Name: Las respuestas de imagen neuronal en los preparativos de la rebanada del órgano vomeronasal Expresando un sensor de calcio genéticamente codificados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Aprende a preparar rebanadas de tejido vivo del órgano vomeronasal en ratones transgénicos con G-CaMP2 para imaginar respuestas neuronales a feromonas. Este método preserva la morfología celular intacta y permite analizar patrones de activación con imágenes de calcio en tiempo real.

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Agradecemos a Andrea Moran junto con los miembros del Servicio de Instalaciones para Animales de Laboratorio (LASF) del Instituto Stowers por su excelente apoyo en manejo animal y servicios técnicos. Este trabajo cuenta con financiamiento del Instituto Stowers y los NIH (NIDCD 008003) otorgado a CRY. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional sobre la Sordera y otros Trastornos de la Comunicación ni de los Institutos Nacionales de Salud. Patente estadounidense en trámite para los ratones tetO-G-CaMP2 a nombre del Instituto Stowers, CRY y LM.

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<li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+I+peptides+as+chemosensory+signals+in+the+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ.</a> Science. 306, 1033-1037 (2004).</li>
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<li>Haga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+male+mouse+pheromone+ESP1+enhances+female+sexual+receptive+behaviour+through+a+specific+vomeronasal+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor.</a> Nature. 466, 118-122 (2010).</li>
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No se declararon conflictos de intereses.

La mayoría de los receptores vomeronasales (VR) permanecen como receptores huérfanos desde su descubrimiento por Dulac y Axel 5. Los ligandos feromonales para estos receptores quimiosensoriales y sus funciones en la mediación de comportamientos animales no están bien comprendidos. Hasta ahora, solo se ha identificado un par ligando/receptor, el péptido ESP1 y su receptor homólogo Vmn2r116 (V2Rp5), que ha demostrado transmitir información social específica 19,23. Se ha demostrado que otro receptor, V...

las respuestas de imagen neuronal en los preparativos de la rebanada del órgano vomeronasal expresando un sensor de calcio genéticamente codificados

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

El órgano vomeronasal (VNO) detecta señales quimiosensoriales que portan información sobre el estado social, sexual y reproductivo de los individuos de la misma especie 1,2. Estas señales intraspecíficas, las feromonas, así como señales de algunos depredadores 3, activan a las neuronas sensoriales vomeronasales (VSNs) con altos niveles de especificidad y sensibilidad 4. Al menos tres familias distintas de receptores acoplados a proteínas G, V1R, V2R y FPR 5-14, se expresan en las neuronas del VNO para mediar la detección de las señales quimiosensoriales. Para comprender cómo se codifica la información feromonal por el VNO, es fundamental analizar los perfiles de respuesta de neuronas VSN individuales frente a diversos estímulos e identificar los receptores específicos que median estas respuestas.
Las neuroepitelios del órgano vomeronasal (VNO) están encerrados en un par de huesos vomerinos. La estructura tubular semicerrada del VNO tiene un extremo abierto (el conducto vomeronasal) que se conecta con la cavidad nasal. Las neuronas sensoriales vomeronasales (VSN) extienden sus dendritas hacia la parte luminal del VNO, donde las señales de feromonas entran en contacto con los receptores expresados en los botones dendríticos. Los cuerpos celulares de las VSN forman capas pseudoestratificadas, con V1R y V2R expresados en las capas apical y basal, respectivamente 6-8. Se han utilizado varias técnicas para monitorear las respuestas de las VSN a estímulos sensoriales 4,12,15-19. Entre estas técnicas, la preparación de cortes agudos ofrece varias ventajas. Primero, en comparación con las VSN disociadas 3,17, las preparaciones en corte mantienen a las neuronas en su morfología nativa y las dendritas de las células permanecen relativamente intactas. Segundo, los cuerpos celulares de las VSN son fácilmente accesibles en cortes coronales del VNO, lo que permite estudios de electrofisiología y experimentos de imagen, a diferencia de las preparaciones de epitelio completo y montajes completos 12,20. Tercero, este método puede combinarse con técnicas de clonación molecular para permitir la identificación de receptores.
La estimulación sensorial provoca una fuerte entrada de Ca2+ en las VSN, lo que indica la activación del receptor 4,21. Por lo tanto, desarrollamos ratones transgénicos que expresan G-CaMP2 en las neuronas sensoriales olfativas, incluidas las VSN 15,22. La sensibilidad y la naturaleza genética de la sonda facilitan enormemente los experimentos de imagen de Ca2+. Este método ha eliminado el proceso de carga con colorante utilizado en estudios previos 4,21. También empleamos un sistema de administración de ligandos que permite aplicar diversos estímulos a cortes del órgano vomeronasal. La combinación de ambas técnicas nos permite monitorear simultáneamente múltiples neuronas en respuesta a un gran número de estímulos. Finalmente, hemos establecido una canalización de análisis semiautomatizada para ayudar en el procesamiento de imágenes.

