Name: Revelando la topografía del circuito neuronal en el Multi-Color (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprende a trazar circuitos neuronales in vivo usando WGA-Alexa en ratones. Este protocolo permite visualizar proyecciones topográficas en cerebelo, corteza y médula con alta intensidad de señal para imagen tridimensional.

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Este trabajo fue apoyado por el investigador nuevos fondos iniciales de Albert Einstein College of Medicine de la Universidad Yeshiva de RVS.

<ol><li>Apps, R., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+cortical+organization%3A+a+one-map+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).</li>
<li>Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+spinocerebellar+projection+in+the+prenatal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse.</a> J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).</li>
<li>Mesulam, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMesulam%2C+M+%22Tracing+neural+connections+with+horseradish+peroxidase%22">Tracing neural connections with horseradish peroxidase</a>. , Wiley. New York. (1982).</li>
<li>Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+expression+of+a+cocaine-+and+amphetamine+regulated+transcript+%28CART%29+peptide+reveals+complex+circuit+topography+in+the+rodent+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Patterned expression of a cocaine- and amphetamine regulated transcript (CART) peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2011).</li>
<li>Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+mapping+of+afferent+topography+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Struct.+Funct%22%5BJournal%5D)">Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions.</a> Brain. Struct. Funct. , (2011).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Stephen, D., Lao, Z., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed+homeobox+genes+determine+the+organization+of+Purkinje+cell+sagittal+stripe+gene+expression+in+the+adult+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Engrailed homeobox genes determine the organization of Purkinje cell sagittal stripe gene expression in the adult cerebellum.</a> J. Neurosci. 28, 12150-12162 (2008).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Vogel, M. W., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed+homeobox+genes+regulate+establishment+of+the+cerebellar+afferent+circuit+map%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Engrailed homeobox genes regulate establishment of the cerebellar afferent circuit map.</a> J. Neurosci. 30, 10015-10024 (2010).</li>
<li>Vig, J., Goldowitz, D., Steindler, D. A., Eisenman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentation+of+the+reeler+cerebellum%3A+segregation+and+overlap+of+spinocerebellar+and+secondary+vestibulocerebellar+fibers+and+their+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compartmentation of the reeler cerebellum: segregation and overlap of spinocerebellar and secondary vestibulocerebellar fibers and their target cells.</a> Neuroscience. 130, 735-744 (2005).</li>
<li>Vogel, M. W., Prittie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+spinocerebellar+mossy+fiber+projections+are+maintained+in+the+lurcher+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Topographic spinocerebellar mossy fiber projections are maintained in the lurcher mutant.</a> J. Comp. Neurol. 343, 341-351 (1994).</li>
<li>Voogd, J., Broere, G., van Rossum, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+medio-lateral+distribution+of+the+spinocerebellar+projection+in+the+anterior+lobe+and+the+simple+lobule+in+the+cat+and+a+comparison+with+some+other+afferent+fibre+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Psychiatr.+Neurol.+Neurochir%22%5BJournal%5D)">The medio-lateral distribution of the spinocerebellar projection in the anterior lobe and the simple lobule in the cat and a comparison with some other afferent fibre systems.</a> Psychiatr. Neurol. Neurochir. 72, 137-151 (1969).</li>
<li>Wu, H. S., Sugihara, I., Shinoda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+patterns+of+single+mossy+fibers+originating+from+the+lateral+reticular+nucleus+in+the+rat+cerebellar+cortex+and+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Projection patterns of single mossy fibers originating from the lateral reticular nucleus in the rat cerebellar cortex and nuclei.</a> J. Comp. Neurol. 411, 97-118 (1999).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Hemos descrito los detalles quirúrgicos y técnicas necesarias para localizar a los axones y las dendritas utilizando un nuevo enfoque basado en los fluorescentes para la rápida etiquetado proyecciones neuronales en el desarrollo y los ratones adultos. Utilizando WGA-Alexa se muestra cómo los trazadores y marcadores se pueden utilizar para el análisis de la topografía de circuitos modelados en alta resolución y en tres dimensiones. Muchos trazadores disponibles para el rastreo de los circuito...

