Derivación eficiente de los Derechos Humanos precursores cardiacos y cardiomiocitos de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

El objetivo general del siguiente experimento consiste en obtener progenie cardíaca de forma directa y exclusiva a partir de células madre embrionarias humanas pluripotentes mediante la inducción con moléculas pequeñas. Esto se logra añadiendo nicotinamida a células ES humanas indiferenciadas mantenidas en condiciones definidas. A continuación, las células en proceso de diferenciación cardíaca se separan para formar cardioblastos, agrupaciones celulares flotantes en un cultivo en suspensión.

Una vez formados, los cardio blástulos se adhieren a un medio de diferenciación cardíaca en el que continúan desarrollándose hasta convertirse en cardiomiocitos contráctiles. Finalmente, los resultados se evalúan mediante inmunofluorescencia con microscopía de desconvolución o confocal y mediante grabaciones electrofisiológicas. La principal ventaja de esta técnica es que permite la inducción eficiente de células madre embrionarias humanas pluripotentes exclusivamente hacia una línea cardíaca mediante la simple adición de moléculas pequeñas.

Mientras que en los métodos existentes de diferenciación multilínea, solo una pequeña fracción de células adopta un fenotipo cardíaco. Hay algunos pasos que deben tenerse en cuenta al preparar soluciones madre. Tenga cuidado de descongelar lentamente la matrigel y la laminina humana de menos 80 grados Celsius a cuatro grados Celsius durante la noche, almacene los medios a cuatro grados Celsius y siempre caliente los medios a 37 grados Celsius antes de su uso.

Además, al preparar el medio para células madre humanas, algunos de los suplementos se agregan justo antes de usarlo. Estos incluyen BFGF, ácido ascórbico, insulina humana activa en A y transferina. A continuación, prepare las soluciones de trabajo de matrigel o laminina humana inmediatamente antes del recubrimiento de las placas.

Incubar las placas a 37 grados SIU en dióxido de carbono al 5 % después de preparar las placas de cultivo celular recubiertas previamente con gelatina. La gelatina puede sustituirse por la solución de trabajo de gel de matra o laminina. Recubrir estas placas incubándolas durante la noche a cuatro grados Celsius.

Comience permitiendo que las colonias de células ES humanas crezcan durante cinco a siete días y luego prepárese para dividir algunas de ellas. Seleccione colonias con más del 75 % de células ES humanas indiferenciadas. Por lo general, estas colonias son ligeramente opacas, con bordes definidos y contienen células apiladas. Una indicación del inicio de la diferenciación suele ser colonias blancas; por lo general, las colonias que contienen principalmente células diferenciadas aparecen claras.

No seleccione colonias blancas o transparentes. Sostenga las placas frente a la luz y utilice un marcador para delinear las colonias ligeramente opacas en la parte inferior de las placas siguiendo sus contornos. Utilice el borde de una punta estéril para pipeta P2 para separar la capa de fibroblastos circundante de la colonia de células madre embrionarias humanas.

Luego, retire las células fibroblásticas circundantes y también elimine todas las partes diferenciadas de la colonia. A continuación, aspire el medio antiguo que contiene las células diferenciadas desprendidas. Después, lave una vez las células indiferenciadas en cada pocillo con medio para células ES humanas sin BFGF, y luego agregue tres mililitros de medio fresco para células ES humanas que contenga B-F-G-F; el B-F-G-F se añade al medio fresco inmediatamente antes del uso.

Ahora use una punta estéril para pipeta P2 para cortar las colonias en trozos pequeños y separarlas de la placa. Aspire los trozos de colonia separados junto con su medio hacia un tubo cónico de 50 mililitros. Aspire un enjuague adicional de un mililitro de medio por cada pocillo.

Las células ya están listas para una diferenciación adicional mediante el uso de moléculas pequeñas. Comience calentando las placas recién recubiertas a 37 grados Celsius. Aspire la solución de recubrimiento de las placas y agregue un alícuota de cuatro mililitros de medio que contenga fragmentos de colonias en cada pocillo; luego, transfiera suavemente las placas al incubador sin agitarlas.

No perturbe las placas para permitir que las células se adhieran. Luego, retire la mayor parte del medio antiguo, dejando solo suficiente medio para que las células permanezcan sumergidas. Nunca se debe permitir que las células se sequen.

Mezcle medios humanos ESL frescos que contengan FGF básico y nicotinamida, y añada mililitros de esta mezcla a cada pocillo. Los medios pueden almacenarse hasta dos semanas a cuatro grados Celsius, durante las cuales pueden utilizarse para renovar el cultivo celular cada dos días con el fin de favorecer el crecimiento de las colonias. Después de ocho a 10 días, las células habrán experimentado cambios morfológicos, convirtiéndose en células diferenciadas grandes que se han multiplicado y acumulado.

