Name: En vivo doble sustrato bioluminiscentes imagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Aprende a visualizar y cuantificar la actividad de luciferasas de luciérnaga y renilla en modelos de cáncer de mama metastásico in vivo. Este método permite un seguimiento longitudinal de la regulación génica durante la progresión tumoral.

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W.P.S. recibió apoyo parcial de subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (CA129359), la Fundación Susan G. Komen for the Cure (BCTR0706967), el Departamento de Defensa (BC084561) y el Centro de Cáncer Seidman, mientras que M.K.W. recibió apoyo mediante una beca de la Sociedad Estadounidense contra el Cáncer (PF-09-120-01). Este trabajo contó además con apoyo adicional del Centro Case para la Investigación de Imágenes, el Centro Integral de Cáncer Case (P30 CA43703) y el Centro de Fibrosis Quística (P30 DK027651).

1. Expresión estable de luciferasa Renilla impulsada por CMV
<ol>
	<li>La transfección y selección de una población clonal estable es el método preferido para la expresión de este reportero de luciferasa renilla. Este enfoque proporciona una expresión más consistente y uniforme de la luciferasa renilla tras la introducción subsiguiente de constructos reporteros adicionales secundarios (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga o proteínas fluorescentes).</li>
	<li>Transfecte células malignas de interés con el vector de expresión que codifica la luciferasa renilla, como pcDNA3.1-Hygro o cualquier otro plásmido que contenga un marcador seleccionable.</li>
	<li>Tras la transfección, coloque los transfectantes bajo una concentración optimizada de antibiótico durante varios días hasta semanas para facilitar el aislamiento de colonias individuales, que posteriormente se aíslan individualmente y se subcultivan.</li>
	<li>Seleccione ≥10 colonias individuales que expresen luciferasa renilla para monitorear el grado de expresión de renilla.</li>
	<li>Las colonias que expresan grandes cantidades de luciferasa renilla se someten posteriormente a análisis funcionales para asegurar que (i) se mantienen las propiedades fisiopatológicas de sus contrapartes parentales, y (ii) los valores de expresión de renilla no se desvíen ni cambien con el tiempo. Estos pasos son absolutamente esenciales para evitar el aislamiento y estudio de variantes o desviaciones clonales, y para validar la integración adecuada del constructo de renilla en el genoma.</li>
	<li>Una vez aislado y verificado un transfectante estable, se puede eliminar la presión selectiva y tener la certeza de que la expresión de la luciferasa renilla permanecerá constante durante largos períodos de tiempo tanto in vitro como in vivo.</li>
</ol>
2. Expresión, selección y verificación funcional de la luciferasa de luciérnaga impulsada por un promotor inducible
<ol>
	<li>Subclonar el promotor de interés en un plásmido reportero pGL4-luciferasa que contenga un marcador seleccionable (por ejemplo, puromicina) distinto al utilizado para seleccionar la expresión estable de renilla (por ejemplo, higromicina).</li>
	<li>Transfectar células malignas como en el Paso I, y posteriormente seleccionar una población policlonal estable de células que expresen luciferasa de luciérnaga. Dado que la ubicación donde un gen reportero se integra en el genoma puede provocar efectos erróneos sobre su expresión y regulación, se recomienda encarecidamente seleccionar poblaciones policlonales de células que expresen luciferasa de luciérnaga, en lugar de poblaciones clonales, con el fin de garantizar que (i) la expresión del gen reportero refleje con mayor precisión la del gen endógeno en las células parentales; y (ii) los efectos de integración sobre la expresión génica se promedien y reduzcan a lo largo de la población celular heterogénea.</li>
	<li>Las células malignas modificadas genéticamente para expresar de forma estable tanto renilla como luciferasa de luciérnaga se denominan colectivamente células reporteras bifotoluminiscentes, o células DBR.</li>
	<li>Mediante ensayos tradicionales in vitro basados en células para genes reporteros luciferasa, verificar que las células DBR regulen la expresión de luciferasa de luciérnaga, ya sea positiva o negativamente, de manera concordante con lo observado en células parentales transfectadas transitoriamente con estos vectores. Asimismo, verificar que la expresión de renilla impulsada por CMV no sea regulada por diversas estimulaciones celulares ni por condiciones de tratamiento.</li>
	<li>Para ello, cultivar células DBR y células parentales en placas de 24 pocillos, y posteriormente transfectar transitoriamente las células parentales con los constructos originales de CMV-renilla y promotor-luciferasa de luciérnaga utilizados para generar las células DBR.</li>
