Desarrollo de una manera unilateral-lesionado 6-OHDA modelo de ratón de la enfermedad de Parkinson

El objetivo general de este procedimiento es generar un modelo murino de parkinsonismo. Esto se logra primero preparando los fármacos para la cirugía. El siguiente paso consiste en configurar el equipo quirúrgico, luego se realiza una cirugía de lesión unilatera con seis hidroxi dopamina, seguida de los cuidados postoperatorios adecuados.

Los animales lesionados con seis hidroxi dopamina pueden utilizarse para experimentos conductuales. En última instancia, los resultados muestran una depleción de dopamina mayor al 95 % en el haz medial de cuatro fibras cerebrales de forma unilateral. Los dos aspectos más importantes de este procedimiento a los que las personas deben prestar atención son, en primer lugar, el cuidado postoperatorio adecuado para garantizar la supervivencia de los animales.

Y en segundo lugar, cuidar la preparación del equipo para la infusión de seis hidroxidopamina para asegurar que la administración de la neurotoxina sea completa. Para comenzar este procedimiento, esterilice las herramientas quirúrgicas en un autoclave. A continuación, limpie todas las superficies y equipos con alcohol isopropílico.

Luego, prepare el postoperatorio configurando una jaula de recuperación para ratones con toallas de papel en la base. Coloque la jaula debajo de una lámpara de calor o sobre una almohadilla calefactora para montar el carro de anestesia. Asegúrese de que la entrada de oxígeno esté conectada y abierta, y de que el depósito de isoflurano esté completamente lleno.

A continuación, ajuste el flujo de oxígeno al 1 % y el isoflurano a entre 2 y 4 %. El siguiente paso es armar el aparato de infusión. Pase una tuerca metálica RN por un extremo del tubo peak, seguida por la copa peak feral. Luego, coloque el feral PFA canónico orientando los ferales de modo que el cono del feral PPFA canónico se deslice dentro de la pieza complementaria de la copa peak feral.

Luego, coloque la copa de pico acoplada y el PFA canónico salvaje en cualquiera de los extremos del acoplador RN de doble conexión pequeña y apriete la tuerca metálica RN en el otro extremo del acoplador RN de doble conexión pequeña. Inserte una aguja de inyección de calibre 33. Pase la aguja a través de una de las tuercas metálicas RN y apriétela.

Asegúrese de que la aguja de calibre 33 forme un ángulo de 180 grados con el acoplador RN de doble pequeño conector. Luego, en el otro extremo del tubo de conexión, coloque una de las tuercas metálicas RN seguida por una copa pico feral. A continuación, coloque la feral PFA estándar en la ranura más profunda del segundo acoplador RN de doble pequeño conector y apriete la tuerca metálica RN para asegurar la conexión.

A continuación, en el otro extremo del segundo acoplador pequeño de doble conexión RN, inserte el cebo en el adaptador pequeño de conexión RN y apriete la tuerca metálica RN del cebo para asegurar la conexión. La configuración del aparato de infusión ya está completa. Otro paso preparatorio consiste en cebear el aparato de infusión.

Primero, llene las jeringas Hamilton de 250 microlitros y un microlitro con agua estéril. Asegúrese de que no haya burbujas de aire. Luego, conecte la jeringa de 250 microlitros al adaptador de cebo y presione el émbolo de la jeringa de 250 microlitros para que el agua salga a través de la aguja de inyección de calibre 33 en el otro extremo del tubo.

Continúe empujando el agua a través del sistema mientras retira la jeringa de 250 microlitros del adaptador del cebo. Dejando una pequeña gota de agua en el extremo del adaptador del cebo, presione el émbolo de la jeringa de un microlitro hasta que se expulse una pequeña gota de agua. A continuación, inserte cuidadosamente la jeringa de un microlitro en el adaptador del cebo.

Asegúrese de que la gota de agua en la jeringa de un microlitro se conecte con la gota de agua en el adaptador del cebo. Luego, inserte completamente la jeringa de un microlitro en el adaptador del cebo y verifique que no haya burbujas en el acoplador pequeño de doble conector RN. Ahora sujete el aparato de perfusión al marco estereotáxico y con la bomba de infusión sujete el acoplador pequeño de doble conector RN con la aguja de inyección de calibre 33 al brazo manipulador del marco estereotáxico.

Luego sujete la jeringa de un microlitro a la bomba de perfusión. A continuación, programe la bomba de infusión para permitir una velocidad de infusión de 0,1 microlitros por minuto, 30 minutos antes de la operación. Pese al animal y registre su peso.

Administre una mezcla de 2,5 miligramos por mililitro de clorhidrato de dopamina y 0,5 miligramos por mililitro de clorhidrato de paralina a 10 mililitros por kilogramo mediante inyección intraperitoneal al ratón. A continuación, coloque un disco calefactor caliente debajo de las barras auriculares y la barra incisiva para mantener la temperatura del animal durante la cirugía y mantenga al animal a una altura ideal para ajustar las barras auriculares e incisiva del estereotáxico. Espere 15 minutos tras la inyección de la mezcla de clorhidrato de dopamina y clorhidrato de paralina.

