Visualización de las proteínas y complejos macromoleculares de Negative EM Mancha: desde la preparación de la cuadrícula para adquisición de imágenes

El objetivo general de este procedimiento es visualizar muestras de proteínas purificadas mediante microscopía electrónica con tinción negativa. Esto se logra primero preparando las rejillas de microscopía electrónica que soportarán la muestra. El segundo paso del procedimiento consiste en preparar la solución de tinción negativa.

A continuación, la muestra se aplica sobre la rejilla de microscopía electrónica y se tiñe negativamente. Por último, la rejilla de ME se introduce en un microscopio electrónico y se registran imágenes bajo condiciones ópticas adecuadas. Las imágenes convencionales de campo claro y de DEM presentan alto contraste y detalles nítidos, mostrando macromoléculas individuales dispersas sobre un fondo sin características distintivas.

La microscopía electrónica con tinción negativa es un método sencillo para visualizar su proteína de interés. Puede utilizarse como un ensayo rutinario para examinar su proteína purificada, ya sea para análisis estructural o para otros ensayos bioquímicos y biofísicos. Aquí demostramos cómo preparar una muestra teñida negativamente para microscopía electrónica.

La demostración visual de este método es útil, ya que algunos de los pasos son difíciles de aprender a partir de descripciones textuales y figuras. Comience utilizando una pipeta de vidrio para colocar una sola gota de colodión en un vaso de precipitados grande con agua, sobre la superficie del agua. A medida que el colodión se extiende, puede atrapar polvo de la superficie del agua.

Retire y reemplace una película polvorienta de plástico de colodión con otra gota. A continuación, coloque entre 50 y 100 rejillas de microscopía electrónica una por una sobre la película plástica flotante, con el lado brillante hacia abajo. Seleccione rejillas de 400 mallas para tinción negativa de rutina y seleccione rejillas de 200 mallas.

Para recoger imágenes de pares inclinados. Seleccione un trozo de papel de baja absorción sin arrugas que sea ligeramente más grande que el área de las rejillas. Coloque el papel encima de las rejillas y espere hasta que el papel se humedezca completamente.

El papel no debe absorber el agua demasiado rápidamente. Utilizamos papel de un bloc de notas económico. Las rejillas ahora están colocadas entre la película de plástico y el papel.

Utilice un par de pinzas para colocar el papel en una placa de Petri y dejar que se seque lentamente al aire. Evite métodos de secado más rápidos, ya que pueden provocar arrugas. La máquina de recubrimiento de carbono utilizada en nuestro laboratorio es una Creston 2 0 8 C de alto vacío con turbo carbono.

Equipado con un monitor de espesor de película Creston. El monitor utiliza un equilibrio de cuarzo que es sensible a los depósitos de carbono. Sin embargo, el protocolo descrito aquí no requiere este dispositivo. Comience por afilar y cargar las varillas de carbono en una máquina de recubrimiento de carbono.

A continuación, recubra una placa de vidrio con grasa al vacío, dejando la mitad del área mate sin recubrir. Después del recubrimiento con carbono, las regiones engrasadas de la placa se utilizan para estimar el grosor del recubrimiento de carbono. Coloque el papel con las rejillas sobre la platina debajo de la campana de la máquina de recubrimiento con carbono. Posicione la placa de vidrio engrasada.

Deslice junto a las rejillas. Bombee la cámara de vacío hasta alcanzar al menos 10 micrones de mercurio; de lo contrario, las chispas generarán muchas partículas grandes en la rejilla. Ahora aumente la corriente muy lentamente.

La punta afilada de la varilla de carbono se volverá extremadamente brillante. No la observe a simple vista cuando comience el recubrimiento; la lámina de vidrio cambiará de color a un gris oscuro a medida que se acumule el recubrimiento de carbono. Corte la corriente cuando se alcance el espesor deseado de carbono y tenga en cuenta la transparencia del recipiente de campana. Al realizar esta evaluación, una vez que la oscuridad de la lámina se haya calibrado respecto al espesor de carbono, este método es tan preciso como el monitor de espesor de película, más costoso.

Cuando el proceso haya terminado, libere el vacío de la cámara y retire las rejillas recubiertas para su uso posterior. La capa delgada de plástico no afectará la calidad de la imagen teñida negativamente, pero puede eliminarse sumergiendo las rejillas en cloroformo durante varias horas antes de continuar. Prepare una solución fresca de formiato de uranilo o utilice una solución que se haya almacenado en la oscuridad durante menos de dos semanas.

Una solución fresca de buena calidad tiene un color amarillo, un pH de aproximadamente cuatro y fluye muy limpia sin precipitados. Comience utilizando un sistema disponible comercialmente para hacer brillar. Descargue las rejillas recubiertas de carbono.

A continuación, coloque dos gotas de 20 microlitros de agua destilada y dos gotas de 25 microlitros de solución fresca de formiato urinario sobre un trozo de perfil. Utilizando pinzas antirretorno por fuerza capilar, sostenga una rejilla previamente sometida a descarga de luz, con el lado recubierto de carbono hacia arriba. Es fundamental que estas pinzas no aspiren el líquido de las rejillas.

Ahora aplique dos microlitros de la muestra de proteína sobre la rejilla y espere mientras las proteínas se absorben en la rejilla. Esto suele tardar 30 segundos, pero las muestras muy diluidas requerirán más tiempo, lo cual puede afectar las concentraciones del tampón. Una vez finalizado, retire la muestra de proteína con papel de filtro.

Luego lave la rejilla dos veces tocando brevemente su superficie con una gota de agua y secándola con absorción durante unos segundos. Después de que el agua haya tocado brevemente la rejilla, póngala en contacto con una gota de colorante y séquela rápidamente. Utilizando la misma técnica, deje que la rejilla esté en contacto con una segunda gota de colorante durante 20 segundos.

Finalmente, seque la rejilla al aire en la campana extractora del banco de trabajo, o preferiblemente en vacío antes de la sesión de microscopía electrónica, y verifique la alineación del microscopio de microscopía electrónica cargando un archivo de alineación perfeccionado si está disponible, lo que debería restaurarlo a un estado casi perfecto. A continuación, coloque la rejilla de microscopía electrónica en un portaobjetos estándar de inclinación simple. Luego, inserte el portaobjetos en la platina.

Luego espere a que finalice el ciclo de bombeo e inserte el portaobjetos en la columna. Ahora comience a buscar un área de muestra con buena tinción. Enfoque manualmente utilizando el método de contraste mínimo o mediante una cámara CC, D y calcule el cuadro en vivo.

Su espectro de potencia. Luego ajuste el enfoque profundo según sea necesario, generalmente a -1,5 micrómetros. La concentración del tinción puede variar a través de la cuadrícula, por lo tanto busque proteínas con contraste blanco.

Evite áreas con tinción irregular o tinción positiva donde el contraste de la proteína se vuelva negro. Utilizando el enfoque descrito para la preparación de rejillas y la visualización de muestras teñidas negativamente, se obtuvieron imágenes de varias proteínas conocidas con fines de demostración.

Tome nota de sus detalles y alto contraste. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar muestras de macromoléculas teñidas negativamente para su observación en un microscopio electrónico. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente cuatro horas.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la reconstrucción 3D para comprender mejor las estructuras moleculares.