	<li>Posteriormente, tratar las células DBR y las células parentales transfectadas con factores o agentes farmacológicos conocidos por regular el promotor de interés, y cuantificar luego la luminiscencia de luciferasa de luciérnaga y renilla utilizando el Kit de Ensayo Dual Luciferasa de Promega.</li>
</ol>
3. Establecimiento de tumores mamarios primarios 4T1
<ol>
	<li>Las células de carcinoma mamario 4T1 metastásico que se descubrió que carecían de patógenos roedores adventicios fueron modificadas genéticamente para expresar establemente una luciferasa de renilla impulsada por CMV (pcDNA3.1-CMV-renilla luciferase-hygro) y una luciferasa de luciérnaga impulsada por SBE (pGL4.2-SBE-firefly luciferase-puro), como se describió anteriormente. El trasplante ortotópico de estas células de cáncer de mama da lugar a la formación de metástasis espontáneas principalmente en los pulmones.</li>
	<li>Las células 4T1 no deben permitirse alcanzar la confluencia durante su propagación en sistemas tradicionales de cultivo celular en 2 dimensiones, y deben ser pasadas el día anterior a su inoculación in vivo.</li>
	<li>Las células 4T1 deben disociarse mediante tripsinización, lavarse completamente en medio de crecimiento y diluirse en PBS a una concentración de 2x105 células/ml, y almacenarse inmediatamente en hielo.</li>
	<li>Los ratones hembra Balb/C (de 4 a 6 semanas de edad) deben anestesiarse con una dosis de inducción de isoflurano al 3% y mantenerse bajo anestesia con una dosis de mantenimiento de isoflurano al 1%. Prepare el sitio de inyección limpiándolo con alcohol isopropílico al 70%. Usando una pinza, agarre y levante suavemente la almohadilla mamaria inguinal número 4. Con cuidado, coloque una aguja de calibre 27,5 con el bisel hacia arriba e introdúzcala en la almohadilla grasa mamaria directamente debajo del pezón, teniendo especial cuidado de no introducir la aguja en la cavidad abdominal. Suelte la glándula e inyecte lentamente 50 μl de la suspensión celular (1x104 células) en la almohadilla grasa mamaria.</li>
</ol>
4. Imagen dual luminiscente inicial
<ol>
	<li>Inmediatamente después de injertar las células 4T1 en la almohadilla de grasa mamaria y mientras los ratones aún están anestesiados, inyectar 100 μl de RediJect Coelenterazina en la vena lateral de la cola. Esta es la concentración de sustrato óptima recomendada por el proveedor y la mejor tolerada por el animal.</li>
	<li>Coloque inmediatamente el ratón dentro del cono nasal de isoflurano del sistema de imagen IVIS-200 y adquiera una imagen luminiscente de 0,5 a 1 minuto de duración. Es muy importante realizar la adquisición de la imagen rápidamente tras la inyección, ya que la señal de la luciferasa de renilla disminuye bruscamente aproximadamente 30 segundos después de la inyección. Devuelva el ratón a su jaula y permita que se recupere durante al menos 1 hora, lo que garantiza que cualquier señal residual de luciferasa de renilla haya desaparecido y que el ratón se haya recuperado completamente de la anestesia.</li>
	<li>Administrar 150 mg/kg de sal potásica de D-luciferina mediante Inyección i.p. y esperar 5 minutos. Esta es la concentración óptima de D-luciferina, que proporciona una señal luminiscente estable durante 5-15 minutos tras su inyección en los animales de prueba. Anestesiar al ratón con isoflurano y colocarlo nuevamente en el IVIS-200, teniendo cuidado de posicionar al animal en una posición muy similar respecto a la adquisición original de renilla. La intensidad general de esta señal de luciérnaga dependerá de la actividad del promotor de interés, y por lo tanto, la visualización de la actividad de la luciferasa de luciérnaga puede requerir tiempos de adquisición prolongados.</li>
	<li>Utilizando el software IVIS Living Image configurado en el modo "fotones", establezca los valores para las adquisiciones de renilla y luciérnaga como medio para determinar las relaciones de luminiscencia relativa (RLR) de referencia.</li>
</ol>
5. Imagen longitudinal luminiscente
<ol>
	<li>Las células 4T1 son altamente agresivas, de modo que la inoculación de 1x104 células generalmente provoca la formación de tumores palpables dentro de 1 semana, y la letalidad del animal dentro de 4-5 semanas. Los tumores 4T1 tienen una tendencia intrínseca a ulcerarse en la semana 4. El crecimiento y mantenimiento de tumores ulcerados puede requerir una aprobación separada del IACUC. Los estudios con tumores 4T1 mostrados aquí han sido aprobados por el IACUC de la Universidad Case Western Reserve.</li>
	<li>Como se describió anteriormente, los ratones deben inyectarse semanalmente con RediJect Coelenterazine para monitorear el crecimiento general del tumor y la metástasis, así como con D-luciferina para monitorear la señalización específica de la vía durante diversas etapas del desarrollo tumoral. Tenga cuidado cada vez de asegurarse de que la señal de luciferasa renilla haya desaparecido completamente antes de adquirir la señal de luciferasa de luciérnaga.</li>