El órgano vomeronasal (VNO) detecta señales químicas intraspecíficas que transmiten información social y reproductiva. Hemos realizado experimentos de imagen de Ca2+ utilizando ratones transgénicos que expresan G-CaMP2 en el tejido del VNO. Este enfoque nos permite analizar los complejos patrones de respuesta de las neuronas vomeronasales frente a un gran número de estímulos de feromonas.

Las respuestas de imagen neuronal en los preparativos de la rebanada del órgano vomeronasal Expresando un sensor de calcio genéticamente codificados

El órgano vomeronasal (OVN) detecta señales quimiosensoriales que transportan información sobre el estado social, sexual y reproductivo de los individuos dentro de...

El objetivo general de este procedimiento es ilustrar cómo preparar cortes de tejido vivo para la obtención de imágenes de las respuestas a feromonas en neuronas del órgano nasal MRO. Esto se logra primero preparando cortes de tejido vivo del órgano nasal MRO o del VNO de ratones que expresan un indicador genético de calcio GCaMP dos. El siguiente paso consiste en configurar el sistema de perfusión sobre la platina del microscopio para mantener el corte, aplicar el estímulo y realizar la adquisición de imágenes.La respuesta. A continuación, se realiza un experimento de imágenes de lapso de tiempo con diversos estímulos de feromonas, seguido de un análisis de datos de los resultados de las imágenes. Finalmente, se obtienen los patrones de respuesta de las neuronas del órgano vomeronasal a diferentes estímulos de feromonas.La principal ventaja de esta técnica o de métodos existentes como la carga con calcio D o la obtención de imágenes en células disociadas es que podemos preservar la morfología intacta de las células, mantener mejor la salud de los cortes y obtener una señal más fuerte. Este método puede ayudarnos a responder algunas de las preguntas clave en los estudios del sistema nasal de gusanos, como identificar los ligandos y sus receptores, y caracterizar las respuestas individuales de las neuronas nasales de los gusanos. Este método también puede aplicarse a otros sistemas, como el olfativo, el suero o la psoriasis cerebral.Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades debido a la complejidad para obtener un buen modelo de psoriasis y para configurar el sistema de perfusión. Antes de comenzar este procedimiento, prepare las soluciones necesarias, incluyendo la solución de Ringer artificial para líquido cefalorraquídeo de ratón, agarosa de bajo punto de fusión al 4 % y los estímulos de feromonas, según se indica en el manuscrito adjunto. Luego, coloque dos tubos de agarosa de bajo punto de fusión en un bloque térmico.Establezca la temperatura a más de 60 grados Celsius para fundir los aros. Una vez que el gel se licúe, transfiera los tubos a un bloque térmico de 37 grados Celsius. Para preparar los cortes del órgano vomeronasal.Después de decapitar un ratón GCaMP dos que ha sido eutanasiado, corte los huesos de la mandíbula con un par de tijeras para retirar la mandíbula inferior. A continuación, desprenda el tejido del paladar superior acanalado para exponer la cavidad nasal. Luego, separe los huesos de la mandíbula insertando una hoja quirúrgica entre los dos incisivos frontales.Retire cuidadosamente el hueso maxilar para exponer el órgano vomeronasal. En este punto, levante todo el órgano vomeronasal de la cavidad nasal sujetándolo por el extremo caudal. Transfiera el órgano vomeronasal a una solución de LCR para ratón fría y oxigenada.Inmediatamente bajo el microscopio de disección, separe los dos VNO deslizando suavemente las puntas de la pinza a lo largo de la pared del hueso septal. Retire el hueso vulner que rodea el tejido del VNO. Luego, levante suavemente todo el tejido del VNO de la cavidad ósea.Se debe tener extrema precaución en