trigo por un procedimiento preplating en lugar de los anticuerpos p75 NTR. La lectina es una alternativa muy económica para el anticuerpo p75 NTR y los grados de purificación utilizando lectina es comparable a la de los anticuerpos p75 NTR. Motoneuronas de la médula espinal de embriones puede ser aislado por este método, sobrevivir y crecer neuritas.

Una forma alternativa de aislar a las neuronas motoras de embriones de ratón de la médula espinal se describe. El método tiene en cuenta el hecho de que las lectinas pueden unirse a los nervios de baja afinidad p75NTR receptor del factor de crecimiento. Esta lectina preplating basado permite una purificación similar a la que con un anticuerpo específico contra el p75NTR.

Lectina basado en Aislamiento y cultivo de motoneuronas embrionarias de ratón

Las motoneuronas espinales se desarrollan hacia etapas postmitóticas a través del desarrollo temprano del sistema nervioso embrionario y, posteriormente, desarrollan dendritas y axones.

El objetivo general de este procedimiento es obtener un cultivo enriquecido de neuronas motoras embrionarias de ratón. El procedimiento comienza con la sacrificio de un ratón preñado, la extracción de los embriones y la disección de la médula espinal lumbar. El siguiente paso consiste en disociar la médula espinal en una suspensión de células individuales mediante tratamiento enzimático y duración.A continuación, realice la purificación basada en lectinas para separar las neuronas motoras de los restos celulares. Luego, tras estimar el número total de células, se siembran las células en placas pre-codificadas o en cubreobjetos. El paso final consiste en ajustar la densidad del cultivo según el procedimiento experimental.Finalmente, a medida que las células cultivadas crecen, puede observarse la morfología típica de las neuronas motoras para el éxito. Al preparar cultivos de ratones y neuronas motoras, es esencial probar diferentes materiales, sustancias y soluciones. Dado que las células pueden reaccionar sensiblemente a cualquier cambio en estos elementos, las neuronas motoras pueden cultivarse en alta densidad para el aislamiento de ARN o proteínas.Sin embargo, existe la posibilidad de que las células formen redes neuronales activas, lo que conduce a la supervivencia independiente del soporte trófico. Por lo tanto, en algunos casos podría ser preferible cultivar las células a baja densidad para análisis de ARN o proteínas, demostrando este procedimiento serán Rebecca Conrad y Terza Japan. Ambos son estudiantes de posgrado en nuestro laboratorio.Comience este procedimiento preparando la solución de trabajo de 0,5 miligramos por mililitro de poli DL ornitina hidrobromuro en tampón bide 150 milimolar con pH 8,35 y esterilice la solución por filtración. A continuación, esterilice las laminillas de vidrio flameándolas en etanol al 100 %. Luego déjelas secar al aire y cubra la superficie de las laminillas con suficiente solución de porn H durante la noche a cuatro grados Celsius; realice esto al día siguiente.Lávelos tres veces con agua esterilizada. Luego déjelos secar al aire después de eso. Prepare la solución de trabajo de 2.5 microgramos por mililitro.La laminina en HBSS cubre la superficie de los cubreobjetos recubiertos con porn H con la solución de laminina. Luego, incubarlos durante al menos dos horas a temperatura ambiente hasta su uso. El siguiente paso es preparar una solución de 10 milimolar de triss en agua esterilizada con pH 9,5.Después de filtrar la solución, agregue lectina a la mezcla hasta una concentración final de 10 microgramos por mililitro. Luego, recubra la superficie de un recipiente de cultivo celular de 10 centímetros con ocho mililitros de la solución de lectina e incube durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave la placa con HBS S 3 veces y almacene la placa en HBSS hasta su uso.A continuación, prepare la solución despolarizante con 30 milimolar de cloruro de potasio y 0,8% de cloruro de sodio. Luego, esterilice la mezcla por filtración y almacénela a temperatura ambiente. Para comenzar este procedimiento, descongele el suero equino durante la noche a cuatro grados Celsius.Luego, inactívelo a 55 grados Celsius durante 30 minutos, alícuótelos en porciones de cinco mililitros y almacene las alícuotas a menos 20 grados Celsius. Derrita una alícuota directamente a temperatura ambiente antes de usarla; a continuación, almacene el suplemento B 27 en alícuotas de un mililitro a menos 20 grados Celsius.Descongele a temperatura ambiente inmediatamente antes de usar. Evite los ciclos de congelación y descongelación; alícuote el glutamato en alícuotas de 0,5 mililitros y almacénelos a menos 20 grados Celsius. Luego, prepare una solución madre de 10 microgramos por mililitro de CNTF en agua esterilizada con 0,1 % de BSA y almacénela a menos 20 grados Celsius.Finalmente, mezcle 46 mililitros de medio neurobasal con 2,5 mililitros de suero de caballo, un mililitro del suplemento B 27 y 0,5 mililitros de glutamato. Añada CNTF hasta una concentración final en el medio de 10 nanogramos por mililitro. Precaliente a 37 grados Celsius.En este momento, sacrificar un ratón preñado con embriones de 12,5 días y extraer cuidadosamente los embriones. Añadir HBSS a temperatura ambiente para cubrir completamente los embriones y trasladar un embrión bajo un microscopio. A continuación, retirar la cabeza y la cola y colocar el embrión boca abajo con las extremidades separadas.A continuación, fije el embrión con un par de pinzas y retire la piel externa con el otro par de pinzas. Después, retire la médula espinal perforando con las pinzas por debajo de ella y levántela realizando movimientos de sierra a ambos lados de la médula espinal. Transfiera la médula espinal aislada a un nuevo recipiente con HBSS.Abrir el canal central de la médula espinal por el lado dorsal. A continuación, eliminar los ganglios de la raíz dorsal eliminando las meninges que rodean la médula espinal. Luego, transferir las médulas espinales a un tubo de reacción EOR que contenga un mililitro de HBSS.Manténgalos en hielo hasta que esté lista la preparación para la digestión de la médula espinal. Transfiera el tubo con las médulas espinales a una cabina de cultivo celular. Retire cuidadosamente 700 microlitros del HBSS y a continuación agregue 7,5 microlitros de solución de tripsina al 1 %, descongelada, que fue preparada anteriormente según se describe en el manuscrito adjunto.Y mézclelos invirtiendo cuidadosamente el tubo. Realice la tripsinización durante ocho minutos a 37 grados Celsius. Luego detenga la reacción añadiendo 30 microlitros de inhibidor de tripsina, pipeteando suavemente de arriba abajo, de 10 a 15 veces con una punta de pipeta de 1000 microlitros hasta que no sean visibles más agregados celulares.A continuación, repita la operación con una pipeta de 20 a 200 microlitros. Pipete la solución celular hacia la placa de lectina llenada con HBSS y disperse las células rotando suavemente la placa. Cubra la placa de lectina para evitar contaminación y déjela sobre una superficie libre de vibraciones a temperatura ambiente durante 60 minutos.Retire muy suavemente el HBSS y lave la placa cuidadosamente cuatro veces con HBSS precalentado para eliminar fragmentos celulares y células no adheridas inmediatamente después del último paso de lavado. Añada 500 microlitros de la solución despolarizante de 30 milimolar de cloruro de potasio y 0,8% de cloruro de sodio a la placa e incube durante un minuto; agite y golpee suavemente la placa para facilitar la disociación de las células unidas a la lectina. Complete la placa con dos mililitros de medio de cultivo precalentado. A continuación, transfiera el contenido a un tubo cónico de 15 mililitros.Cuente el número de células con una cámara de recuento sin bower. A continuación, siembre las células en cubreobjetos o placas recubiertos con laminina. Cambie el medio el día uno y posteriormente cada dos días reemplazando cuidadosamente el 50% del medio antiguo con medio de cultivo recién preparado y precalentado.El medio mostrado aquí es una sección transversal de la médula espinal lumbar de un embrión de 12,5 días, etiquetada con herst para la localización de los núcleos celulares. La flecha indica las columnas de neuronas motoras dentro de la médula espinal lumbar embrionaria marcadas con el anticuerpo eyelet one two. Un ejemplo de disociación etiquetada con eyelet one two.Las células de la médula espinal lumbar de embriones de 12,5 días antes y después del preplaqueo basado en lectinas se muestran en el panel izquierdo y derecho, respectivamente. Aquí se presentan los resultados cuantitativos de las células positivas para eyelet uno dos antes y después del preplaqueo basado en lectinas. A continuación se muestra un ejemplo para demostrar la enriquecimiento de neuronas motoras en el día cero y en el día dos; las células se fijaron con paraformaldehído al 4% y posteriormente se tiñeron para P 75 NTR.Según procedimientos estándar, luego se realizaron tinciones de contraste utilizando ganchos para visualizar todos los núcleos tras cinco días in vitro en porn H y laminina como sustratos de cultivo y en presencia de CNTF; para la tinción de beta tres tubulina, las células desarrollaron largas neuritas y mostraron la morfología típica de las neuronas motoras, con un proceso más largo y uno o más procesos más cortos. Las neuronas motoras desempeñan un papel central en el cuerpo de todos los vertebrados e invertebrados.Este aislamiento es extremadamente útil para el análisis de los mecanismos de supervivencia de las neuronas motoras. Con las células aisladas, se pueden analizar selectivamente las actividades de otras células interactivas, proteínas, carbohidratos, y aplicar sustancias farmacológicas sobre la supervivencia y el crecimiento neuronal de estas células.

