Name: Producción y la detección de especies reactivas del oxígeno (ROS) en los cánceres (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Aprende a detectar especies reactivas de oxígeno en cultivos celulares mediante ensayos fluorométricos, colorimétricos y luminiscentes. Estos métodos permiten evaluar el estrés oxidativo y el estado redox celular en investigación biomédica.

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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (CA142664).

1. La detección de ROS con carboxi-H 2 DCFDA Carboxi-H 2 DCFDA no es fluorescente, pero en presencia de ROS, cuando este reactivo se oxida, se convierte en verde fluorescente. <ol><li> Inmediatamente antes de su uso, preparar una solución de frescos de carboxi-H 2 DCFDA en dimetilsulfóxido estéril (DMSO) o el 100% de etanol. Evitar la repetición descongelar / congelar los ciclos de su tinte. </li><li> Se lavan las células con solución salina tamponada con HEPES (HBSS) o tampón fosfato salino (PBS) para eliminar los restos del medio original. </li><li> La carga de las células con el colorante (y el tinte de control, véase el punto la nota). En este ensayo hemos utilizado Jurkat, una línea celular de leucemia humana. Use carboxi-H 2 DCFDA a una concentración final de 1μM en medio de cultivo regular con suero reducido (2%). </li><li> Incubar los cultivos durante 30 minutos en la oscuridad, en una incubadora convencional (37 ° C, 5% CO2). Descartar las soluciones colorantes utilizados. </li><li> Quitar carboxi-H 2 DCFDA que contienen medio y lavar dos veces con HBSS o PBS. A partir de este paso adelante, a proteger las células de la luz. </li><li> Añadir un nuevo soporte de la droga de elección para la carboxi-H 2 DCFDA células cargadas e incubar como se desee. Para este ejemplo vamos a usar H 2 O 2 (0,03%) durante 1 hora. </li><li> ROS evaluar de inmediato el análisis de las células por citometría de flujo a través del canal FL1 (fluorescencia verde), o mediante un lector de placas de fluorescencia, o por microscopía de fluorescencia. La fluorescencia se puede detectar mediante el uso de longitudes de onda de excitación y emisión que son apropiados para la fluorescencia verde. </li></ol> Nota: Los controles deberán incluir carboxi-H 2 DCFDA cargado las células no tratadas y teñidas las células no tratadas. Carboxi-H 2 DCFDA se conoce para detectar peróxidos, pero también podría ser oxidado por otros ROS. Este reactivo también puede ser modificado por otros medios, colorantes de oxidación de control insensible como el 5 - (y-6)-carboxi-2 ', 7'-diclorodiacetato ofluorescein (carboxi-DCFDA) por lo tanto, deben incluirse en la prueba. 2. La medición del óxido nítrico (NO) Usted tendrá que sulfanilamida y N-1-napthylethylenediamine soluciones dihidrocloruro (NED), y el nivel de nitritos. Este ensayo se denomina ensayo de Griess. Solución NED: Haga una solución al 0,1% de diclorhidrato de N-1-napthylethylenediamine diluida en solución estéril water.Sulfanilamide: Haga una solución al 1% de sulfanilamida diluido en ácido fosfórico al 5%. Estándar de nitrito: Diluir el 0,1 M de patrón de nitrito de sodio a 100μM en medio estéril, hacer una serie de dilución en el mismo medio. Condiciones de almacenamiento: Almacene los productos químicos según las instrucciones del fabricante a temperatura ambiente. Una vez reconstituido, la NED y las soluciones de sulfanilamida se almacenan inmediatamente después de su uso a 4 ° C, en la oscuridad, y por un máximo de 3 meses. <ol><li> Las células de cultivo en una placa de 96 pocillos,uso por triplicado para cada condición, e incluyen controles adecuados de acuerdo con sus experimentos. </li><li> Tratamiento de las células para inducir la producción de NO. En nuestro experimento utilizamos lipopolisacárido (LPS) (100 ng / ml) e IL-4 recombinante para el tratamiento de las células. En este protocolo, el RAW 264.7, una línea celular de macrófagos de ratón (mouse leucémicas línea celular de macrófagos monocitos). </li><li> En el día de la determinación, tanto de los reactivos a temperatura ambiente. </li><li> Girar el plato, recoger los sobrenadantes celulares y la transferencia de 50μl con una nueva placa de 96 pocillos. Prepare limitar los pozos de dilución de la solución madre de patrón para hacer una curva estándar. </li><li> Añadir 50μl de la solución de sulfanilamida a cada muestra y control, así y mezclar bien. </li><li> Incube a temperatura ambiente durante 10 minutos en la oscuridad. </li><li> Añadir 50μl de solución de clorhidrato de N-1-napthylethylenediamine a cada muestra y control, así y mezclar bien. </li><li> Incube a temperatura ambiente durante 10 minutos en la oscuridad. </li><li> Medida Absorbana inmediatamente con un lector de placas con filtro de 520 nm de longitud de onda entre 550 nm y. </li></ol> Si usted utiliza diferentes plato / plato de tamaño, el uso 1/1/1 volumen para cada solución y el sobrenadante de la muestra. Un color violeta aparecerá en los pozos positivos. Los resultados obtenidos con el estándar le ayudará a comprobar la estabilidad de sus soluciones. 