<table border="1"><tbody><tr><td> Equipos / Reactivos </td><td> Modelo / Número de catálogo </td><td> Empresa </td></tr><tr><td> Esterilizador de bolas </td><td> Modelo Steri 250 gatos. # 18000-45 </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td></tr><tr><td> Cauterizador </td><td> Gato. # 18000-00 </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td></tr><tr><td> Vidrio de borosilicato capilares </td><td> Gato. # 300056 </td><td> Harvard Apparatus </td></tr><tr><td> Dos etapas de vidrio Micropipetas Extractor </td><td> Modelo 001-PC-10 </td><td> Narishige </td></tr><tr><td> Micrómetro jeringa </td><td> Gato. # GS-1100 </td><td> Instrumentos Gilmont </td></tr><tr><td> Pequeños Animales de instrumentos estereotáxica </td><td> Modelo 940-A </td><td> Kopf Instrumentación </td></tr><tr><td> Manipulador de electrodos </td><td> Modelo 960 </td><td> Kopf Instrumentación </td></tr><tr><td> Vetcare cámara </td><td> Gato. #340508 </td><td> Harvard Apparatus </td></tr><tr><td> Almohadilla eléctrica </td><td> Gato. # 341241 </td><td> Harvard Apparatus </td></tr><tr><td> Leica DFC360 FX cámara </td><td> DFC360 FX </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica DFC490 cámara </td><td> DFC490 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica DM5500 microscopio </td><td> DM5500 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica DFC3000 FX cámara </td><td> DFC3000 FX </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica MZ16 FA microscopio </td><td> MZ16 FA </td><td> Leica </td></tr><tr><td> CY3 filtro </td><td> Modelo # 11600231 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> FITC filtro </td><td> Modelo # 11513880 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> A4 DAPI / filtro UV </td><td> Modelo # 11504162 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Aglutinina de germen de trigo, Alexa Fluor 488 conjugada </td><td> Gato. # W11261 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Trigo germ aglutinina, Alexa Fluor 555 conjugada </td><td> Gato. # W32464 </td><td> Invitrogen </td></tr></tbody></table>

revelando la topografía del circuito neuronal en el multi-color

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

Circuitos neuronales se organizan en funcionamiento los mapas topográficos. Con el fin de visualizar la arquitectura de circuitos complejos, hemos desarrollado un enfoque para la etiqueta de forma fiable el patrón global de múltiples proyecciones topográficas. El cerebelo es un modelo ideal para estudiar la disposición ordenada de los circuitos neuronales. Por ejemplo, la organización compartimental de espinocerebelosa fibras musgosas ha demostrado ser un sistema indispensable para el estudio de los patrones de las fibras musgosas. Recientemente hemos demostrado que el germen de trigo crioaglutininas (WGA) conjugado con Alexa 555 y 488 se puede utilizar para rastrear espinocerebelosa proyecciones de las fibras musgosas en el desarrollo y los ratones adultos (Reeber et al. 2011). Se encontraron tres propiedades principales que hacen que las herramientas de Alexa WGA-trazadores deseable para el etiquetado de las proyecciones neuronales. En primer lugar, fluoróforos Alexa son intensos y su brillo permite obtener imágenes wholemount directamente después de rastrear. En segundo lugar, WGA-Alexa trazadores etiqueta de toda la trayectoria de desarrollo y adultos projectio neuralns. En tercer lugar, WGA-Alexa trazadores son transportados rápidamente en ambas direcciones, retrógrada y anterógrada. A continuación, describimos en detalle la forma de preparar los trazadores y otras herramientas necesarias, la forma de realizar la cirugía para espinocerebelosa localización y la mejor forma de proyección de imágenes trazadas en tres dimensiones. En resumen, ofrecemos un protocolo de paso a paso el seguimiento que será útil para descifrar la organización y la conectividad de los mapas funcionales, no sólo en el cerebelo, sino también en la corteza cerebral, tronco cerebral y médula espinal.

Ofrecemos una guía práctica para la entrega de los trazadores<em&gt; En vivo</em&gt; Y el uso de la vía espinocerebelosa como un sistema modelo para demostrar los pasos esenciales para el éxito del análisis del circuito neuronal en ratones. Se describe en detalle el protocolo versátil de seguimiento que explota aglutinina de germen de trigo (WGA) conjugado con fluoróforos Alexa.