este paso para evitar dañar el epitelio neural. A continuación, retire por completo los pequeños fragmentos óseos que quedan sobre la superficie del tejido. Antes de incrustar los fragmentos restantes.El tejido puede quedar atrapado por la hoja de corte, lo que provocaría que el tejido saliera del bloque de aros. Después de eso, use la pinza para sostener el extremo posterior del tejido del órgano vomeronasal y sumérjalo suavemente en el aros fundido. Enfríe rápidamente el tubo en hielo.Para solidificar el aros, el proceso de inclusión y enfriamiento debe tomar menos de dos minutos. Luego, recorte el bloque de aros que contiene el VNO y péguelo al soporte de tejido. Posteriormente, inserte el soporte de tejido en el cilindro metálico y llene la cámara restante con más aros de bajo punto de fusión.Una vez que el agarosa de bajo punto de fusión solidifique sobre hielo, proceda inmediatamente al corte: suministre CSF de ratón A oxigenado y frío a la cámara de corte de la cortadora de tejidos y corte las secciones con un grosor de 180 a 200 micrones cada una. Luego, recoja y transfiera las secciones a la cámara de incubación. Las secciones permanecen viables durante seis a ocho horas en el CSF de ratón A oxigenado a temperatura ambiente.En este procedimiento, primero coloque un corte del órgano vomeronasal (VNO) en el centro de la cámara de perfusión y sujete el corte con un anclaje para cortes. Los hilos del anclaje deben presionar únicamente la parte del corte compuesta por agarosa fundida a baja temperatura, pero no el tejido del VNO. Luego, introduzca el LCR artificial para ratón oxigenado en la cámara de perfusión a través del puerto de entrada a aproximadamente 100 microlitros por segundo.El líquido se drena a través de una aguja de succión mediante el puerto de salida para proporcionar un flujo continuo de nuevo LCR de ratón. A continuación, llene una jeringa de 30 mililitros con solución de Ringer y sujétela a la bomba de jeringa. Ajuste la velocidad de la bomba a entre 300 y 600 microlitros por minuto.Para proporcionar un flujo continuo de solución de Ringer sobre el corte, conecte la salida del Ringer al bucle de inyección A-H-P-L-C. El control del bucle de inyección tiene dos rutas de flujo. En la posición de carga, cargue la muestra de orina de ratón en el bucle de muestra con una jeringa de precisión Hamilton.La muestra en exceso sale del bucle de muestra a través de la salida de desecho. La solución de Ringer inyectada por la bomba de jeringa evita el bucle de muestra y va directamente a la salida, que está conectada a la punta de perfusión en la posición de inyección. La solución de la bomba fluye a través del bucle de muestra y empuja los estímulos de feromonas hacia la salida.Antes del experimento de imagen. Elimine las burbujas de aire para garantizar un flujo uniforme del fluido de perfusión. Luego ajuste la punta de perfusión bajo un objetivo de cinco x o 10 x de manera que la punta quede a aproximadamente un milímetro de distancia del corte de la vena O.Para medir el tiempo de retardo de la muestra y la duración, cargue con colorante fluorescente 0,1 % del colorante rho domine seis G en el bucle de muestra. Luego cambie la válvula a la posición de inyección. Cinco segundos después del inicio de la adquisición de imágenes, detecte la señal fluorescente entre 10 y 30 segundos.La curva suave de la señal fluorescente también indica que hay poca turbulencia generada bajo la lente de inmersión y que una perfusión adecuada de LCR de ratón oxigenado alcanza el corte en nuestro laboratorio. El microscopio Zeiss Axio scope FS dos con una lente de inmersión en agua de 10 x o 20 x se utiliza para la obtención de imágenes con lapso de tiempo para detectar señales GAMP dos. Se utiliza el filtro estándar de banda pasante GFP de 450 a 490 nanómetros.Las imágenes