Name: Revelando la topografía del circuito neuronal en el Multi-Color (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprende a trazar circuitos neuronales in vivo usando WGA-Alexa en ratones. Este protocolo permite visualizar proyecciones topográficas en cerebelo, corteza y médula con alta intensidad de señal para imagen tridimensional.

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Este trabajo fue apoyado por el investigador nuevos fondos iniciales de Albert Einstein College of Medicine de la Universidad Yeshiva de RVS.

<ol><li>Apps, R., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+cortical+organization%3A+a+one-map+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).</li>
<li>Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+spinocerebellar+projection+in+the+prenatal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse.</a> J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).</li>
<li>Mesulam, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMesulam%2C+M+%22Tracing+neural+connections+with+horseradish+peroxidase%22">Tracing neural connections with horseradish peroxidase</a>. , Wiley. New York. (1982).</li>
<li>Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+expression+of+a+cocaine-+and+amphetamine+regulated+transcript+%28CART%29+peptide+reveals+complex+circuit+topography+in+the+rodent+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Patterned expression of a cocaine- and amphetamine regulated transcript (CART) peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2011).</li>
<li>Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+mapping+of+afferent+topography+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Struct.+Funct%22%5BJournal%5D)">Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions.</a> Brain. Struct. Funct. , (2011).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Stephen, D., Lao, Z., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed+homeobox+genes+determine+the+organization+of+Purkinje+cell+sagittal+stripe+gene+expression+in+the+adult+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Engrailed homeobox genes determine the organization of Purkinje cell sagittal stripe gene expression in the adult cerebellum.</a> J. Neurosci. 28, 12150-12162 (2008).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Vogel, M. W., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed+homeobox+genes+regulate+establishment+of+the+cerebellar+afferent+circuit+map%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Engrailed homeobox genes regulate establishment of the cerebellar afferent circuit map.</a> J. Neurosci. 30, 10015-10024 (2010).</li>
<li>Vig, J., Goldowitz, D., Steindler, D. A., Eisenman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentation+of+the+reeler+cerebellum%3A+segregation+and+overlap+of+spinocerebellar+and+secondary+vestibulocerebellar+fibers+and+their+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compartmentation of the reeler cerebellum: segregation and overlap of spinocerebellar and secondary vestibulocerebellar fibers and their target cells.</a> Neuroscience. 130, 735-744 (2005).</li>
<li>Vogel, M. W., Prittie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+spinocerebellar+mossy+fiber+projections+are+maintained+in+the+lurcher+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Topographic spinocerebellar mossy fiber projections are maintained in the lurcher mutant.</a> J. Comp. Neurol. 343, 341-351 (1994).</li>
<li>Voogd, J., Broere, G., van Rossum, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+medio-lateral+distribution+of+the+spinocerebellar+projection+in+the+anterior+lobe+and+the+simple+lobule+in+the+cat+and+a+comparison+with+some+other+afferent+fibre+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Psychiatr.+Neurol.+Neurochir%22%5BJournal%5D)">The medio-lateral distribution of the spinocerebellar projection in the anterior lobe and the simple lobule in the cat and a comparison with some other afferent fibre systems.</a> Psychiatr. Neurol. Neurochir. 72, 137-151 (1969).</li>
<li>Wu, H. S., Sugihara, I., Shinoda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+patterns+of+single+mossy+fibers+originating+from+the+lateral+reticular+nucleus+in+the+rat+cerebellar+cortex+and+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Projection patterns of single mossy fibers originating from the lateral reticular nucleus in the rat cerebellar cortex and nuclei.</a> J. Comp. Neurol. 411, 97-118 (1999).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Hemos descrito los detalles quirúrgicos y técnicas necesarias para localizar a los axones y las dendritas utilizando un nuevo enfoque basado en los fluorescentes para la rápida etiquetado proyecciones neuronales en el desarrollo y los ratones adultos. Utilizando WGA-Alexa se muestra cómo los trazadores y marcadores se pueden utilizar para el análisis de la topografía de circuitos modelados en alta resolución y en tres dimensiones. Muchos trazadores disponibles para el rastreo de los circuito...