Revelando la topografía del circuito neuronal en el Multi-Color

Los circuitos neuronales se organizan en mapas topográficos funcionales. Con el fin de visualizar la arquitectura de circuitos complejos, hemos desarrollado un enfoque para...

Este procedimiento describe un protocolo versátil de rastreo in vivo que utiliza glutenina de germen de trigo conjugada con fluoróforos Alexa para rastrear circuitos neuronales. Primero, se realiza una incisión en la región torácica inferior y en la región lumbar superior, y se cortan la fascia y los músculos espinales superficiales. El segundo paso consiste en realizar una laminectomía dorsal.A continuación, se prepara el microelectrodo y se fija al micromanipulador. Después, se realiza la inyección por presión de trazadores neuronales en la médula espinal. El paso final de este procedimiento consiste en proporcionar un adecuado cuidado postoperatorio durante la recuperación y otorgar suficiente tiempo para que los trazadores sean transportados a lo largo de los tractos objetivo.Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran la organización y conectividad de los mapas topográficos en la corteza cerebelosa, el tronco encefálico y la médula espinal mediante microscopía de inmunofluorescencia. La principal ventaja de este trazador frente a trazadores existentes como BDA o W-G-A-H-R-P, es que los trazadores WGA Alexa son lo suficientemente brillantes como para realizar imágenes en preparaciones completas directamente después del trazado. Este método podría ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia de sistemas, como cuál es la lógica subyacente al patrón global de múltiples proyecciones topográficas dentro y entre los sistemas corticales, cerebeloso, del tronco encefálico y espinal antes de comenzar el procedimiento.Asegúrese de que todas las manipulaciones cumplan con las directrices del IACUC, de que se disponga de un campo estéril para la cirugía y de que todos los instrumentos que se vayan a utilizar hayan sido esterilizados. Deben emplearse técnicas quirúrgicas estériles durante toda la cirugía tras administrar un anestésico aprobado al animal; asegúrese de que se ha alcanzado un plano anestésico adecuado realizando una compresión del dedo del pie. El reflejo plantar debe estar ausente una vez que el animal esté completamente anestesiado.Afeite el pelaje de la zona que se va a operar con una máquina cortapelos. A continuación, coloque al animal con el lado dorsal hacia arriba sobre una gasa estéril utilizando un patrón circular de dentro hacia fuera. Limpie la zona afeitada con dos juegos de toallitas con alcohol, seguido de Betadine al 70% en alcohol.Luego, una vez más con toallitas de alcohol, delinee claramente el campo quirúrgico colocando una gasa estéril con un pequeño orificio cortado sobre el animal después de que este haya sido adecuadamente preparado. De esta manera, proceda a la cirugía y mantenga una técnica quirúrgica estéril adecuada. Levante la piel usando pinzas y realice una incisión con tijeras en la línea media directamente por encima de la región torácica inferior y lumbar superior.Corte la fascia y los músculos espinales superficiales si es necesario, y detenga cualquier sangrado cauterizando los vasos sanguíneos. Luego, identifique el punto medio entre el proceso articular y el proceso espinal dorsal, y corte la lámina aquí en ambos lados de la columna vertebral. A continuación, realice una laminectomía dorsal eliminando los procesos espinosos de uno o dos segmentos de la médula espinal torácica inferior y lumbar superior.Utilizando una jeringa micrométrica, llene una pipeta de vidrio agrupada con el trazador. Luego, asegure firmemente la microelectrodo de vidrio en su lugar sobre un micromanipulador. A continuación, llene la aguja con los reactivos.Introduzca la pipeta reunida entre 0,1 y 0,5 milímetros en la región torácica inferior y lumbar superior de la médula espinal. A mitad de camino entre la línea media y el borde lateral de la médula espinal, inyecte por presión aproximadamente 0,5 microlitros de una solución al 2% de conjugado de lectina de trigo LOR, lectina de germen de trigo, conjugado de peroxidasa de rábano picante, o una solución al 10% de dextrano aminado biotinilado en PBS suplementado con verde rápido al 0,5% durante un período de tres a cinco minutos. Si el trazador no se expulsa fácilmente de la pipeta, retire lentamente la punta para crear un pequeño bolsillo en el tejido.Luego, intente inyectar nuevamente tras completar la microinyección. Cierre suavemente la piel con clips quirúrgicos y adhesivo tisular. A continuación, coloque al animal en una cámara de recuperación sobre una