Visualización de las proteínas y complejos macromoleculares de Negative EM Mancha: desde la preparación de la cuadrícula para adquisición de imágenes
December 22nd, 2011
Visualización de las muestras de proteínas por microscopía de electrones negativos mancha (EM) se ha convertido en un popular método de análisis estructural. Es útil para el análisis estructural cuantitativo, como el cálculo de una reconstrucción en 3D de las moléculas en estudio, y también para el examen cualitativo de la calidad de los preparados de proteínas. En este artículo se presentan los protocolos de detalle para la preparación de las redes de EM, la tinción de la muestra y la visualización de la muestra en un microscopio electrónico. Los usuarios novatos pueden seguir estos protocolos fácil de utilizar y negativas EM mancha como un ensayo de rutina, además de otros ensayos bioquímicos, para evaluar las muestras de proteínas.
El objetivo general de este procedimiento es visualizar muestras de proteínas purificadas mediante microscopía electrónica de tinción negativa. Esto se logra preparando primero las rejillas de microscopía electrónica que soportarán la muestra. El segundo paso del procedimiento es preparar la solución de tinción negativa.
A continuación, la muestra se aplica a la rejilla de microscopía electrónica y se tiñe con negativos. Por último, la rejilla EM se carga en un microscopio electrónico y las imágenes se registran en condiciones ópticas adecuadas. Las imágenes DEM convencionales de campo claro son de alto contraste y nítidamente detalladas, mostrando una sola macromolécula dispersa sobre un fondo sin rasgos distintivos.
La microscopía electrónica de tinción negativa es un método simple para visualizar su proteína favorita. Se puede utilizar como un ensayo de rutina para examinar su proteína purificada, ya sea para análisis estructural u otros ensayos bioquímicos y biofísicos. Aquí demostramos cómo preparar una muestra teñida negativamente para microscopía electrónica.
La demostración visual de este método es útil, ya que algunos de los pasos son difíciles de aprender de las descripciones de texto y las figuras. Comience usando una pipeta de vidrio para colocar una sola gota de colodión en un vaso grande de agua en la superficie del agua. A medida que el colodión se propaga, puede capturar polvo de la superficie del agua.
Retire y reemplace una película polvorienta de plástico colodiónico por otra gota. A continuación, coloque entre 50 y 100 rejillas EM una por una en la película de plástico flotante con el lado brillante hacia abajo. Seleccione 400 rejillas de malla para la mancha negativa de rutina y seleccione 200 rejillas de malla.
Para recopilar imágenes de pares de inclinación. Seleccione un pedazo de papel sin arrugas de absorción lenta que sea un poco más grande que el área de las cuadrículas. Coloque el papel encima de las cuadrículas y espere hasta que el papel esté completamente mojado.
El papel no debe absorber agua demasiado rápido. Usamos papel de un bloc de notas barato. Las rejillas ahora están intercaladas entre la película de plástico y el papel.
Usa un par de pinzas para colocar el papel en una placa de Petri para que se seque lentamente al aire. Evite los métodos de secado más rápidos, ya que pueden provocar arrugas. La máquina de recubrimiento de carbono utilizada en nuestro laboratorio es un coer de carbono turbo de alto vacío Creston 2 0 8 C.
Equipado con un monitor de espesor de película Creston. El monitor utiliza una balanza de cuarzo que es sensible a los depósitos de carbono. Sin embargo, el protocolo descrito aquí no requiere este dispositivo Comience afilando y cargando las varillas de carbono en una máquina de recubrimiento de carbono.
A continuación, una corredera de vidrio con grasa al vacío que deja la mitad del área esmerilada sin recubrir Después del recubrimiento de carbono, las regiones engrasadas de la corredera se utilizan para estimar el espesor de la capa de carbono. Coloque el papel con rejillas en el escenario debajo de la campana de la máquina de recubrimiento de carbono. Coloque el vidrio engrasado.
Deslízate junto a las cuadrículas. Bombee la cámara de vacío hasta al menos 10 micro recorridos, de lo contrario, las chispas generarán muchas partículas grandes en la red. Ahora aumente la corriente muy lentamente.
La punta afilada de la caña de carbono se volverá extremadamente brillante. No lo observe a simple vista cuando comience el recubrimiento, la corredera de vidrio cambiará de color a gris oscuro a medida que se acumula la capa de carbono, corte la corriente al grosor de carbono deseado y tenga en cuenta la transparencia de la campana. Al hacer este juicio, una vez que la oscuridad del portaobjetos se calibra según el espesor del carbono, este método es tan preciso como el monitor de espesor de película más costoso.
Cuando finalice el proceso, ventile la cámara de vacío y retire las rejillas recubiertas para su uso posterior. La fina capa de plástico no afectará a la calidad de la imagen teñida negativamente, pero puede eliminarse remojando las rejillas en cloroformo durante varias horas antes de continuar. Prepare una solución fresca de formiato de orina L o use una solución que se haya almacenado en la oscuridad durante menos de dos semanas.
Una buena solución fresca tiene un color amarillo, un pH de alrededor de cuatro y corre muy limpia sin precipitados. Comience por usar un sistema disponible comercialmente para brillar. Descargue las rejillas recubiertas de carbono.
A continuación, dos gotas de 20 microlitros de agua destilada y 2 gotas de 25 microlitros de solución fresca de formiato para urinarios sobre un trozo de perfil. Usando pinzas anticapilares de fuerza inversa, sostenga una rejilla de descarga incandescente, con el lado recubierto de carbono hacia arriba. Fundamentalmente, estas pinzas no extraen líquido de las rejillas.