Coloque el ratón en una cámara cerrada y de convulsiones. Anestesie al animal mediante inhalación de isoflurano. El animal está suficientemente anestesiado cuando no muestra respuesta al pellizco en la pata trasera ni reflejo de parpadeo.

Luego afeite la parte superior de la cabeza del ratón. En este momento, coloque al ratón en el marco estereotáxico. Introduzca la barra incisiva en su boca y coloque una máscara de anestesia sobre su rostro.

Luego ajuste el caudal de isoflurano. Aplique el analgésico tópico lidocaína directamente sobre la piel utilizando algodón. Ajuste la barra incisiva y las copas auriculares para nivelar la parte superior del cráneo.

Luego, esterilice la piel con solución de Betadine. A continuación, inserte las copas auriculares. Las copas auriculares están insertadas correctamente cuando la cabeza está completamente plana y no puede moverse en ninguna dirección.

A continuación, corte a lo largo de la línea media de la cabeza utilizando una hoja de bisturí y retire la piel. Seque la superficie del cráneo con una gasa. Presione hacia abajo el émbolo de la jeringa de un microlitro y coloque la aguja de inyección de calibre 33 dentro del tubo de un mililitro que contiene 15 miligramos por mililitro.

Solución de seis hidroxi dopamina cubierta con papel de aluminio. Retire lentamente el émbolo mientras mantiene la aguja de inyección de 33 gauge sumergida en la solución de seis hidroxi dopamina. A continuación, avance la punta de la aguja de inyección hacia el B bgma, y administre una pequeña cantidad de solución de seis hidroxi dopamina para formar una pequeña gota.

Luego, baje lentamente la punta de la aguja de inyección hacia el foramen magno. Cuando la perla toque el bgma, detenga el avance de la aguja y registre estas coordenadas. Retraiga la aguja de inyección dos milímetros en dirección dorsal y muévase a lo largo de la sutura sagital en dirección rostral hacia Lambda.

Cuando esté encima de Lambda, desprenda una pequeña cantidad de solución de seis hidroxidopamina desde la aguja de inyección para formar una pequeña gota. Luego, baje lentamente la punta de la aguja hasta Lambda. Cuando la gota toque Lambda, detenga el avance de la aguja y registre estas coordenadas.

Las coordenadas medial-lateral y dorsal-ventral deben ser idénticas para el BMA y el Lambda. Si no lo son, ajuste la barra incisiva en consecuencia. Para las coordenadas anterior-posterior y las barras auriculares de las coordenadas medial-lateral, mueva la aguja hasta las coordenadas de inyección.

AP menos 1,2 milímetros ml menos 1,1 milímetros respecto al punto de referencia, dispensar una pequeña cantidad de solución desde la aguja de inyección para formar una pequeña gota. Bajar la pequeña gota hasta el cráneo para marcar la ubicación donde se hará el orificio. Luego retirar la aguja y hacer un orificio en el cráneo utilizando una aguja de calibre 25.

Devuelva la aguja de inyección a las coordenadas de inyección e inserte la aguja hasta menos cinco milímetros en la dirección dorsal-ventral. A continuación, infunda 0,2 µL de seis hidroxidopamina o vehículo unilateralmente en el haz medial del prosencéfalo a una velocidad de 0,1 µL por minuto. Tras completar la administración de seis hidroxidopamina o vehículo, deje la aguja en su lugar durante otros cinco minutos para permitir la difusión desde el sitio de inyección.

Después de eso, retire lentamente la aguja, cierre la incisión en el cuero cabelludo con tres puntos de sutura y luego administre un mililitro de solución de Ringer con lactato por vía subcutánea. Por último, retire al animal del marco estereotáxico y colóquelo en la jaula de recuperación hasta que recupere la conciencia. De 15 a 21 días después de la cirugía de lesión con seis hidroxi dopamina.

Cuando la cantidad de muerte celular provocada por el neurotóxico ha finalizado, se pueden medir rotaciones espontáneas de 360 grados para evaluar el éxito de la lesión por seis hidroxidopamina. En esta evaluación conductual, los ratones con una depleción inducida por seis hidroxidopamina del dopamina mayor al 95 % presentan significativamente más rotaciones ipsiversas que los ratones con lesión parcial por seis hidroxidopamina y los operados simulados. Al correlacionar los niveles de dopamina en la SAL con el porcentaje de rotaciones espontáneas ipsiversas en cada animal, se encuentra que los ratones que exhibieron un 70 % o más de rotaciones ipsiversas tras la lesión por seis hidroxidopamina han perdido más del 95 % de la dopamina en la SAL.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar de manera efectiva una lesión estereotáxica y con perfusión controlada mediante seis hidroxidopamina en ratones. Esto conducirá a una depleción de dopamina superior al 95 %. Además, debería comprender cómo realizar la evaluación conductual del parkinsonismo en ratones.