Desarrollo de una manera unilateral-lesionado 6-OHDA modelo de ratón de la enfermedad de Parkinson

El objetivo general de este procedimiento es generar un modelo de ratón de parkinsonismo. Esto se logra preparando primero los medicamentos para la cirugía. El siguiente paso es la instalación del aparato quirúrgico, luego se realiza la cirugía unilateral de la lesión de seis hidroxidopamina siguiendo los cuidados postoperatorios adecuados.

Los seis animales lesionados por hidroxidopamina se pueden utilizar para experimentos de comportamiento. En última instancia, los resultados muestran una depleción de dopamina superior al 95% en el haz cerebral de los cuatro mediales de forma unilateral. Los dos aspectos más importantes de este procedimiento a los que las personas deben prestar atención son, en primer lugar, los cuidados postoperatorios adecuados para garantizar la supervivencia de los animales.

Y en segundo lugar, el cuidado de la preparación del equipo para la infusión de seis hidroxidopamina para garantizar que la entrega de la neurotoxina sea completa. Para comenzar este procedimiento, esterilice las herramientas quirúrgicas en un autoclave. A continuación, limpie todas las superficies y equipos con alcohol isopropílico.

A continuación, prepare el postoperatorio colocando una jaula de recuperación para ratones con toallas de papel en la base. Coloque la jaula debajo de una lámpara térmica o encima de una almohadilla térmica para configurar el carro de anestesia. Asegúrese de que el flujo de entrada de oxígeno esté conectado y abierto, y que el depósito de flúor esté completamente lleno.

Después de eso, ajuste el flujo de oxígeno al 1% y el isof flúor a dos a 4%El siguiente paso es ensamblar el aparato de infusión. Enrosque una tuerca de metal RN en un lado del tubo de pico, seguido de la copa de pico salvaje. A continuación, el PFA salvaje canónico orienta a los salvajes de modo que el cono del PPFA canónico se deslice en la parte de apareamiento de la copa máxima. Salvaje.

A continuación, coloque la copa de pico acoplada y el PFA salvaje canónico en cada extremo del acoplador RN de cubo pequeño doble y apriete la tuerca metálica RN en el otro extremo del acoplador RN de cubo pequeño doble. Inserte una aguja de inyección de calibre 33. Pase la aguja a través de una de las tuercas metálicas RN y apriétela.

Asegúrese de que la aguja de calibre 33 esté en un ángulo de 180 grados con respecto al acoplador RN de cubo pequeño doble. Luego, en el otro extremo del tubo de pico, enrosque una de las tuercas de metal RN seguida de un feral de copa de pico. A continuación, el PFA canónico unde la ranura más profunda del segundo acoplador RN de cubo pequeño doble y apriete la tuerca metálica RN para asegurar la conexión.

A continuación, en el otro extremo del segundo acoplador de cubo RN doble pequeño, inserte el señuelo en el adaptador RN del cubo pequeño y apriete la tuerca metálica RN del señuelo para asegurar la conexión. La configuración del aparato de infusión ya está completa. Otro paso preparatorio es cebar el aparato de infusión.

Primero, llene las jeringas Hamilton de 250 microlitros y un microlitro con agua estéril. Asegúrese de que no haya burbujas de aire. Luego, conecte la jeringa de 250 microlitros al adaptador de señuelo y presione el émbolo de la jeringa de 250 microlitros de modo que el agua se libere a través de la aguja de inyección de calibre 33 en el otro extremo del tubo.

Continúe empujando el agua a través del sistema mientras saca la jeringa de 250 microlitros del adaptador de señuelo. Dejando una pequeña gota de agua en el extremo del adaptador de señuelo, presione el émbolo de la jeringa de un microlitro hasta que se expulse una pequeña gota de agua. A continuación, inserte con cuidado la jeringa de un microlitro en el adaptador de señuelo.

Asegúrese de que la cuenta de agua de la jeringa de un microlitro se conecte con la cuenta de agua del adaptador de señuelo. A continuación, inserte completamente la jeringa de un microlitro en el adaptador de señuelo y asegúrese de que no haya burbujas en el pequeño acoplador de cubo RN doble. Ahora asegure el aparato de perfusión al marco estereotáxico y la bomba de infusión sujete el pequeño acoplador de cubo RN doble con la aguja de inyección de calibre 33 al brazo manipulador del marco estereotáxico.

A continuación, sujete la jeringa de un microlitro a la bomba de perfusión. Después de ese programa, la bomba de infusión permite una tasa de infusión de 0,1 microlitros por minuto, 30 minutos antes de la operación. Pesar al animal y anotar su peso.

Administrar una mezcla de 2,5 miligramos por mililitro de clorhidrato de dopamina y 0,5 miligramos por mililitro de clorhidrato de parlina a 10 mililitros por kilogramo mediante inyección intraperitoneal al ratón. A continuación, coloque un disco calefactor caliente debajo de las barras de la oreja y la barra de incisivos para mantener la temperatura del animal durante la cirugía y mantener al animal a una altura ideal para adaptarse a la oreja y las barras de incisivos del estereotáxico. Fotograma 15 minutos después de la inyección de la mezcla de clorhidrato de dopamina y clorhidrato de parlina.