<table border="1"><tbody><tr><td> Equipos / Reactivos </td><td> Modelo / Número de catálogo </td><td> Empresa </td></tr><tr><td> Esterilizador de bolas </td><td> Modelo Steri 250 gatos. # 18000-45 </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td></tr><tr><td> Cauterizador </td><td> Gato. # 18000-00 </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td></tr><tr><td> Vidrio de borosilicato capilares </td><td> Gato. # 300056 </td><td> Harvard Apparatus </td></tr><tr><td> Dos etapas de vidrio Micropipetas Extractor </td><td> Modelo 001-PC-10 </td><td> Narishige </td></tr><tr><td> Micrómetro jeringa </td><td> Gato. # GS-1100 </td><td> Instrumentos Gilmont </td></tr><tr><td> Pequeños Animales de instrumentos estereotáxica </td><td> Modelo 940-A </td><td> Kopf Instrumentación </td></tr><tr><td> Manipulador de electrodos </td><td> Modelo 960 </td><td> Kopf Instrumentación </td></tr><tr><td> Vetcare cámara </td><td> Gato. #340508 </td><td> Harvard Apparatus </td></tr><tr><td> Almohadilla eléctrica </td><td> Gato. # 341241 </td><td> Harvard Apparatus </td></tr><tr><td> Leica DFC360 FX cámara </td><td> DFC360 FX </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica DFC490 cámara </td><td> DFC490 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica DM5500 microscopio </td><td> DM5500 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica DFC3000 FX cámara </td><td> DFC3000 FX </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica MZ16 FA microscopio </td><td> MZ16 FA </td><td> Leica </td></tr><tr><td> CY3 filtro </td><td> Modelo # 11600231 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> FITC filtro </td><td> Modelo # 11513880 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> A4 DAPI / filtro UV </td><td> Modelo # 11504162 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Aglutinina de germen de trigo, Alexa Fluor 488 conjugada </td><td> Gato. # W11261 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Trigo germ aglutinina, Alexa Fluor 555 conjugada </td><td> Gato. # W32464 </td><td> Invitrogen </td></tr></tbody></table>

revelando la topografía del circuito neuronal en el multi-color

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

Circuitos neuronales se organizan en funcionamiento los mapas topográficos. Con el fin de visualizar la arquitectura de circuitos complejos, hemos desarrollado un enfoque para la etiqueta de forma fiable el patrón global de múltiples proyecciones topográficas. El cerebelo es un modelo ideal para estudiar la disposición ordenada de los circuitos neuronales. Por ejemplo, la organización compartimental de espinocerebelosa fibras musgosas ha demostrado ser un sistema indispensable para el estudio de los patrones de las fibras musgosas. Recientemente hemos demostrado que el germen de trigo crioaglutininas (WGA) conjugado con Alexa 555 y 488 se puede utilizar para rastrear espinocerebelosa proyecciones de las fibras musgosas en el desarrollo y los ratones adultos (Reeber et al. 2011). Se encontraron tres propiedades principales que hacen que las herramientas de Alexa WGA-trazadores deseable para el etiquetado de las proyecciones neuronales. En primer lugar, fluoróforos Alexa son intensos y su brillo permite obtener imágenes wholemount directamente después de rastrear. En segundo lugar, WGA-Alexa trazadores etiqueta de toda la trayectoria de desarrollo y adultos projectio neuralns. En tercer lugar, WGA-Alexa trazadores son transportados rápidamente en ambas direcciones, retrógrada y anterógrada. A continuación, describimos en detalle la forma de preparar los trazadores y otras herramientas necesarias, la forma de realizar la cirugía para espinocerebelosa localización y la mejor forma de proyección de imágenes trazadas en tres dimensiones. En resumen, ofrecemos un protocolo de paso a paso el seguimiento que será útil para descifrar la organización y la conectividad de los mapas funcionales, no sólo en el cerebelo, sino también en la corteza cerebral, tronco cerebral y médula espinal.

Ofrecemos una guía práctica para la entrega de los trazadores<em&gt; En vivo</em&gt; Y el uso de la vía espinocerebelosa como un sistema modelo para demostrar los pasos esenciales para el éxito del análisis del circuito neuronal en ratones. Se describe en detalle el protocolo versátil de seguimiento que explota aglutinina de germen de trigo (WGA) conjugado con fluoróforos Alexa.

Revelando la topografía del circuito neuronal en el Multi-Color

Los circuitos neuronales se organizan en mapas topográficos funcionales. Con el fin de visualizar la arquitectura de circuitos complejos, hemos desarrollado un enfoque para...

Este procedimiento describe un protocolo versátil de rastreo in vivo que utiliza glutenina de germen de trigo conjugada con fluoróforos Alexa para rastrear circuitos neuronales. Primero, se realiza una incisión en la región torácica inferior y en la región lumbar superior, y se cortan la fascia y los músculos espinales superficiales. El segundo paso consiste en realizar una laminectomía dorsal.A continuación, se prepara el microelectrodo y se fija al micromanipulador. Después, se realiza la inyección por presión de trazadores neuronales en la médula espinal. El paso final de este procedimiento consiste en proporcionar un adecuado cuidado postoperatorio durante la recuperación y otorgar suficiente tiempo para que los trazadores sean transportados a lo largo de los tractos objetivo.Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran la organización y conectividad de los mapas topográficos en la corteza cerebelosa, el tronco encefálico y la médula espinal mediante microscopía de inmunofluorescencia. La principal ventaja de este trazador frente a trazadores existentes como BDA o W-G-A-H-R-P, es que los trazadores WGA Alexa son lo suficientemente brillantes como para realizar imágenes

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Una cuestión fundamental en nuestra comprensión de los circuitos corticales es cómo las redes en diferentes capas corticales codificar la información sensorial. Aquí se describe la utilización de técnicas electrofisiológicas de múltiples electrodos de contacto laminar para grabar unidades únicas y potenciales locales de campo y análisis de la actualidad para identificar a las capas corticales.