3. La detección de ROS acción: proteínas oxidadas Un método diferente para identificar la producción de ROS es ver el resultado final mediante la detección de la oxidación de las proteínas. De hecho, ROS modificar el glutatión, un antioxidante que se expresa en la mayoría de las células y juega un papel protector contra las ROS. Después de la oxidación por ROS, la modificación del glutatión reducido (GSH) se traduce en la sulfhidrilo (tiol) del grupo de la cisteína estar vinculado a un glutatión segundo a través de un puente disulfuro. Esto lleva a la formación de una proteína dimerizados (GSSG oxidada proteína). GSH puede ser restaurada a través de la modificación de GSSG por la enzima glutatión reductasa. El aumento en el cociente GSSG / GSH refleja el estrés oxidativo. El siguiente ensayo se basa en la detección y cuantificación de estas proteínas oxidadas. Este método no es selectivo para ROS específicos, sino más bien detecta los efectos del NO, H 2 O 2, O 2 - y otros ROS. Aquí se mide la cantidad total de oxidado (GSSG) y reducido (GSH) glutatión con señales bioluminiscentes. <ol><li> Semillas de las células en una placa de 96 pocillos (blanco / transparente, fondo plano), como de costumbre. Para nuestro experimento, se utilizó 1x10 4 células por pocillo de adherentes y Raw 264.7 A549 y células Jurkat suspensión. Dependiendo del tamaño de sus células estos números podrían ser ajustados. Recomendamos a las células de la placa adherida al día antes de la prueba que les permita conectar a la placa. Suficientes pozos deben estar preparados para la detección de proteínas oxidadas y reducidas, así como de "único medio" ylas células no tratadas como controles. Use triplicado en todas las condiciones. </li><li> Tratar las células con su medicamento durante el tiempo necesario. Aquí se tratan las células Jurkat y las células A549 durante 1 hora con H 2 O 2 (a 5 mm y 2,5 mm respectivamente). Raw 264,7 células fueron tratadas con 200ng/ml de LPS durante 16 h. Durante este tiempo de incubación, llevar a todos los reactivos a temperatura ambiente (TA). Hacer todos los reactivos no más de 30 minutos antes de realizar la prueba. La tabla siguiente muestra los volúmenes de los reactivos por pozo. Cuando sea posible, es importante para eliminar los medios de comunicación que contiene el agente reductor antes de proceder con la prueba. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="2"> Células adherentes </td><td colspan="2"> Células en suspensión </td></tr><tr><td> Lisis total de Glu </td><td> Oxidado Glu Lisis </td><td> Lisis total de Glu </td><td> Oxidado Glu Lisis </td></tr><tr><td> NEM, 25 mM </td><td> ninguno </td><td> 0.5μl </td><td> ninguno </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> Luciferina-NT </td><td> 1 l </td><td> 1 l </td><td> 1 l </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> Tampón de lisis pasiva, 5X </td><td> 10μl </td><td> 10μl </td><td> 10μl </td><td> 10μl </td></tr><tr><td> Agua destilada </td><td> 39.0μl </td><td> 38.5μl </td><td> 14μl </td><td> 13.5μl </td></tr><tr><td> El volumen final por pocillo </td><td> 50μl </td><td> 50μl </td><td> 25μl </td><td> 25μl </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Quitar medio de pozos con células adherentes. No quite medio de pozos con células en suspensión. </li><li> Añadir el reactivo reducido lisis glutatión glutatión oxidado o reactivo de lisis de los pozos correspondientes y agitar durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Añadir el reactivo luciferina y la generación de incubate durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Añadir el reactivo de detección luciferina y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lea la señal bioluminiscente en el momento de la integración de 0,25-1 por segundo y con un luminómetro lector de placas. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Células adherentes </td><td> Células en suspensión </td></tr><tr><td> El número de células por pozo </td><td> 1x10 4 </td><td> 1x10 4 </td></tr><tr><td> De células en suspensión por drogas y + </td><td> 100 l, para ser removido antes de 3,4 </td><td> 25μl, para no ser eliminado </td></tr><tr><td> El glutatión reducido reactivo de lisis </td><td> 50 l </td><td> 25μl </td></tr><tr><td> Reactivo de lisis glutatión oxidado </td><td> 50 l </td><td> 25μl </td></tr><tr><td> Luciferina reactivo generación </td><td> 50 l </td><td> 50 l </td></tr><tr><td> Luciferina reactivo de detección </td><td> 100 l </td><td> 100 l </td></tr></tbody></table> 4. Los resultados representativos: <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3357/3357fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 La detección de ROS con carboxi-H2DCFDA tinte. Células Jurkat (línea celular humana de leucemia) tratados con H 2 O 2 se compararon con las células no tratadas. ROS induce la modificación de carboxi-H 2 DCFDA que verde fluorescente detectada por citometría de flujo, el pico fluorescente H 2 O 2 células tratadas cambio en comparación con los picos en los controles (H 2 O 2 células tratadas teñidas con colorantes de oxidación insensible y no tratados con las células teñidas con carboxi-H 2 DCFDA). Los resultados confirman la presencia de ROS en las células tratadas. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3357/3357fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 Detección of NO utilizando reactivos de Griess. RAW 264.7 (macrófago de ratón) fueron tratados con LPS e IL-4. Un aumento significativo en la producción de NO se detectó en las células tratadas en comparación con el control de las células no tratadas. <table border="1"><tbody><tr><td> Las líneas celulares </td><td> No tratados </td><td> Tratados </td></tr><tr><td> Raw 264,7 </td><td> 13.0 </td><td> 8.3 </td></tr><tr><td> A549 </td><td> 21.6 </td><td> 10.5 </td></tr><tr><td> Jurkat </td><td> 5.2 </td><td> 2.8 </td></tr></tbody></table> Tabla 1 La detección de ROS mediada por la oxidación de las proteínas. RAW 264,7 células fueron tratadas con LPS, Jurkat y A549 (cáncer de pulmón humano), las células fueron tratadas con H 2 O 2. Los resultados se expresan como el cociente reducido (GSH) / oxidado (GSSG) glutatión. Cocientes más bajos de glutation (GSH) / (GSSG) se detectaron en las células tratadas en comparación concontrol de las células no tratadas, dejando al descubierto que las proteínas eran más oxidados en las células tratadas.