fluorescentes epi se adquieren mediante una cámara CCD con un barrido de uno por uno o de dos por dos, dependiendo de los niveles de expresión de GCaMP dos. En primer lugar, configure la velocidad de adquisición en un cuadro por segundo. Ajuste la intensidad de la luz para minimizar el apagado de las señales de GCaMP dos y el daño fotoinducido en las células.Luego, cambie la válvula a la posición de inyección en un punto específico del tiempo para obtener retrasos temporales consistentes en todos los ensayos dentro de un conjunto de experimentos. Ahora, realice una prueba piloto utilizando solución de Ringer como estímulo y ajuste nuevamente el sistema de perfusión si se introduce un artefacto de movimiento durante la inyección de la muestra. Después de eso, realice un ensayo de control positivo con orina de ratón diluida uno a 100 en solución para prevenir la contaminación cruzada entre diferentes muestras.Lave la jeringa Hamilton con solución de Ringer al menos tres veces después de cargar un estímulo. De manera similar, lave el bucle de muestra con solución de Ringer al menos tres veces entre diferentes estímulos antes de aplicarlos. Espere entre cuatro y diez minutos con el siguiente estímulo para que las neuronas sensoriales nasales MRO se recuperen y así realizar el registro de imágenes de todas las imágenes obtenidas de un corte.Se utiliza un script VBA personalizado en Avision para automatizar este proceso. En este caso, todos los fotogramas de imagen dentro del mismo experimento se registran respecto a un fotograma de referencia común elegido, con ajuste elástico, para realizar la sustracción de imágenes y así identificar las células que responden. Se utilizan macros personalizadas en ImageJ versión 1.42 para automatizar este proceso.Se genera una imagen de proyección mínima para cada pila y las células respondientes emergen tras restar la proyección mínima de las pilas originales. A continuación, identifique la región de interés a partir de las pilas sustraídas y obtenga las coordenadas de la ROI utilizando el complemento multi mesure de Image J. Luego, procese todas las pilas de un experimento y guarde todas las coordenadas de la ROI en una lista maestra de ROI. Después, utilice la lista maestra de ROI para medir las respuestas celulares en las pilas de imágenes originales mediante un macro personalizado y el complemento multi mesure de Image J. Finalmente, represente las curvas de respuesta y el mapa de calor en Matlab.Se muestra aquí un ejemplo del experimento de imagen del órgano vomeronasal (VNO) utilizando muestras de orina recolectadas de cuatro ratones individuales. Alrededor de 80 células presentan respuesta a al menos uno de los estímulos urinarios, y sus valores de respuesta delta F divididos por F se representan en el mapa de calor. A continuación se muestran las trazas de respuesta de las células uno, dos y tres, que muestran la activación a lo largo del tiempo por los estímulos urinarios; la célula uno presenta respuesta a ambas muestras de orina de hembra, pero no a las muestras de macho.Mientras que la célula dos muestra patrones opuestos de activación y responde a ambas muestras masculinas. Solo la célula tres se activa mediante muestras individuales masculinas y femeninas. Una vez realizada, la sección puede prepararse en 30 minutos y las neuronas del trozo pueden mantenerse vivas entre seis y ocho horas si se realiza adecuadamente.Al intentar este método, es importante recordar el uso de reactivos de grado para cultivo de tejidos y evitar que los reactivos de fijación de tejidos entren en contacto con las preparaciones tisulares. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar tejido vivo de psoriasis para la obtención de imágenes de respuestas térmicas en neuronas de Vienna mediante el uso de ratones que expresan G Camp.