El examen de procesamiento de la red local usando multi-contacto laminar de grabación de electrodos

Este documento presenta un enfoque combinado de fotoestimulación láser con las grabaciones de células enteras en ratones transgénicos que expresan GFP en poblaciones de neuronas inhibidoras limitan. La técnica permite la cartografía y de análisis cuantitativo de los locales de los circuitos sinápticos de las neuronas corticales específicas inhibitorias.

Mapeo de los circuitos neuronales inhibitorios por Laser Scanning fotoestimulación

Circuitos neuronales están topográficamente organizadas en compartimentos funcionales con determinados perfiles moleculares. Aquí, ofrecemos los pasos prácticos y técnicos para revelar la topografía global del cerebro mediante un método versátil wholemount tinción inmunohistoquímica. Se demuestra la utilidad del método que utiliza la citoarquitectura bien entendida y la circuitería de cerebelo.

La inmunohistoquímica wholemount de Topografía Revelando Complex Brain

Se describe un método para el etiquetado de las neuronas con colorantes fluorescentes en funcional predeterminada micro-dominios del neocórtex. En primer lugar, la imagen de la señal óptica intrínseca se utiliza para obtener un mapa funcional. Luego de dos fotones microscopía se utiliza para etiquetar y neuronas imagen dentro de un dominio de micro del mapa.

Etiquetado dirigida de neuronas en una versión concreta de Micro-funcional de dominio de la neocorteza por combinar la señal intrínseca e Imagen de dos fotones

Este protocolo describe reconstrucciones a gran escala de poblaciones neuronales selectivas, etiquetadas después de la infección retrógrada con un virus de la rabia modificado expresan marcadores fluorescentes, y analiza, racimo imparcial independiente que permiten la caracterización completa de las métricas morfológicas entre subclases neuronales distintas.

Las reconstrucciones de gran escala e imparcial La agrupación independiente, basada en métricas morfológicas para clasificar las neuronas en poblaciones selectivos

Aquí, presentamos un procedimiento para la realización de gran escala Ca 2 + imágenes con resolución celular a través de múltiples capas corticales en los ratones que se mueven libremente. Cientos de células activas se pueden observar simultáneamente usando un microscopio en miniatura montado en la cabeza acoplado con una sonda de prisma implantada.

Ca Cortical Multi-capa<sup&gt; 2+</sup&gt; Imágenes en ratones con movimientos libres con sondas de prisma y microscopía de fluorescencia miniaturizada

Cuando se integra con una placa de cabeza y un diseño óptico compatible con microscopios de uno y dos fotones, la lente de microprisma presenta una ventaja significativa en la medición de respuestas neuronales en una columna vertical en diversas condiciones, incluidos experimentos bien controlados en estados de cabeza fija o tareas de comportamiento natural en animales que se mueven libremente.

Obtención de imágenes a largo plazo de poblaciones neuronales identificadas mediante microprismas en animales que se mueven libremente y con la cabeza fija

Las áreas sensoriales primarias en el neocórtex exhiben actividades espontáneas únicas durante el desarrollo. Este artículo describe cómo visualizar las actividades neuronales individuales y las áreas sensoriales primarias para analizar las actividades sincrónicas específicas del área en ratones neonatos in vivo.

Visualización in vivo de la actividad espontánea en la corteza sensorial del ratón neonatal con una resolución de una sola neurona

Aquí, empleamos HD-MEA para profundizar en la dinámica computacional de conjuntos neuronales a gran escala, particularmente en el hipocampo, los circuitos del bulbo olfativo y las redes neuronales humanas. La captura de la actividad espacio-temporal, combinada con herramientas computacionales, proporciona información sobre la complejidad de los conjuntos neuronales. El método mejora la comprensión de las funciones cerebrales, lo que podría identificar biomarcadores y tratamientos para...

Registro y análisis de la dinámica de conjuntos neuronales multimodales a gran escala en una matriz de microelectrodos de alta densidad integrada en CMOS

Aquí, presentamos dos protocolos para el registro de microelectrocorticografía de alta densidad (μEcoG) en ratas y ratones, incluidos los métodos quirúrgicos, de implantación y de registro. Los registros de μECoG se realizan en combinación con el registro de politrodos laminares en la corteza auditiva de la rata o con la manipulación optogenética de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial del ratón.

Investigaciones multiescala del procesamiento cortical mediante la integración de politrodos laminares y optogenética con microelectrocorticografía en roedores

Aprende a trazar circuitos neuronales in vivo usando WGA-Alexa en ratones. Este protocolo permite visualizar proyecciones topográficas en cerebelo, corteza y médula con alta intensidad de señal para imagen tridimensional.

Revelando la topografía del circuito neuronal en el Multi-Color

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