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</ol>

Hemos recibido el apoyo de Promega para esta publicación.

Varias situaciones patológicas, como enfermedades inflamatorias, cáncer, isquemia / reperfusión, y también tratamientos como la radioterapia o la quimioterapia (cisplatino por ejemplo) induce una sobreproducción de ROS. Por lo tanto, la detección y medición de los niveles de ROS es importante en muchos estudios básicos, pre-clínicos y clínicos. Sin embargo, ROS tienen una vida media muy corta y puede ser complicado de detectar. Aquí, proponemos pruebas simples que se utilizan habitualmente y ampliamente aceptado para la...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> 5 - (y-6)-carboxi-2 &#39;, 7&#39;-diacetato diclorofluoresceína (carboxi-DCFDA) </td><td> Las sondas moleculares </td><td> C369 </td><td> control </td></tr><tr><td> carboxi-H 2 DCFDA </td><td> Las sondas moleculares </td><td> C400 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfanilamida </td><td> Sigma </td><td> S9251-100G </td><td></td></tr><tr><td> N-1-napthylethylenediamine dihidrocloruro </td><td> Sigma </td><td> N9125-10G </td><td></td></tr><tr><td> Nitrito estándar </td><td> Sigma </td><td> 237213-100G </td><td></td></tr><tr><td> GSH / GSSG-Glo ensayo </td><td> Promega </td><td> V6612 </td><td> Para cuantificar oxidado, reducido u oxidado / glutatión reducido </td></tr></tbody>
</table>

producción y la detección de especies reactivas del oxígeno (ros) en los cánceres