Ahora aplique dos microlitros de muestra de proteína a la rejilla y espere mientras las proteínas se absorben en la rejilla. Esto suele tardar 30 segundos, pero las muestras muy diluidas requerirán más tiempo, lo que puede afectar a las concentraciones de tampón. Cuando termines, seca la muestra de proteína con papel de filtro.
A continuación, lave la rejilla dos veces tocando brevemente una gota de agua en su superficie y secándola en unos segundos. Después de que el agua tocara brevemente la rejilla hasta convertirla en una gota de mancha y secarla rápidamente. Usando la misma técnica, permita que la rejilla esté en contacto con una segunda gota de tinte durante 20 segundos.
Finalmente, seque al aire la rejilla en la campana extractora de sobremesa, o preferiblemente al vacío antes de la sesión de EM, verifique la alineación del microscopio EM cargando un archivo de alineación perfeccionado si está disponible, debería restaurarlo a una condición casi perfecta. Ahora cargue la rejilla EM en un solo portamuestras estándar de inclinación. A continuación, inserte el soporte en la plataforma.
A continuación, espere a que se complete el ciclo de bombeo e inserte el soporte en la columna. Ahora comience a buscar un área de muestra con buena mancha. Enfoque manualmente usando el método de contraste mínimo o usando una cámara CC, D y calculando los cuatro en vivo.
Su espectro de poder. A continuación, ajuste el enfoque profundo según sea necesario, normalmente a 1,5 micras negativas. La concentración de manchas puede variar a lo largo de la cuadrícula, así que busque proteínas con contraste blanco.
Evite las áreas con tinción desigual o tinción positiva donde el contraste de proteínas se vuelve negro. Usar el enfoque descrito para hacer cuadrículas y visualizar muestras teñidas negativamente. Se obtuvieron imágenes de varias proteínas conocidas con fines de demostración.
Toma nota de sus detalles y contrastes nítidos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar muestras de macromoléculas teñidas negativamente para su observación en un microscopio electrónico. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en unas cuatro horas.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la reconstrucción 3D para comprender mejor las estructuras moleculares.
Visión general
Este artículo presenta un protocolo detallado para visualizar muestras de proteínas purificadas utilizando microscopía electrónica de tinción negativa (ME). El método es accesible para usuarios novatos y sirve como un ensayo de rutina para el análisis estructural de proteínas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biología Estructural
- Microscopía Electrónica
- Análisis de Proteínas
Antecedentes
- La tinción negativa ME es una técnica ampliamente utilizada para visualizar proteínas.
- Permite el análisis estructural tanto cualitativo como cuantitativo.
- Los protocolos para la preparación de muestras y visualización son esenciales para la aplicación exitosa.
- Este método puede mejorar la comprensión de las estructuras de las proteínas.
Propósito del estudio
- Proporcionar una guía completa para preparar rejillas de ME y teñir muestras.
- Demostrar la visualización de proteínas utilizando tinción negativa ME.
- Facilitar el uso de rutina de este método en el análisis de proteínas.
Métodos utilizados
- Preparación de rejillas de microscopía electrónica.
- Aplicación de solución de tinción negativa a muestras de proteínas.
- Visualización de muestras en un microscopio electrónico.
- Registro de imágenes en condiciones óptimas.
Principales resultados
- Se obtuvieron imágenes de alto contraste de proteínas.
- Los protocolos detallados se demostraron con éxito.
- Las ayudas visuales mejoraron la comprensión de pasos complejos.
- Los resultados respaldan el uso de tinción negativa ME para el análisis de rutina de proteínas.
Conclusiones
- La tinción negativa ME es un método efectivo para la visualización de proteínas.
- Los protocolos proporcionados pueden ser seguidos fácilmente por usuarios novatos.
- Esta técnica puede complementar otros ensayos bioquímicos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Negative stain electron microscopy (EM) provides rapid, high-contrast visualization of purified proteins and macromolecular complexes, enabling early-stage assessment of sample quality and assembly state. This technique supports critical go/no-go decisions in discovery pipelines by confirming sample homogeneity and complex formation before resource-intensive downstream studies. Its accessibility and reproducibility make it a foundational tool for structural biology teams in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of protein complexes to confirm assembly and integrity.
- Supports rapid assessment of sample homogeneity, reducing ambiguity in target validation.
- Facilitates early detection of aggregation or degradation, de-risking downstream workflows.
- Provides visual evidence to support mechanistic hypotheses in target selection.
Screening & Assay Development
- Validates the quality of protein preparations prior to high-throughput screening or assay development.
- Ensures reproducibility and standardization of sample inputs for quantitative assays.
- Enables scalable preparation of validated EM grids for repeated use in screening campaigns.
- Supports reliable evaluation of compound effects on protein structure or assembly.
Translational & Preclinical Research
- Confirms structural integrity of therapeutic candidates prior to preclinical studies.
- Aligns visual data with biochemical and biophysical assays for translational continuity.
- Reduces risk of advancing structurally compromised candidates into preclinical models.
- Provides foundational data for subsequent 3D reconstruction and mechanistic studies.
Pipeline & Workflow Integration
Negative stain EM is positioned at the interface of protein purification and structural or functional characterization, bridging early discovery and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing protein complexes and assemblies.
- Screening: Confirms sample quality and reproducibility for downstream assays.
- Analytics: Provides high-contrast images for quantitative assessment of sample homogeneity and aggregation.
- Translational Research: Ensures structural fidelity of candidates entering preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, routine assay adaptable across diverse protein targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in sample quality and target validation.
- Operational Value: Delivers rapid, reproducible, and scalable visualization workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EM grid preparation and instrument operation.
- Needs access to electron microscopy infrastructure and staining reagents.
- Demands cross-team standardization for reproducible sample preparation and imaging.
- Adaptable to a wide range of protein sizes and complex types.
- Limited to surface visualization; not suitable for high-resolution internal structure analysis.
