Name: Las respuestas de imagen neuronal en los preparativos de la rebanada del órgano vomeronasal Expresando un sensor de calcio genéticamente codificados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Aprende a preparar rebanadas de tejido vivo del órgano vomeronasal en ratones transgénicos con G-CaMP2 para imaginar respuestas neuronales a feromonas. Este método preserva la morfología celular intacta y permite analizar patrones de activación con imágenes de calcio en tiempo real.

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Agradecemos a Andrea Moran junto con los miembros del Servicio de Instalaciones para Animales de Laboratorio (LASF) del Instituto Stowers por su excelente apoyo en manejo animal y servicios técnicos. Este trabajo cuenta con financiamiento del Instituto Stowers y los NIH (NIDCD 008003) otorgado a CRY. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional sobre la Sordera y otros Trastornos de la Comunicación ni de los Institutos Nacionales de Salud. Patente estadounidense en trámite para los ratones tetO-G-CaMP2 a nombre del Instituto Stowers, CRY y LM.

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<li>Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+three-dimensional+fluorescence+imaging+of+activity+in+neural+populations+by+objective-coupled+planar+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy.</a> Neuron. 57, 661-672 (2008).</li>
<li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+I+peptides+as+chemosensory+signals+in+the+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ.</a> Science. 306, 1033-1037 (2004).</li>
<li>He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+signals+conveyed+by+pheromone+concentrations+to+the+mouse+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct signals conveyed by pheromone concentrations to the mouse vomeronasal organ.</a> J. Neurosci. 30, 7473-7483 (2010).</li>
<li>Haga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+male+mouse+pheromone+ESP1+enhances+female+sexual+receptive+behaviour+through+a+specific+vomeronasal+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor.</a> Nature. 466, 118-122 (2010).</li>
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No se declararon conflictos de intereses.

La mayoría de los receptores vomeronasales (VR) permanecen como receptores huérfanos desde su descubrimiento por Dulac y Axel 5. Los ligandos feromonales para estos receptores quimiosensoriales y sus funciones en la mediación de comportamientos animales no están bien comprendidos. Hasta ahora, solo se ha identificado un par ligando/receptor, el péptido ESP1 y su receptor homólogo Vmn2r116 (V2Rp5), que ha demostrado transmitir información social específica 19,23. Se ha demostrado que otro receptor, V...

las respuestas de imagen neuronal en los preparativos de la rebanada del órgano vomeronasal expresando un sensor de calcio genéticamente codificados

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

El órgano vomeronasal (VNO) detecta señales quimiosensoriales que portan información sobre el estado social, sexual y reproductivo de los individuos de la misma especie 1,2. Estas señales intraspecíficas, las feromonas, así como señales de algunos depredadores 3, activan a las neuronas sensoriales vomeronasales (VSNs) con altos niveles de especificidad y sensibilidad 4. Al menos tres familias distintas de receptores acoplados a proteínas G, V1R, V2R y FPR 5-14, se expresan en las neuronas del VNO para mediar la detección de las señales quimiosensoriales. Para comprender cómo se codifica la información feromonal por el VNO, es fundamental analizar los perfiles de respuesta de neuronas VSN individuales frente a diversos estímulos e identificar los receptores específicos que median estas respuestas.
Las neuroepitelios del órgano vomeronasal (VNO) están encerrados en un par de huesos vomerinos. La estructura tubular semicerrada del VNO tiene un extremo abierto (el conducto vomeronasal) que se conecta con la cavidad nasal. Las neuronas sensoriales vomeronasales (VSN) extienden sus dendritas hacia la parte luminal del VNO, donde las señales de feromonas entran en contacto con los receptores expresados en los botones dendríticos. Los cuerpos celulares de las VSN forman capas pseudoestratificadas, con V1R y V2R expresados en las capas apical y basal, respectivamente 6-8. Se han utilizado varias técnicas para monitorear las respuestas de las VSN a estímulos sensoriales 4,12,15-19. Entre estas técnicas, la preparación de cortes agudos ofrece varias ventajas. Primero, en comparación con las VSN disociadas 3,17, las preparaciones en corte mantienen a las neuronas en su morfología nativa y las dendritas de las células permanecen relativamente intactas. Segundo, los cuerpos celulares de las VSN son fácilmente accesibles en cortes coronales del VNO, lo que permite estudios de electrofisiología y experimentos de imagen, a diferencia de las preparaciones de epitelio completo y montajes completos 12,20. Tercero, este método puede combinarse con técnicas de clonación molecular para permitir la identificación de receptores.
La estimulación sensorial provoca una fuerte entrada de Ca2+ en las VSN, lo que indica la activación del receptor 4,21. Por lo tanto, desarrollamos ratones transgénicos que expresan G-CaMP2 en las neuronas sensoriales olfativas, incluidas las VSN 15,22. La sensibilidad y la naturaleza genética de la sonda facilitan enormemente los experimentos de imagen de Ca2+. Este método ha eliminado el proceso de carga con colorante utilizado en estudios previos 4,21. También empleamos un sistema de administración de ligandos que permite aplicar diversos estímulos a cortes del órgano vomeronasal. La combinación de ambas técnicas nos permite monitorear simultáneamente múltiples neuronas en respuesta a un gran número de estímulos. Finalmente, hemos establecido una canalización de análisis semiautomatizada para ayudar en el procesamiento de imágenes.

El órgano vomeronasal (VNO) detecta señales químicas intraspecíficas que transmiten información social y reproductiva. Hemos realizado experimentos de imagen de Ca2+ utilizando ratones transgénicos que expresan G-CaMP2 en el tejido del VNO. Este enfoque nos permite analizar los complejos patrones de respuesta de las neuronas vomeronasales frente a un gran número de estímulos de feromonas.