Luego, continúe con un cultivo en suspensión: para iniciar un cultivo en suspensión, comience por separar las colonias de ESL de las células que se han diferenciado espontáneamente y migrado hacia afuera para formar una capa de fibroblastos. Utilice la técnica mencionada anteriormente con una punta estéril de pipeta, luego aspire el medio antiguo que contiene las células de fibroblastos desprendidas en suspensión. Lave las células una vez con medio HESC y resuspenda en tres mililitros de medio HESC utilizando ahora una punta estéril P2 de pipeta.

Corte las colonias en trozos pequeños y despréndalas de la placa. Aspire el medio con las colonias desprendidas hacia un solo tubo cónico de 50 mililitros. Enjuague los pocillos con un mililitro de medio y añada el enjuague al medio colectivo.

Luego, alícuota cuatro mililitros de las células agrupadas en cada pocillo de una placa de seis pocillos con adherencia ultra baja durante cuatro a cinco días. Mantenga la placa en un incubador para permitir la formación de agrupaciones celulares flotantes o cardiosblastos y así promover el avance hacia el fenotipo de cardiomiocitos contráctiles. Reúnalos en un tubo cónico de 50 mililitros con su medio de cultivo.

Luego, centrifugue las células a 1.400 RPM durante cinco minutos. Aspire, pese la mayor cantidad posible del medio antiguo y agregue una cantidad igual de medio fresco de diferenciación cardíaca que contenga nicotinamida 10 milimolar.

Mezcle los cardio blástulos flotantes mediante pipeteo, luego alícuote cuatro mililitros de la suspensión de cardio blástulos en cada pocillo de placas de cultivo celular de seis pocillos. Transfiera las placas a un incubador húmedo a 37 grados Celsius para permitir que los cardio blástulos se adhieran a las placas de cultivo celular durante la noche. Cada dos días en cultivo.

Sustituya el medio de diferenciación cardíaca que contiene 10 mini molin de nicotinamida en el día ocho. Cambie al medio de diferenciación cardíaca sin nicotinamida y continúe sustituyendo el medio cada dos días.

En un plazo de dos semanas después de la retirada de nicotinamida, comenzarán a aparecer cardiomiocitos contráctiles y aumentarán en número. La nicotinamida es suficiente para inducir que las células madre humanas de tipo embrionario mantenidas en el sistema de cultivo definido transicionen de la pluripotencia exclusivamente hacia un fenotipo cardio mesodérmico. Tras la exposición de células madre humanas indiferenciadas a nicotinamida, todas las células dentro de la colonia experimentaron cambios morfológicos convirtiéndose en células diferenciadas grandes que redujeron la expresión de OCT4. Las células también comenzaron a expresar el factor de transcripción específico cardíaco, NKX2.5, y asimismo expresaron alfa actinina.

Ambas características son coherentes con el fenotipo de mesodermo cardíaco. Estas células diferenciadas continúan multiplicándose y aumentando de tamaño en áreas de las colonias donde las células se habían acumulado. La expresión de NKX 2.5 se volvió más intensa. Tras la disociación, las células ES humanas tratadas con nicotinamida formaron cardioblastos en un cultivo en suspensión.

Tras permitir que los cardio blástulos se adhirieran, se trataron con nicotinamida durante una semana; una a dos semanas después de la retirada de la nicotinamida, comenzaron a aparecer cardiomiocitos contráctiles con un aumento drástico en eficiencia. Estos aparecían como agrupaciones celulares que pulsaban con contracciones rítmicas; la diferenciación espontánea multilínea de células que no sufrieron el tratamiento IDE no expresó estas características. Las células dentro de los agrupamientos de cardiomiocitos contráctiles expresaron marcadores característicos de cardiomiocitos, incluyendo NK X 2.5 y alfa actinina.

Las contracciones de los cardiomiocitos latiendo se confirmaron mediante perfiles eléctricos como fuertes, rítmicas y coordinadas, además de bien sincronizadas; mostraron impulsos regulares que recordaban a los complejos P-Q-R-S-T observados en electrodos de superficie corporal en electrocardiogramas clínicos. Además, los cardiomiocitos podían mantener su fuerte contractilidad durante más de tres meses una vez dominada la técnica. Este método puede utilizarse para generar precursoras cardíacas y cardiomiocitos latiendo de forma uniforme a partir de células madre embrionarias humanas pluripotentes en aproximadamente cinco semanas, siempre que se realice adecuadamente.