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Las especies reactivas del oxígeno incluyen una serie de moléculas que dañan el ADN y ARN, y se oxidan las proteínas y los lípidos (peroxidación lipídica). Estas moléculas reactivas contienen un átomo de oxígeno y son H 2 O 2 (peróxido de hidrógeno), NO (óxido nítrico), O 2 - (anión), peroxinitrito (ONOO -), ácido hydrochlorous (HOCl), y el radical hidroxilo (OH -) . Especies reactivas de oxígeno se producen no sólo en situaciones patológicas (cáncer, isquemia reperfusión /, patologías neurológicas y cardiovasculares, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias 1, 2 enfermedades autoinmunes, etc ...), sino también en situaciones fisiológicas (no patológicas), tales como el metabolismo celular 3 , 4. De hecho, ROS juegan un papel importante en muchas vías de señalización celular (proliferación, activación de las células 5, 6, 7 migración, etc.). ROS puede ser perjudicial (entonces se conoce como&quot;El estrés oxidativo y nitrosativo&quot;) cuando se produce en grandes cantidades en los compartimentos intracelulares y las células responden en general a ROS por upregulating antioxidantes como la superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT), glutatión peroxidasa (GPx) y glutatión (GSH), que protege ellas mediante la conversión de los peligrosos radicales libres a las moléculas inofensivas (por ejemplo, agua). Las vitaminas C y E también se han descrito como basureros ROS (antioxidantes). Los radicales libres son beneficiosos en pequeñas cantidades 3. Macrófagos y neutrófilos respuestas inmunes mediadas por involucrar a la producción y liberación de NO, que inhibe virus, patógenos y la proliferación del tumor 8. El NO también reacciona con otros ROS y por lo tanto, también tiene un papel como un desintoxicante (scavenger ROS). Por último, no actúa sobre los vasos para regular el flujo de sangre que es importante para la adaptación del músculo al ejercicio prolongado 9, 10. Varias publicaciones han demostrado también que las ROS participan en sens insulinapositividad 11, 12. Numerosos métodos para evaluar la producción de ROS se encuentran disponibles. En este artículo nos proponemos varias pruebas sencillas, rápidas y asequibles, estos ensayos han sido validadas por numerosas publicaciones y se usan rutinariamente para detectar ROS o sus efectos en células de mamíferos. Aunque algunos de estos ensayos de detección de múltiples ROS, otros detectan un solo ROS.

Aquí proponemos métodos sencillos para probar y evaluar la presencia de especies reactivas del oxígeno en las células.

Producción y la detección de especies reactivas del oxígeno (ROS) en los cánceres

Las especies reactivas del oxígeno incluyen diversas moléculas que dañan el ADN y el ARN y oxidan las proteínas y los lípidos (peroxidación lipídica). Estas reactivas...

El objetivo de este experimento es detectar la presencia de especies reactivas de oxígeno en cultivos celulares. Esto se logra primero detectando las especies reactivas de oxígeno mediante un colorante fluorescente. A continuación, se miden los niveles de óxido nítrico en las células utilizando un ensayo colorimétrico.Finalmente, el efecto de las especies reactivas de oxígeno se determina detectando la reducción u oxidación del glutatión mediante un ensayo luminiscente. Mi nombre es Danu. Soy investigador en el laboratorio de Patrizia Yoda, y demostraré este procedimiento.El carboxi H 2D CFDA no es fluorescente, pero en presencia de especies reactivas de oxígeno, este reactivo se oxida y fluoresce inmediatamente antes de su uso emitiendo una luz verde. Prepare una solución fresca de carboxi H 2D CFDA en DMSO estéril o etanol al 100 %. Lave las células con solución salina tamponada con HEPES o solución salina tamponada con fosfato para eliminar restos del medio original.En este ensayo, utilizamos la línea celular de leucemia humana jerk cat. Después de centrifugar, deseche el sobrenadante y cargue las células con el colorante a una concentración final de un micromolar en medio de cu

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Este video describe el protocolo para detectar especies reactivas de oxígeno (ROS) celulares totales utilizando diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA). Este método ayuda a visualizar la localización de las ROS en las células adherentes utilizando un microscopio de fluorescencia y a cuantificar aún más la intensidad de las ROS con un lector de placas de fluorescencia.