	<li>A medida que los tumores 4T1 se desarrollan y progresan, las adquisiciones de luciferasa renilla deben normalizarse respecto a los valores iniciales de renilla medidos en el momento de la inoculación de las células tumorales, como medio para normalizar y rastrear el crecimiento del tumor primario. Más importante aún, el cálculo de los valores de RLR a lo largo del tiempo establecerá la regulación temporal de sistemas de señalización individuales en relación con el crecimiento y progresión del tumor.</li>
	<li>La metástasis pulmonar evidente se vuelve aparente dentro de las 3-4 semanas posteriores al trasplante de células 4T1 en la almohadilla de grasa mamaria. Comparar los valores de RLR pulmonar versus los calculados para el tumor primario establece la regulación espacial de sistemas de señalización individuales en relación con el crecimiento tumoral y la metástasis.</li>
</ol>
6. Doble imagen bioluminiscente de dos tipos celulares únicos en un solo animal
<ol>
	<li>Modifique una línea celular de cáncer de mama para expresar establemente luciferasa renilla impulsada por CMV, como se describió anteriormente. Repita este proceso de modificación utilizando luciferasa luciérnaga impulsada por CMV en una segunda línea celular de cáncer de mama distinta.</li>
	<li>Aquí mezclamos células 4T1 que expresan luciferasa renilla con sus contrapartes no metastásicas e isogénicas 4T07 que expresan luciferasa luciérnaga10, 11. Se inyectan posteriormente distintas proporciones de estas poblaciones mixtas de células cancerosas de mama en el tejido adiposo mamario, como se describió anteriormente.</li>
	<li>Adquiera inmediatamente imágenes de luciferasa luciérnaga y renilla para establecer relaciones renilla/luciérnaga (RLR) iniciales representativas de una mezcla celular inoculada determinada.</li>
	<li>La imagen dual longitudinal de bioluminiscencia permitirá visualizar y rastrear los cambios en la composición celular dentro del tumor primario, así como la metástasis espacio-temporal de cada derivado del cáncer de mama en relación con el crecimiento y progresión del tumor.</li>
	<li>Alternativamente, se pueden inocular poblaciones celulares individuales de cáncer de mama en diferentes ubicaciones del ratón (es decir, en los tejidos adiposos mamarios abdominales derecho e izquierdo) para evaluar las influencias sistémicas que estas dos poblaciones ejercen entre sí durante diversas etapas del crecimiento tumoral y la metástasis.</li>
</ol>
7. Resultados representativos:
Una gran ventaja de la imagen dual bioluminiscente radica en que cada imagen es internamente consistente y controlada, de modo que las señales continuas derivadas del tumor primario funcionan como una métrica importante para evaluar el éxito o fracaso general de cada adquisición de renilla y luciferasa de luciérnaga. Este aspecto del procedimiento de imagen es particularmente importante durante la adquisición de la actividad de la luciferasa de renilla, cuyo sustrato coelenteracina es altamente sensible a la oxidación, lo que provoca su capacidad de auto-luminiscencia. La figura 1A muestra un ejemplo de este efecto secundario, que se manifiesta inmediatamente como señales luminiscentes inespecíficas derivadas del tracto intestinal, no del tumor primario establecido. Típicamente, estas señales inespecíficas de coelenteracina ocurren tras inyecciones intravenosas fallidas de este sustrato de luciferasa de renilla. Sin embargo, una vez que se han obtenido señales robustas de renilla derivadas del tumor primario (figura 1B, imagen izquierda), es seguro proceder a capturar mediciones de señalización específicas de la vía derivadas de la imagen de luciferasa de luciérnaga (figura 1B, panel derecho), cuyo sustrato D-luciferina es altamente estable tras la inyección intraperitoneal y produce niveles despreciables de auto-luminiscencia de fondo.
<img alt="Imagen de bioluminiscencia: ensayos CMV-renilla y SBE-luciérnaga, detección de tumores, gráfico de análisis de señales." src="/files/ftp_upload/3245/3245fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Adquisición de imágenes bioluminiscentes derivadas de renilla y luciérnaga para calcular RLR in vivo. (A) Un ejemplo de inyección intravenosa fallida de coelenteracina que resulta en una señal inespecífica proveniente del tracto intestinal. El círculo y PT indican la ubicación aproximada del tumor primario. (B) Adquisición exitosa de renilla en un ratón con un tumor primario 4T1 y metástasis pulmonares (panel izquierdo; 4 semanas después del injerto en la almohadilla grasa). La adquisición correspondiente de luciérnaga permite el cálculo de RLR tanto del tumor primario como de sus metástasis pulmonares. (C) Representación gráfica de los RLR del tumor primario y de la metástasis pulmonar calculados a partir de los ratones mostrados en el panel B (n=4).