almohadilla calefactora.Observe la frecuencia respiratoria y verifique los signos de que el animal está intentando moverse. Después de que el animal se recupere de la anestesia, devuélvalo a su jaula de alojamiento y proporciónele agua y alimento ad libitum, así como analgésicos según sea necesario. Revise rutinariamente signos de dolor, malestar o infección, y una ingesta adecuada de alimentos y bebidas; los animales inyectados con gluten de germen de trigo y trazadores conjugados son sacrificados.24 horas después de la microinyección. El BDA generalmente requiere tiempos de supervivencia más largos para trazar completamente las proyecciones neuronales y, por lo tanto, la cartografía completa de las proyecciones espino-cerebelosas. Estos animales se sacrifican después de aproximadamente 11 días.Se inyectaron trazadores de glutenina de germen de trigo en la médula espinal torácica inferior y lumbar superior. Este esquema ilustra el origen y la terminación de la glutenina de germen de trigo. Neuronas espinocerebelosas marcadas con Alexa 555.Esta figura muestra el sitio de inyección tras la administración de aglutinina de germen de trigo Alexa 5 55 en la región torácica inferior y lumbar superior de la médula espinal adulta. Esta imagen de preparación completa muestra los lóbulos anteriores tras la inyección de trigo. Gemma Glutenina.Alexa 555 en la región torácica inferior y lumbar superior de la médula espinal. Los lóbulos están indicados por números romanos. Aquí observamos que el trazado anterógrado con Alexa 555 de la proteína de gluten de germen de trigo revela bandas definidas de fibras musgosas, como se ve en esta sección coronal del tejido.Este esquema del cerebelo del ratón resume el patrón general del cerebelo espinal. Bandas de fibras musgosas wheatgermagluten en Alexa 555 se inyectaron en el lado derecho de la médula espinal lumbar y wheatgermagluten en Alexa 488 en el mismo segmento del lado izquierdo, como se observa en una sección tisular coronal que atraviesa los LOE posteriores.Los dos trazadores Alexa de aglutinina Weger fueron transportados al cerebelo y etiquetaron con éxito subconjuntos distintos de terminales de las fibras musgosas, principalmente en la capa de células granulosas, que se etiqueta como GCL. Los trazadores Alexa de aglutinina Weger pueden utilizarse en combinación con inmunohistoquímica e histología para la triple marcación de neuronas y proyecciones. Aquí, la aglutinina Weger Alexa 5 55 se deposita en los terminales de las fibras musgosas en el labio tres. Esta imagen de mayor aumento de la región enmarcada ilustra una marcación clara de los terminales de las fibras musgosas.Esta imagen de tinción de zeína dos revela una serie de bandas de células bikini en Lole tres. Esta imagen con mayor aumento de la región enmarcada ilustra una marcación clara de las células bikini en la capa de células bikini y la capa molecular. Aquí, la tinción con DPI revela núcleos neuronales y gliales.Esta imagen de mayor aumento de la región enmarcada ilustra una marcación intensa de la capa rica en núcleos de células granulares y la capa de células bikini, y una marcación menos densa en la capa molecular. Aquí aparece una imagen que muestra una triple marcación mediante Wheatgerm Agglutinin, Alexa 5 55 serina dos y DPI de bandas aferentes, estrías de células bikini y la arquitectura citológica general. Finalmente, esta imagen de mayor aumento de la región enmarcada ilustra claramente el potencial de esta técnica para revelar la arquitectura citológica de las estructuras cerebrales.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 20 minutos por animal si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar imaginar el tejido inmediatamente después del corte. Aunque la obtención de imágenes dentro de los dos días posteriores al corte aún permite visualizar con éxito las fibras y terminales marcadas tras seguir este procedimiento.Otros métodos, como el seguimiento genético de linajes, pueden realizarse para responder preguntas adicionales, como, ¿cuáles son los patrones de proyección y los patrones de terminación de poblaciones celulares definidas genéticamente?

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

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Este documento presenta un enfoque combinado de fotoestimulación láser con las grabaciones de células enteras en ratones transgénicos que expresan GFP en poblaciones de neuronas inhibidoras limitan. La técnica permite la cartografía y de análisis cuantitativo de los locales de los circuitos sinápticos de las neuronas corticales específicas inhibitorias.

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