Imágenes de los receptores de estrógenos-α en ratas arteriolas Pial usando un microscopio de inmunofluorescencia Digital

El objetivo general de este procedimiento es describir una técnica sencilla para optimizar la tinción y visualización del receptor de estrógeno alfa utilizando cortes transversales de arterias de la corteza obtenidas de cerebros de ratas hembra. Esto se logra primero extrayendo las arterias de la corteza teñidas con azul de Evans de la superficie del cerebro y cortándolas en anillos de ocho micrones mediante un criostato tras el corte. Los cortes transversales se montan sobre portaobjetos e incubarán con el anticuerpo primario contra el receptor de estrógeno alfa.

A continuación, los cortes se incuban con el anticuerpo secundario y la contratiñión utilizando un medio de montaje que contiene dpi. Finalmente, los segmentos de vaso pelado marcados con fluorescencia se capturan y se convierten en imágenes 2D mediante software de enfoque de profundidad extendida. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el receptor de estrógeno alfa en arteriolas peladas mediante el uso de un microscopio inmunofluorescente Nikon con software de profundidad extendida.

Mi nombre es Dra. Marguerite Littleton Kearney. Hoy, el Dr. Neil Farani, investigador posdoctoral en mi laboratorio, demostrará un procedimiento sencillo para optimizar la visualización y tinción del receptor de estrógeno alfa en peel.

Arterias cerebrales de un cerebro de rata que ha sido perfundido con azul de Evans y almacenado a menos 70 grados Celsius. Utilizando un microscopio estereoscópico, identifique las arterias de la superficie del cerebro y retírelas usando pinzas de punta fina. Elimine cuidadosamente cualquier tejido cerebral adherido.

Coloque las arterias en un pequeño tubo de ensayo sobre hielo. Fije las arterias en formaldehído frío al 2% en 0,1 mol de PBS durante 30 minutos. Para preparar las arterias para el corte, vierta medio de inclusión sobre un disco de congelación ajustado a menos 20 grados Celsius.

Coloque una sección de arteria plana sobre el chug y espere a que se congele. Una vez que se haya congelado firmemente, coloque la arteria en posición vertical en el medio de inclusión sobre el disco de congelación del criostato. Asegúrese de que la punta de la arteria esté orientada hacia adelante.

Sujete la arteria con pinzas hasta que esté completamente congelada. Coloque el disco de congelación con la arteria en la cabeza del criostato y luego corte anillos arteriales de ocho micrones directamente sobre un portaobjetos. Monte las secciones arteriales sobre gelatina de cromo potásico.

Deslice las muestras utilizando dos pinceles para enderezar los anillos arteriales. Almacene las muestras preparadas en una caja de portaobjetos en el refrigerador a cuatro grados Celsius durante la noche. Saque las muestras del refrigerador y déjelas alcanzar la temperatura ambiente sobre la mesa de trabajo.

Lave las laminillas con uno a 1,5 mililitros de PBS 0,1 molar. Después de 10 minutos, retire el PBS y repita el lavado otras dos veces. Después del lavado final con PBS, incube las laminillas en un mililitro de cloruro de amonio 50 milimolar durante 30 minutos a temperatura ambiente para reducir la fluorescencia endógena. Lave las laminillas con PBS 0,1 molar tres veces, durante 10 minutos por cada lavado, como se describió previamente. A continuación, bloquee las laminillas en una solución de PBS que contenga 0,1 % de Triton X-100 más 1 % de suero normal de cabra durante 30 minutos para reducir la unión no específica del anticuerpo primario.

Después del bloqueo, incubar las laminillas con el anticuerpo primario contra ER alfa diluido a una concentración de uno a 500 en la solución de bloqueo durante la noche a cuatro grados Celsius. Retirar las laminillas del refrigerador y llevarlas a temperatura ambiente. Lavar cualquier anticuerpo primario no unido con uno a 1,5 mililitros de PBS al 0,1 % tres veces durante 10 minutos.

Cada vez, incubar las laminillas con el anticuerpo secundario anticonejo Oregon Green 488 en solución bloqueadora durante dos horas a temperatura ambiente y en la oscuridad; tras la incubación, lavar las laminillas en PBS 0,1 molar tres veces, durante 10 minutos por cada lavado, y luego llevarlas a una campana extractora. Colocar una gota de medio de montaje que contenga DAPI sobre las muestras y a continuación colocar una lámina de cubierta sobre el espécimen. Aplicar esmalte transparente para sellar los bordes de la lámina de cubierta y dejar que se seque completamente.

Coloque las laminillas preparadas con los segmentos de vasos de la cáscara teñidos bajo el microscopio y ajústelos para visualizar las áreas de interés marcadas con fluorescencia. La visualización del ER alfa teñido es el paso más difícil de este procedimiento. Encuentre el nivel del vaso cortado con los receptores más nítidos.

Comience con un aumento de 100 veces y luego aumente el aumento a 600 veces. Utilice la cámara para capturar imágenes en los canales DPI y ZI para los núcleos celulares y DR alfa, respectivamente, y luego use software para convertir múltiples vistas de segmentos vasculares en imágenes 2D. Aquí se muestran los resultados de la tinción inmunofluorescente para ER alfa en color verde y la contratincción con DPI.

En azul, en un anillo de arteria peel aislado del cerebro de una rata hembra, las imágenes fusionadas sugieren la presencia de receptores de estrógeno alfa intranucleares. Mediante el uso de una combinación de imágenes Zack, se puede obtener una imagen enfocada de la inmunofluorescencia del receptor de estrógeno alfa, teniendo en cuenta que se deben realizar controles negativos de autofluorescencia tanto para el anticuerpo primario como para el secundario. Observe la autofluorescencia distintiva a lo largo del lado endotelial de una arteria que no ha sido incubada con el anticuerpo secundario.

Después de ver este video, debería tener una idea clara de cómo aislar y separar las arterias de la superficie del cerebro, así como de cómo preparar anillos transversales de ocho micrómetros. Además, debería estar familiarizado con el uso del receptor de estrógeno alfa marcado con fluorescencia y con la visualización de los receptores mediante un microscopio digital de inmunofluorescencia y el software Nikon Elements.