<ol><li>Wetterwald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+cancer+metastasis+to+bone+marrow%3A+a+mouse+model+of+minimal+residual+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of cancer metastasis to bone marrow: a mouse model of minimal residual disease.</a> Am. J. Pathol. 160, 1143-1153 (2002).</li>
<li>Wendt, M. K., Drury, L. J., Vongsa, R. A., Dwinell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+CXCL12+Expression+Induces+Anoikis+in+Colorectal+Carcinoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Constitutive CXCL12 Expression Induces Anoikis in Colorectal Carcinoma Cells.</a> Gastroenterology. 135, 508-508 (2008).</li>
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<li>Korpal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+transforming+growth+factor-beta+signaling+dynamics+and+therapeutic+response+in+breast+cancer+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Imaging transforming growth factor-beta signaling dynamics and therapeutic response in breast cancer bone metastasis.</a> Nat Med. , (2009).</li>
<li>Giampieri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+and+reversible+TGFbeta+signalling+switches+breast+cancer+cells+from+cohesive+to+single+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized and reversible TGFbeta signalling switches breast cancer cells from cohesive to single cell motility.</a> Nat Cell Biol. 11, 1287-1296 (2009).</li>
<li>Giampieri, S., Pinner, S., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+illuminates+transforming+growth+factor+beta+signaling+switches+during+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging illuminates transforming growth factor beta signaling switches during metastasis.</a> Cancer Res. 70, 3435-3439 (2010).</li>
<li>DeNardo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29+T+cells+regulate+pulmonary+metastasis+of+mammary+carcinomas+by+enhancing+protumor+properties+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">CD4(+) T cells regulate pulmonary metastasis of mammary carcinomas by enhancing protumor properties of macrophages.</a> Cancer Cell. 16, 91-102 (2009).</li>
<li>Wyckoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Paracrine+Loop+between+Tumor+Cells+and+Macrophages+Is+Required+for+Tumor+Cell+Migration+in+Mammary+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A Paracrine Loop between Tumor Cells and Macrophages Is Required for Tumor Cell Migration in Mammary Tumors.</a> Cancer Res. 64, 7022-7029 (2004).</li>
<li>Kim, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+self-seeding+by+circulating+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor self-seeding by circulating cancer cells.</a> Cell. 139, 1315-1326 (2009).</li>
<li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Res. 52, 1399-1405 (1992).</li>
<li>Wendt, M. K., Smith, J. A., Schiemann, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta-induced+epithelial-mesenchymal+transition+facilitates+epidermal+growth+factor-dependent+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta-induced epithelial-mesenchymal transition facilitates epidermal growth factor-dependent breast cancer progression.</a> Oncogene. 29, 6485-6498 (2010).</li>
<li>Hawkins, E., Unch, J., Murhpy, N., Vidugiriene, J., Scurria, M., Klaubert, D., Wood, K. Bright Light, No Lysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHawkins%2C+E+%22Measuring+Renilla+Luciferase+Luminescence+in+Living+Cells%22">Measuring Renilla Luciferase Luminescence in Living Cells</a>. , Promega. (2005).</li>
<li>Roncali, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+device+for+real-time+bioluminescence+imaging+in+moving+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">New device for real-time bioluminescence imaging in moving rodents.</a> J. Biomed. Opt. 13, 054035-054035 (2008).</li>
</ol>