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Investigación

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Neurociencia

Hemos desarrollado un nuevo protocolo para mejorar la eficiencia de la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras. Las células madre embrionarias diferenciadas adquirida cuenta con las neuronas motoras como lo demuestra la expresión de marcadores neuronales de neuronas y el motor mediante técnicas de inmunohistoquímica.

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Este video muestra un protocolo para aislar y cultivar células de la corteza cerebral primaria del telencéfalo dorsolateral de embriones de ratón.

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El video muestra el proceso de aislamiento y cultivo de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo de embriones de ratón. Los pisos ventrales aislados del mesencéfalo se disocian mediante enzimas. Las neuronas dopaminérgicas resultantes se recolectan y se transfieren a microislas dentro de placas de pocillos múltiples. Las células se incuban con un medio neuronal dopaminérgico para mantener las células a una alta densidad dentro de las microislas.

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Demostramos un protocolo de cultivo celular para el estudio directo de los componentes neuronales y gliales del sistema nervioso entérico. Se prepara un cultivo mixto de neurona/glía en cubreobjetos a partir del plexo mientérico de un ratón adulto, lo que proporciona la capacidad de examinar la función individual de las neuronas y la glía mediante electrofisiología, inmunohistoquímica, etc.

Un<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparación de las neuronas entéricas aisladas y células gliales del plexo mientérico del ratón adulto

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El objetivo de esta técnica es preparar una cultura altamente enriquecida de primarias motoneuronas (MNs) de murine de la médula espinal. Para evaluar las consecuencias de las mutaciones que causan enfermedades de MN, Describimos aquí el aislamiento de estos aislados MNs y su transfección por magnetofection.

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Aquí, presentamos una nueva técnica microquirúrgica para el aislamiento de las células madre neurales de la eminencia gangliónica E13 ratón embrión.

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Aislamiento y cultivo de las neuronas motoras oculomotoras, trocleas y espinales de Islmnprenatal :GFP Ratones transgénicos

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