imaging-neuronal-responses-slice-preparations-vomeronasal-organ

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se describe una técnica establecida para medir y analizar el olor de respuestas evocadas de calcio en el lóbulo antenal de...

El calcio de la imagen del olor de respuestas evocadas en el Drosophila Lóbulo antenal

En ratones, la capacidad de detectar las feromonas está mediado por el órgano vomeronasal (OVN). Aquí, una rebanada de preparación de tejidos aguda de VNO para la realización de imágenes de calcio se describe. Este enfoque permite a las observaciones fisiológicas de las subpoblaciones y / o las neuronas individuales en un tejido vivo y es conveniente para la identificación del receptor-ligando.

Imágenes de detección de feromonas en una preparación de ratón Vomeronasal aguda lámina de tejido

En este protocolo, actualizamos los recientes avances en imágenes...

Respuestas imágenes de calcio en las neuronas GFP-etiquetados de hipotalámicas rodajas de cerebro de ratón

El video del protocolo describe el establecimiento de una pinza de parche de célula completa para el registro electrofisiológico de las neuronas sensoriales del órgano vomeronasal (VNO) en ratones. Un corte coronal de VNO con neuronas sensoriales marcadas con fluorescencia se coloca en una configuración de grabación. Una neurona marcada se conecta con una pipeta de registro en una configuración de celda completa para el registro electrofisiológico en respuesta a estímulos químicos.

Establecimiento de una pinza de parche de celda completa para el registro electrofisiológico de las neuronas sensoriales vomeronasiales

Aquí, describimos un enfoque fisiológico que permite la identificación y el análisis en profundidad de una población definida de neuronas sensoriales en cortes agudos de tejido coronal del órgano vomeronasal de ratón utilizando registros de patch-clamp de células completas.

Análisis fisiológico en profundidad de poblaciones de células definidas en el infarto agudo del tejido Rebanadas del ratón órgano vomeronasal

Este protocolo describe el uso de genéticamente codificados Ca2 + periodistas a registramos cambios en la actividad neuronal en comportarse gusanos Caenorhabditis elegans .

Imagen radiométrica calcio de neuronas individuales en comportamiento Caenorhabditis Elegans

Aquí presentamos un protocolo con el que el calcio pre y/o postsináptico se puede visualizar en el contexto del aprendizaje y la memoria de Drosophila. La imagen de calcio in vivo utilizando sensores de calcio localizados sinaptically se combina con un paradigma de acondicionamiento olfativo clásico de tal manera que se puede determinar la plasticidad sináptica subyacente a este tipo de aprendizaje asociativo.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Aquí presentamos cómo exponer el ganglio geniculado de un ratón de laboratorio vivo y anestesiado y cómo usar imágenes de calcio para medir las respuestas de conjuntos de estas neuronas a los estímulos del sabor, lo que permite múltiples ensayos con diferentes estimulantes. Esto permite comparaciones en profundidad de qué neuronas responden a qué saborantes.

Imágenes de calcio in vivo de las respuestas de las neuronas ganglionares geniculadas de ratón a los estímulos del gusto

Presentamos un protocolo para exponer el médula oblonga del ratón adulto del lado ventral. Mediante el uso de una lente de índice de refracción de gradiente con un microscopio en miniatura, las imágenes de calcio se pueden utilizar para examinar la actividad de los somatas neuronales oliva inferiores in vivo.

In vivo Imágenes de calcio en la aceituna inferior de ratón

Los métodos actuales describen un enfoque no ratiométrico para imágenes de calcio subcompartimentales de alta resolución in vivo en Caenorhabditis elegans utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente fácilmente disponibles.

Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo

Este protocolo describe imágenes de calcio GCaMP in vivo de neuronas intactas del ganglio trigémino (TG). Esta descripción incluye cirugía de exposición TG, imágenes de microscopía confocal in vivo de neuronas TG, aplicación de estímulos somáticos durante imágenes microscópicas de neuronas TG y análisis de datos de imágenes de calcio GCaMP in vivo .

In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios del trigémino intactos

Aprende a preparar rebanadas de tejido vivo del órgano vomeronasal en ratones transgénicos con G-CaMP2 para imaginar respuestas neuronales a feromonas. Este método preserva la morfología celular intacta y permite analizar patrones de activación con imágenes de calcio en tiempo real.

Las respuestas de imagen neuronal en los preparativos de la rebanada del órgano vomeronasal Expresando un sensor de calcio genéticamente codificados (Video) | JoVE Journal

Las respuestas de imagen neuronal en los preparativos de la rebanada del órgano vomeronasal Expresando un sensor de calcio genéticamente codificados

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