No se declararon conflictos de intereses.

El poder absoluto de las técnicas de imagen bioluminiscente radica en su capacidad para cuantificar el crecimiento tumoral y la metástasis en estudios longitudinales complejos, que en este caso implicaron el uso de células agresivas de cáncer de mama 4T1. Dado que estos procedimientos dependen de la integración estable de constructos reporteros de luciferasa, estas técnicas pueden adaptarse y trasladarse fácilmente a otras líneas celulares de cáncer con distintas latencias tumorales y capacidades metastásicas. De forma similar a los resultados mostrados aquí, calcular tasas específicas de RLR dentro de tumores primarios de desarrollo lento y sus metástasis subsiguientes permite la identificación espaciotemporal en tiempo real de eventos de señalización específicos que ocurren durante la progresión metastásica de los tumores, independientemente de su duración de latencia. Tras la identificación de eventos reguladores específicos del promotor, es importante extirpar tanto el tumor primario como sus lesiones metastásicas para realizar análisis estándar de inmunohistoquímica y de expresión génica diferencial, con el fin de verificar una regulación similar del gen y/o proteína endógenos.
Técnicamente hablando, el desafío principal de los análisis bifotoluminiscentes radica en la duración relativamente corta de las señales de luciferasa de renilla. Por ello, esta técnica de imagen requiere una optimización considerable del procedimiento de inyección en la vena caudal, así como la realización inmediata de imágenes en animales inyectados individualmente, un proceso que consume mucho tiempo y es algo ineficiente en comparación con la obtención de imágenes de luciferasa de luciérnaga. Recientemente, Promega introdujo "Viviren", un sustrato de luciferasa de segunda generación cuyos sitios de oxidación están bloqueados mediante esterificación hasta que esta molécula ingresa a las células, momento en el cual se desesterifica rápidamente. En conjunto, este sustrato novedoso reduce eficazmente la autofotoluminiscencia y la modificación y/o degradación no específica asociada a la autofotoluminiscencia inducida por renilla 12. Al hacerlo, este nuevo sustrato de luciferasa de renilla produce señales fotoluminiscentes más brillantes; sin embargo, los costos excesivos relacionados con la adquisición y el uso de "Viviren" han limitado considerablemente los estudios necesarios para evaluar la utilidad general de este sustrato en análisis bifotoluminiscentes. Por último, la sensibilidad de cualquier ensayo fotoluminiscente depende críticamente de la cámara CCD que opera en la adquisición de unidades individuales de luz. De hecho, a medida que estas tecnologías mejoran, prevemos un punto en el futuro en el que nuestra capacidad para visualizar reacciones bioluminiscentes complejas mediadas por luz podría llevarse a cabo eficientemente en animales en movimiento libre 13.

<table><tbody><tr><td>pGL4.2-Puro [&lt;em&gt;luc2&lt;/em&gt;/Puro] Vector</td><td>Promega Corp.</td><td>E6751</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Glomax Multidetección</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS serie 200</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de ensayo de luciferasa dual</td><td>Promega Corp.</td><td>E1960</td><td></td></tr><tr><td>Rediject c&amp;#8211;lenteracina-h</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>760506</td><td></td></tr><tr><td>Sal de potasio de D-luciferina</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>122796</td><td></td></tr></tbody></table>