Coloque al ratón en una cámara cerrada y convulsiva. Anestesiar al animal mediante inhalación de flúor. El animal está suficientemente anestesiado cuando no muestra respuesta al pellizco de la pata trasera y no muestra reflejo de parpadeo.

A continuación, afeita la parte superior de la cabeza del ratón. En este punto, coloque el ratón en el marco estereotáxico. Coloque la barra incisiva en su boca y una máscara de anestesia sobre su cara.

A continuación, ajuste el caudal de isofflúor. Aplique el analgésico tópico lidocaína directamente sobre la piel con algodón. Ajuste la barra de incisivos y los auriculares para nivelar la parte superior del cráneo.

A continuación, esterilizar la piel con la solución de Betadine. A continuación, inserte los auriculares. Los auriculares se insertan correctamente cuando la cabeza está completamente plana y no se puede mover en ninguna dirección.

Después de eso, corte a lo largo de la línea media de la cabeza con una hoja de bisturí y retraiga la piel. Seque la superficie del cráneo con una gasa. Empuje hacia abajo el émbolo de la jeringa de un microlitro y coloque la aguja de inyección de calibre 33 en el tubo de un mililitro de 15 miligramos por mililitro.

Seis soluciones de hidroxidopamina cubiertas de papel de aluminio. Retire el émbolo lentamente mientras mantiene la aguja de inyección de calibre 33 sumergida en la solución de seis hidroxidopamina. A continuación, avance la punta de la aguja de inyección hacia B bgma y dispense una pequeña cantidad de seis soluciones de hidroxidopamina para formar una pequeña perla.

A continuación, baje lentamente la punta de la aguja de inyección torema. Cuando la cuenta toque bgma, deja de avanzar la aguja y registra estas coordenadas. Retraiga la aguja de inyección dos milímetros en la dirección dorsal y muévala a lo largo de la sutura sagital en dirección rostral hacia Lambda.

Cuando esté encima de Lambda, dispense una pequeña cantidad de solución de seis hidroxidopamina de la aguja de inyección para formar una pequeña perla. A continuación, baje lentamente la punta de la aguja hasta lambda. Cuando la cuenta toque Lambda, deje de avanzar la aguja y registre estas coordenadas.

Las coordenadas medial, lateral y ventral dorsal deben ser idénticas para BMA y Lambda. Si no lo están, ajuste la barra incisiva en consecuencia. Para las coordenadas anteroposteriores y las barras de la oreja para las coordenadas laterales mediales, mueva la aguja a las coordenadas de la inyección.

AP menos 1,2 milímetros ml menos 1,1 milímetros torema relativo dispense una pequeña cantidad de solución de la aguja de inyección para formar una pequeña perla. Baja la cuenta pequeña sobre el cráneo para marcar el lugar donde estará el agujero. Luego, el ave retrae la aguja y perfora un agujero en el cráneo con una aguja de calibre 25.

Vuelva a colocar la aguja de inyección en las coordenadas de inyección e inserte la aguja a menos cinco milímetros a lo largo de la dirección ventral dorsal. A continuación, infunda 0,2 microlitros de seis hidroxidopamina o vehículo unilateralmente en el haz mediano del prosencéfalo a una velocidad de 0,1 microlitros por minuto. Una vez finalizada la administración de seis hidroxidopamina o del vehículo, deje la aguja en su lugar durante otros cinco minutos para permitir la difusión desde el lugar de la inyección.

Después de eso, retraiga lentamente la aguja, cierre la incisión al cuero cabelludo con tres suturas, luego administre un mililitro de solución de ringer lactato por vía subcutánea. Por último, retire al animal del marco estereotáxico y colóquelo en la jaula de recuperación hasta que recupere la conciencia. De 15 a 21 días después de seis cirugías de lesiones de hidroxidopamina.

Cuando la cantidad de muerte celular causada por la neurotoxina ha llegado a su fin, se pueden medir rotaciones espontáneas de 360 grados para evaluar el éxito de la lesión de seis hidroxidopamina. En esta evaluación del comportamiento, los ratones con una depleción de dopamina inducida por seis hidroxidopamina superior al 95% muestran significativamente más rotación subversiva IP que los ratones con seis hidroxidopamina parciales y lesiones operadas por shammed. Al correlacionar los niveles de dopamina SAL con el porcentaje de rotación subversiva IP espontánea en cada animal, se encontró que los ratones que exhibieron un 70% o más de rotaciones subversivas IP con seis lesiones de hidroxidopamina perdieron más del 95% de dopamina Sal .

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar de manera efectiva una lesión estereotáxica y controlada por profusión de seis hidroxidopamina en ratones. Esto conducirá a un nivel superior al 95% de agotamiento de dopamina. Además, debe comprender cómo realizar una evaluación conductual del parkinsonismo en ratones.