Las respuestas de imagen neuronal en los preparativos de la rebanada del órgano vomeronasal Expresando un sensor de calcio genéticamente codificados

El órgano vomeronasal (OVN) detecta señales quimiosensoriales que transportan información sobre el estado social, sexual y reproductivo de los individuos dentro de...

El objetivo general de este procedimiento es ilustrar cómo preparar cortes de tejido vivo para la obtención de imágenes de las respuestas a feromonas en neuronas del órgano nasal MRO. Esto se logra primero preparando cortes de tejido vivo del órgano nasal MRO o del VNO de ratones que expresan un indicador genético de calcio GCaMP dos. El siguiente paso consiste en configurar el sistema de perfusión sobre la platina del microscopio para mantener el corte, aplicar el estímulo y realizar la adquisición de imágenes.La respuesta. A continuación, se realiza un experimento de imágenes de lapso de tiempo con diversos estímulos de feromonas, seguido de un análisis de datos de los resultados de las imágenes. Finalmente, se obtienen los patrones de respuesta de las neuronas del órgano vomeronasal a diferentes estímulos de feromonas.La principal ventaja de esta técnica o de métodos existentes como la carga con calcio D o la obtención de imágenes en células disociadas es que podemos preservar la morfología intacta de las células, mantener mejor la salud de los cortes y obtener una señal más fuerte. Este método puede ayudarnos a responder algunas de las preguntas clave en los estudios del sistem

imaging-neuronal-responses-slice-preparations-vomeronasal-organ

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se describe una técnica establecida para medir y analizar el olor de respuestas evocadas de calcio en el lóbulo antenal de...

El calcio de la imagen del olor de respuestas evocadas en el Drosophila Lóbulo antenal

En ratones, la capacidad de detectar las feromonas está mediado por el órgano vomeronasal (OVN). Aquí, una rebanada de preparación de tejidos aguda de VNO para la realización de imágenes de calcio se describe. Este enfoque permite a las observaciones fisiológicas de las subpoblaciones y / o las neuronas individuales en un tejido vivo y es conveniente para la identificación del receptor-ligando.

Imágenes de detección de feromonas en una preparación de ratón Vomeronasal aguda lámina de tejido

En este protocolo, actualizamos los recientes avances en imágenes...

Respuestas imágenes de calcio en las neuronas GFP-etiquetados de hipotalámicas rodajas de cerebro de ratón

El video del protocolo describe el establecimiento de una pinza de parche de célula completa para el registro electrofisiológico de las neuronas sensoriales del órgano vomeronasal (VNO) en ratones. Un corte coronal de VNO con neuronas sensoriales marcadas con fluorescencia se coloca en una configuración de grabación. Una neurona marcada se conecta con una pipeta de registro en una configuración de celda completa para el registro electrofisiológico en respuesta a estímulos químicos.

Establecimiento de una pinza de parche de celda completa para el registro electrofisiológico de las neuronas sensoriales vomeronasiales

Aquí, describimos un enfoque fisiológico que permite la identificación y el análisis en profundidad de una población definida de neuronas sensoriales en cortes agudos de tejido coronal del órgano vomeronasal de ratón utilizando registros de patch-clamp de células completas.

Análisis fisiológico en profundidad de poblaciones de células definidas en el infarto agudo del tejido Rebanadas del ratón órgano vomeronasal

Este protocolo describe el uso de genéticamente codificados Ca2 + periodistas a registramos cambios en la actividad neuronal en comportarse gusanos Caenorhabditis elegans .

Imagen radiométrica calcio de neuronas individuales en comportamiento Caenorhabditis Elegans

Aquí presentamos un protocolo con el que el calcio pre y/o postsináptico se puede visualizar en el contexto del aprendizaje y la memoria de Drosophila. La imagen de calcio in vivo utilizando sensores de calcio localizados sinaptically se combina con un paradigma de acondicionamiento olfativo clásico de tal manera que se puede determinar la plasticidad sináptica subyacente a este tipo de aprendizaje asociativo.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Aquí presentamos cómo exponer el ganglio geniculado de un ratón de laboratorio vivo y anestesiado y cómo usar imágenes de calcio para medir las respuestas de conjuntos de estas neuronas a los estímulos del sabor, lo que permite múltiples ensayos con diferentes estimulantes. Esto permite comparaciones en profundidad de qué neuronas responden a qué saborantes.

Imágenes de calcio in vivo de las respuestas de las neuronas ganglionares geniculadas de ratón a los estímulos del gusto

Presentamos un protocolo para exponer el médula oblonga del ratón adulto del lado ventral. Mediante el uso de una lente de índice de refracción de gradiente con un microscopio en miniatura, las imágenes de calcio se pueden utilizar para examinar la actividad de los somatas neuronales oliva inferiores in vivo.

In vivo Imágenes de calcio en la aceituna inferior de ratón

Los métodos actuales describen un enfoque no ratiométrico para imágenes de calcio subcompartimentales de alta resolución in vivo en Caenorhabditis elegans utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente fácilmente disponibles.

Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo

Este protocolo describe imágenes de calcio GCaMP in vivo de neuronas intactas del ganglio trigémino (TG). Esta descripción incluye cirugía de exposición TG, imágenes de microscopía confocal in vivo de neuronas TG, aplicación de estímulos somáticos durante imágenes microscópicas de neuronas TG y análisis de datos de imágenes de calcio GCaMP in vivo .

In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios del trigémino intactos

Aprende a preparar rebanadas de tejido vivo del órgano vomeronasal en ratones transgénicos con G-CaMP2 para imaginar respuestas neuronales a feromonas. Este método preserva la morfología celular intacta y permite analizar patrones de activación con imágenes de calcio en tiempo real.

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