en vivo doble sustrato bioluminiscentes imagen

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Nuestro entendimiento sobre cómo y cuándo las células del cáncer de mama transitan desde tumores primarios establecidos hacia sitios metastásicos ha aumentado a un ritmo excepcional desde la aparición de las tecnologías de imagen bioluminiscente in vivo 1-3. De hecho, la capacidad de localizar y cuantificar longitudinalmente el crecimiento tumoral en un solo grupo de animales hasta la finalización del estudio, en lugar de sacrificar grupos individuales de animales en tiempos específicos del ensayo, ha revolucionado la forma en que los investigadores estudian la metástasis del cáncer de mama. Desafortunadamente, las metodologías actuales excluyen la evaluación en tiempo real de los cambios críticos que ocurren en los sistemas de señalización celular mientras las células del cáncer de mama (i) evolucionan dentro de los tumores primarios, (ii) se diseminan por todo el cuerpo y (iii) reinician programas proliferativos en los sitios de una lesión metastásica. Sin embargo, avances recientes en la imagen bioluminiscente ahora permiten cuantificar simultáneamente cambios espaciotemporales específicos en la expresión génica en función del desarrollo tumoral y la progresión metastásica mediante reacciones de luminiscencia con sustratos duales. Para ello, los investigadores aprovechan dos enzimas luciferasas productoras de luz aisladas de la luciérnaga (Photinus pyralis) y de la anémona de mar (Renilla reniformis), ambas reaccionando a sustratos mutuamente excluyentes, lo que anteriormente facilitó su uso extendido en ensayos in vitro de genes reporteros basados en células 4. Aquí demostramos la utilidad in vivo de estas dos enzimas, de modo que una reacción de luminiscencia marca específicamente el tamaño y la ubicación de un tumor en desarrollo, mientras que la segunda reacción luminiscente sirve para visualizar el estado de activación de sistemas de señalización específicos durante etapas definidas del desarrollo del tumor y de la metástasis. Por lo tanto, los objetivos de este estudio son dobles. Primero, describiremos los pasos necesarios para construir líneas celulares reporteras bioluminiscentes duales, así como aquellos requeridos para facilitar su uso en la visualización de la regulación espaciotemporal de la expresión génica durante etapas específicas de la cascada metastásica. Utilizando el modelo 4T1 de metástasis del cáncer de mama, mostramos que la actividad in vivo de un promotor sintético del Elemento de Unión a Smad (SBE) disminuyó drásticamente en la metástasis pulmonar en comparación con la medida en el tumor primario 4-6. Recientemente, se ha demostrado que la metástasis del cáncer de mama está regulada por cambios en el microambiente del tumor primario y en el estroma reactivo, incluyendo los que ocurren en fibroblastos y células inmunitarias infiltrantes 7-9. Así, nuestro segundo objetivo será demostrar la utilidad de las técnicas bioluminiscentes duales para monitorear el crecimiento y la localización de dos poblaciones celulares únicas alojadas dentro de un solo animal durante el crecimiento y la metástasis del cáncer de mama.

Aquí describimos los métodos para construir, visualizar y cuantificar las reacciones bioluminiscentes de las enzimas luciferasa de luciérnaga y luciferasa de Renilla expresadas en células de cáncer de mama metastásico durante su crecimiento y metástasis. in vivo.

En vivo doble sustrato bioluminiscentes imagen

Nuestra comprensión sobre cómo y cuándo las células del cáncer de mama transitan desde los tumores primarios establecidos hacia los sitios metastásicos ha aumentado a un ritmo excepcional...

