En vivo doble sustrato bioluminiscentes imagen

Este procedimiento visualiza y cuantifica ran y luciferasa de luciérnaga. Para desarrollar tumores ortotópicos in vivo, comience por construir líneas celulares estables que expresen ran vainilla o luciferasa de luciérnaga, o ambas. Luego, verifique funcionalmente la regulación in vitro del constructo reportero expresado de forma estable.

El siguiente paso consiste en injertar células en el cojín adiposo mamario y obtener y cuantificar las lecturas de luciferasa ran y luciferasa de luciérnaga. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la inmunohistoquímica es que permite una visión longitudinal y dinámica de la regulación génica in vivo durante la progresión tumoral y la metástasis. Comience por transfectar cuatro células de carcinoma de memoria T1 con un vector de expresión que codifique la luciferasa vainilla en cultivo.

Transfíquese bajo una concentración optimizada de antibiótico durante varios días. Luego seleccione aproximadamente 10 colonias individuales que expresen luciferasa ran vanilla para monitorear el grado de expresión. Continúe amplificando las colonias que expresen altas cantidades de luciferasa ran vanilla para análisis funcionales.

Subclonar la región promotora de interés en un plásmido reportero de luciferasa PGL cuatro que contenga un marcador seleccionable distinto al utilizado para seleccionar la expresión estable de vainilla, transfectar las células malignas y seleccionar una población policlonal estable de luciferasa de luciérnaga. Mediante ensayos tradicionales de genes reporteros de luciferasa basados en células in vitro en placas de 96 pocillos, verificar que las células DBR regulen la expresión de luciferasa de luciérnaga de manera concordante con lo observado en células parentales transfectadas transitoriamente. Con estos vectores, colocar las células en un agitador orbital durante 15 minutos para lisar las células.

Asimismo, verifique que la expresión impulsada por CMV de vanilla no esté regulada por diversas estimulaciones celulares ni condiciones de tratamiento. Pase las células de carcinoma metastásico de memoria DBR cuatro uno con baja confluencia el día anterior al planeado. En el paso de inoculación in vivo, disocie las células cuatro uno mediante tripsina para la inoculación.

Lave minuciosamente con medio de crecimiento y diluya las células en PBS inmediatamente. Almacene en hielo. Anestesie ratones hembras de intestino C de cuatro a seis semanas de edad con isoflurano.

Utilizando una pinza, sostenga y levante suavemente el cuarto cojín adiposo inguinal. Coloque cuidadosamente una aguja de calibre 27,5 con el bisel hacia arriba e inyecte directamente en el cojín adiposo debajo del pezón.

Teniendo especial cuidado de no introducir la aguja en la cavidad abdominal. Suelte la glándula e inyecte lentamente 50 microlitros de la suspensión celular en la almohadilla de grasa memoria mientras los ratones aún están anestesiados. Inyecte 100 microlitros de cinética roja en la vena lateral de la cola.

Coloque inmediatamente el ratón en el sistema de imagen IVUS 200 y adquiera una imagen de luz luminiscente durante un minuto. Devuelva el ratón a su jaula durante aproximadamente una hora, lo que asegura que cualquier señal residual de luciferina de ranita haya desaparecido. A continuación, administre la sal potásica de D-luciferina mediante inyección intraperitoneal después de cinco minutos y anestesie el ratón utilizando isoflurano.

Transfiera al IVUS 200 en una posición comparable a la de la adquisición de imagen original con RAN vainilla. Utilice el software de imagen en vivo IVUS configurado en modo fotones. Establezca los valores tanto para la adquisición de fuego como para la de firefly.

Las células 41 altamente agresivas forman tumores palpables dentro de una semana. Por lo tanto, inyecte a los ratones con red eject cine cada semana para monitorear el crecimiento tumoral general y la metástasis. Luego, inyecte d Lucifer para monitorear la señalización específica de la vía durante diversas etapas del desarrollo tumoral.

Supervise el crecimiento del tumor primario normalizando las adquisiciones de luciferasa RAN respecto a las primeras mediciones realizadas en el momento de la inoculación de las células tumorales. Más importante aún, calcule los valores de RLR a lo largo del tiempo para establecer la regulación temporal de sistemas de señalización individuales en relación con el crecimiento y progresión del tumor. A continuación, compare los valores de RLR pulmonares con aquellos calculados para el tumor primario, con el fin de establecer la regulación espacial de los sistemas de señalización individuales en relación con el crecimiento tumoral y la metástasis.

Se utilizan imágenes bioluminiscentes duales para visualizar y rastrear los cambios en la composición celular dentro del tumor primario. Primero, mezcle células T4 expresando luciferasa vainilla con sus contrapartes T47 no metastásicas e isogénicas que expresan luciferasa de luciérnaga, luego inyecte diferentes proporciones de estas poblaciones mixtas de células cancerosas de mama en el tejido adiposo mamario, como se mostró anteriormente. Adquiera inmediatamente ambas imágenes de luciferasa de luciérnaga y luciferasa vainilla para establecer la RS inicial representativa de una mezcla determinada de células inoculadas.

Continúe obteniendo imágenes longitudinales duales de bioluminiscencia para representar la composición celular dentro del tumor primario. También evalúe la metástasis espacio-temporal de cada derivado del cáncer de mama en relación con el crecimiento y la progresión del tumor. Dado que cada imagen es internamente consistente y controlada, la señal persistente del tumor primario es una métrica importante para evaluar el fracaso general del sucesor en cada adquisición de datos de vainilla y luciérnaga.

El sustrato de linina es altamente sensible a la oxidación, lo que resulta en auto-luminiscencia. Aquí, una inyección intravenosa fallida de lanina produce una señal no específica del tracto intestinal, no del tumor primario establecido. En esta adquisición renal exitosa de un ratón portador de un tumor primario 41 y metástasis pulmonares, se pueden obtener mediciones específicas de la vía de señalización a partir de la imagen de luciferasa de luciérnaga.

Estos datos permiten el cálculo de RS tanto del tumor primario como de sus metástasis pulmonares. Tras la finalización de este experimento, otras técnicas como la inmunohistoquímica y la hibridación in situ pueden utilizarse para verificar que la regulación del ARNm y la proteína ocurre de manera similar a la del constructo informado.