Detección de ROS con tinción DCFH-DA: medición de ROS totales en líneas celulares de cáncer colorrectal

ROS intracelular se ha demostrado para desempeñar un papel importante en la inducción de senescencia celular. Aquí, describimos un análisis sensible para cuantificar los niveles ROS durante la senescencia celular. También ofrecemos protocolos para evaluar el fenotipo secretor asociados a senescencia, que supuestamente contribuye a diferentes disfunciones relacionadas con la edad.

Una medida cuantitativa de especies reactivas de oxígeno y senescencia asociada a fenotipo secretor en fibroblastos humanos normales durante la senescencia inducida por el oncogén

Describimos una invasiva en vivo imagen protocolo que es sencilla y económica, utilizando L-012, un análogo de quimioluminiscente luminol, para visualizar y cuantificar las especies de oxígeno reactivo (ROS) generadas en un modelo de ratón por escisión de la herida.

En Vivo Proyección de imagen de especies reactivas de oxígeno en un murino herida modelo

Este estudio demuestra el uso de citometría de flujo para detectar la producción de (ROS) las especies reactivas de oxígeno resultante de la activación de la FcγR. Este método puede utilizarse para evaluar los cambios en el antimicrobiano y función de los fagocitos en respuesta a complejos inmunes, microorganismos opsonizadas o FcγR directa Cross-linking de señalización redox.

Medición de Cytometric del flujo de producción de ROS en los macrófagos en respuesta a Cross-linking FcγR

Describimos un método para utilizar citometría de flujo multiparámetro para detectar especies de oxígeno reactivo mitocondrial (ROS) en células hematopoyéticas sanas murinas (HSCCP) y células de leucemia a partir de un modelo de ratón de leucemia mieloide aguda (LMA) impulsada por MLL-AF9.

Análisis citométrico de flujo de especies de oxígeno reactivo mitocondrial en células hematopoyéticas de la muriña y células progenitoras y leucemia impulsada por MLL-AF9

Aquí, presentamos un protocolo para detectar especies totales de oxígeno reactivo celular (ROS) usando 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Este método puede visualizar la localización de ROS celular en células adherentes con un microscopio de fluorescencia y cuantificar la intensidad ROS con un lector de placas de fluorescencia. Este protocolo es simple, eficiente y rentable.

Detección de especies totales reactivas de oxígeno en células adherentes por 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

El objetivo de este protocolo es inducir la producción transitoria in vivo de niveles no letales de especies reactivas de oxígeno (ROS) en la piel del ratón, promoviendo aún más las respuestas fisiológicas en el tejido.

Estimulación de nichos de células madre y regeneración de tejidos en piel de ratón mediante fotogeneración in situ dependiente de protoporfirina IX conmutable de especies reactivas de oxígeno

Aquí, proponemos un protocolo sistematizado, accesible y reproducible para detectar especies reactivas celulares de oxígeno (ROS) utilizando una sonda de dicacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCFH-DA) en células gliales de Müller (MGC). Este método cuantifica los niveles totales de ROS celulares con un citómetro de flujo. Este protocolo es muy fácil de usar, adecuado y reproducible.

Cuantificación de especies reactivas de oxígeno utilizando sonda de dicacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína y citometría de flujo en células gliales de Müller

Aquí, describimos un método para la detección en tiempo real de la producción de especies reactivas de oxígeno apoplásico (ROS) en tejidos de arroz en la respuesta inmune desencadenada por patrones moleculares asociados a patógenos. Este método es simple, estandarizado y genera resultados altamente reproducibles en condiciones controladas.

Detección en tiempo real de la producción reactiva de especies de oxígeno en la respuesta inmune en el arroz con un ensayo de quimioluminiscencia

Este protocolo describe un método novedoso para cuantificar las especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares utilizando dihidroetidio (DHE) como sonda de colorante de fluorescencia utilizando un enfoque de cribado de alto rendimiento. El protocolo describe los métodos para la evaluación cuantitativa de las especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares en las tres líneas celulares diferentes de carcinoma hepatocelular.

Evaluación de cribado de alto rendimiento de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) mediante colorante de fluorescencia de dihidroetidio (DHE)

Aprende a detectar especies reactivas de oxígeno en cultivos celulares mediante ensayos fluorométricos, colorimétricos y luminiscentes. Estos métodos permiten evaluar el estrés oxidativo y el estado redox celular en investigación biomédica.

Producción y la detección de especies reactivas del oxígeno (ROS) en los cánceres

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