Este procedimiento visualiza y cuantifica ran y luciferasa de luciérnaga. Para desarrollar tumores ortotópicos in vivo, comience por construir líneas celulares estables que expresen ran vainilla o luciferasa de luciérnaga, o ambas. Luego, verifique funcionalmente la regulación in vitro del constructo reportero expresado de forma estable.El siguiente paso consiste en injertar células en el cojín adiposo mamario y obtener y cuantificar las lecturas de luciferasa ran y luciferasa de luciérnaga. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la inmunohistoquímica es que permite una visión longitudinal y dinámica de la regulación génica in vivo durante la progresión tumoral y la metástasis. Comience por transfectar cuatro células de carcinoma de memoria T1 con un vector de expresión que codifique la luciferasa vainilla en cultivo.Transfíquese bajo una concentración optimizada de antibiótico durante varios días. Luego seleccione aproximadamente 10 colonias individuales que expresen luciferasa ran vanilla para monitorear el grado de expresión. Continúe amplificando las colonias que expresen altas cantidades de luciferasa ran vanilla para análisis funcionales.Subclonar la región promotora de interés en un plásmido reportero de luciferasa PGL cuatro que contenga un marcador seleccionable distinto al utilizado para seleccionar la expresión estable de vainilla, transfectar las células malignas y seleccionar una población policlonal estable de luciferasa de luciérnaga. Mediante ensayos tradicionales de genes reporteros de luciferasa basados en células in vitro en placas de 96 pocillos, verificar que las células DBR regulen la expresión de luciferasa de luciérnaga de manera concordante con lo observado en células parentales transfectadas transitoriamente. Con estos vectores, colocar las células en un agitador orbital durante 15 minutos para lisar las células.Asimismo, verifique que la expresión impulsada por CMV de vanilla no esté regulada por diversas estimulaciones celulares ni condiciones de tratamiento. Pase las células de carcinoma metastásico de memoria DBR cuatro uno con baja confluencia el día anterior al planeado. En el paso de inoculación in vivo, disocie las células cuatro uno mediante tripsina para la inoculación.Lave minuciosamente con medio de crecimiento y diluya las células en PBS inmediatamente. Almacene en hielo. Anestesie ratones hembras de intestino C de cuatro a seis semanas de edad con isoflurano.Utilizando una pinza, sostenga y levante suavemente el cuarto cojín adiposo inguinal. Coloque cuidadosamente una aguja de calibre 27,5 con el bisel hacia arriba e inyecte directamente en el cojín adiposo debajo del pezón.Teniendo especial cuidado de no introducir la aguja en la cavidad abdominal. Suelte la glándula e inyecte lentamente 50 microlitros de la suspensión celular en la almohadilla de grasa memoria mientras los ratones aún están anestesiados. Inyecte 100 microlitros de cinética roja en la vena lateral de la cola.Coloque inmediatamente el ratón en el sistema de imagen IVUS 200 y adquiera una imagen de luz luminiscente durante un minuto. Devuelva el ratón a su jaula durante aproximadamente una hora, lo que asegura que cualquier señal residual de luciferina de ranita haya desaparecido. A continuación, administre la sal potásica de D-luciferina mediante inyección intraperitoneal después de cinco minutos y anestesie el ratón utilizando isoflurano.Transfiera al IVUS 200 en una posición comparable a la de la adquisición de imagen original con RAN vainilla. Utilice el software de imagen en vivo IVUS configurado en modo fotones. Establezca los valores tanto para la adquisición de fuego como para la de firefly.Las células 41 altamente agresivas forman tumores palpables dentro de una semana. Por lo tanto, inyecte a los ratones con red eject cine cada semana para monitorear el crecimiento tumoral general y la metástasis. Luego, inyecte d Lucifer para monitorear la señalización específica de la vía durante diversas etapas del desarrollo tumoral.Supervise el crecimiento del tumor primario normalizando las adquisiciones de luciferasa RAN respecto a las primeras mediciones realizadas en el momento de la inoculación de las células tumorales. Más importante aún, calcule los valores de RLR a lo largo del tiempo para establecer la regulación temporal de sistemas de señalización individuales en relación con el crecimiento y progresión del tumor. A continuación, compare los valores de RLR pulmonares con aquellos calculados para el tumor primario, con el fin de establecer la regulación espacial de los sistemas de señalización individuales en relación con el crecimiento tumoral y la metástasis.Se utilizan imágenes bioluminiscentes duales para visualizar y rastrear los cambios en la composición celular dentro del tumor primario. Primero, mezcle células T4 expresando luciferasa vainilla con sus contrapartes T47 no metastásicas e isogénicas que expresan luciferasa de luciérnaga, luego inyecte diferentes proporciones de estas poblaciones mixtas de células cancerosas de mama en el tejido adiposo mamario, como se mostró anteriormente. Adquiera inmediatamente ambas imágenes de luciferasa de luciérnaga y luciferasa vainilla para establecer la RS inicial representativa de una mezcla determinada de células inoculadas.Continúe obteniendo imágenes longitudinales duales de bioluminiscencia para representar la composición celular dentro del tumor primario. También evalúe la metástasis espacio-temporal de cada derivado del cáncer de mama en relación con el crecimiento y la progresión del tumor. Dado que cada imagen es internamente consistente y controlada, la señal persistente del tumor primario es una métrica importante para evaluar el fracaso general del sucesor en cada adquisición de datos de vainilla y luciérnaga.El sustrato de linina es altamente sensible a la oxidación, lo que resulta en auto-luminiscencia. Aquí, una inyección intravenosa fallida de lanina produce una señal no específica del tracto intestinal, no del tumor primario establecido. En esta adquisición renal exitosa de un ratón portador de un tumor primario 41 y metástasis pulmonares, se pueden obtener mediciones específicas de la vía de señalización a partir de la imagen de luciferasa de luciérnaga.Estos datos permiten el cálculo de RS tanto del tumor primario como de sus metástasis pulmonares. Tras la finalización de este experimento, otras técnicas como la inmunohistoquímica y la hibridación in situ pueden utilizarse para verificar que la regulación del ARNm y la proteína ocurre de manera similar a la del constructo informado.

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