Estiramiento secuencias cortas de ADN con fuerza constante pinzas axial óptico

El objetivo general de este procedimiento es manipular moléculas de ADN cortas de 100 nanómetros de longitud mediante fuerzas ópticas constantes y bien calibradas. Esto se logra anclando el ADN por un extremo a una cubeta y por el otro a una microesfera de poliestireno. A continuación, se alinean y calibran las pinzas ópticas.

Luego, el ADN se estira alejándolo de la superficie mediante una combinación de fuerzas de gradiente y fuerzas de dispersión que actúan sobre la microesfera. Finalmente, el ADN se extiende atrapando el gránulo en la región lineal del potencial. El protocolo se ha utilizado para estudiar las propiedades mecánicas del ADN y la cinética de unión entre ADN y proteínas, y además ha sido útil para esclarecer la importancia de las condiciones de contorno en la elasticidad de constructos de ADN cortos.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el alineamiento y la calibración de las pinzas ópticas de fuerza constante son difíciles y complejos. Las pinzas ópticas incluyen un haz de un láser de 1064 nanómetros que se divide en dos haces ortogonalmente polarizados. Uno se utiliza para manipular la biomolécula y el otro se emplea con fines de calibración.

La intensidad del haz de manipulación se controla mediante un deflector óptico acoustoóptico (AO) o un atenuador de densidad óptica (OD). A continuación, los haces se recombinan con otro divisor de haz polarizante. Los haces se enfocan estrechamente mediante un objetivo microscópico de inmersión en aceite plan APO 60x 1.4 sobre la celda de muestra. Esta configuración de pinzas ópticas se combina con un microscopio de campo claro construido en el laboratorio que proporciona iluminación desde una lámpara de halógeno enfocada en la cámara de muestra mediante un condensador.

La imagen de campo brillante se separa de la luz láser mediante un espejo dicróico y luego se proyecta sobre dos cámaras CCD. Una CCD actúa como nuestro medio principal para adquirir datos y se activa mediante software para obtener tasas de muestreo precisas. Mientras tanto, la otra CCD se utiliza para obtener imágenes de una microesfera de referencia única atrapada, cuya posición sirve como un sistema de control de retroalimentación para compensar la deriva en el microscopio.

La muestra se posiciona aproximadamente con respecto al objetivo mediante una platina XY y luego puede posicionarse con precisión mediante una platina piso integrada tridimensional. La luz láser dispersada hacia adelante y transmitida es recogida por el condensador de campo claro y enfocada sobre un fotodetector para calibrar el tamaño del gránulo, cargar una cámara de muestra con una solución dispersa de microesferas de poliestireno de 800 nanómetros de diámetro diluidas en solución salina tamponada con fosfato. Déjela reposar durante 10 a 15 minutos y luego enjuague suavemente con tampón.

Para eliminar microesferas en exceso, localice una microesfera adherida aleatoriamente al cubreobjetos y ajuste la altura de la cámara de muestra hasta que la microesfera se encuentre aproximadamente un micrómetro por debajo del enfoque. Para generar una imagen desenfocada y medir el tamaño aparente de la imagen usando LabVIEW, primero encuentre el centro de la microesfera mediante la función de coincidencia de patrones geométricos. A continuación, genere un perfil radial de intensidad de la microesfera promediando 360 grados.

En el centro de cada sección transversal, ajuste el perfil radial, que corresponde a un anillo blanco en cada una de las imágenes de campo brillante, mediante una función cuadrática. Para hallar un pico de luminosidad, la distancia entre este pico y el centro puede utilizarse como una medida del tamaño aparente de la perla. Utilizando la etapa piso calibrada, aumente gradualmente la posición axial de la microesfera y adquiera una imagen en cada posición axial con la cámara CCD. Repita el análisis de imagen para cada imagen sucesiva con el fin de correlacionar el tamaño aparente de la microesfera con su ubicación axial.

La resolución axial obtenida mediante este método es de aproximadamente 1,4 nanómetros para mapear el potencial óptico del haz de manipulación. Comience por alinear colinealmente el haz de manipulación y el haz de calibración con el haz de manipulación apagado. Confinar una microesfera libre dentro de la trampa mucho más rígida del haz de calibración. Ahora encienda el haz de manipulación.

Dado que es mucho más débil que el haz de calibración, la posición axial de la microesfera se verá ligeramente perturbada. El cambio resultante en la posición axial puede medirse a partir de las imágenes desenfocadas de campo brillante, tal como ya se ha descrito. Desplace el enfoque axial y repita; grafique el desplazamiento delta X frente a la posición axial del enfoque del haz de calibración.

La posición axial correspondiente al mayor desplazamiento de la microesfera determina el centro de la región lineal del trampa óptica. Para estirar una muestra de ADN, monte la cámara que contiene las moléculas de ADN ancladas a la superficie y, mientras observa la imagen de campo brillante, coloque el enfoque del haz de manipulación ligeramente por encima de las microesferas sin estirar ajustando el telescopio; luego, ajuste la posición de la platina hasta que una de las microesferas quede atrapada. Posicione aproximadamente la microesfera en el centro del plano XY de la trampa óptica, genere una serie de ondas cuadradas en LabVIEW y envíelas al AOD para encender y apagar repetidamente el haz láser.

Observe la microesfera mientras la trampa se enciende y se apaga repetidamente. Observe si el láser induce alguna dirección preferencial en el movimiento de la microesfera mientras ajusta iterativamente la posición de la microesfera tanto en la dirección X como en la Y. Al controlar la etapa piso, el movimiento aleatorio de la microesfera debería volverse isotrópico en el plano X-Y, aunque notablemente restringido cuando el láser está encendido.

A continuación, alinee la perla en la dirección Z. Vuelva a pulsar el haz láser encendiendo y apagando. Esta vez, mientras mide simultáneamente el desplazamiento axial de las microesferas en tiempo real.

Centre la platina dentro de la región lineal, que es el punto donde el desplazamiento en Z es máximo para estirar la rampa de ADN, la intensidad del láser enviando una señal de voltaje al A OD desde cero voltios hasta 0,5 voltios en pasos de 0,025 voltios en cada paso. Registre 400 cuadros a 100 cuadros por segundo y promédielos para obtener el desplazamiento axial. Finalmente, trace las curvas de fuerza-extensión y ajústelas a un modelo de cadena helicoidal modificada.

Se muestran aquí curvas de fuerza-extensión para secuencias de ADN 2D, de 1, 298 pares de bases y 247 pares de bases de longitud, correspondientes a tramos cortos de ADN. El modelo convencional de cadena worm-like o WLC no explica completamente la relación entre fuerza y extensión porque, a estas escalas de longitud, es necesario tener en cuenta los efectos del tamaño finito y la extensión a fuerza cero derivada de las restricciones en los límites. Por lo tanto, las mediciones de fuerza-extensión deben ajustarse utilizando un modelo WLC modificado, que incluye una longitud de persistencia efectiva y una extensión a fuerza cero como parámetros de ajuste, descritos con mayor detalle en los materiales suplementarios.

Para grandes longitudes de contorno de D-S-D-N-A, la longitud de persistencia efectiva es simplemente la longitud de persistencia nominal de aproximadamente 50 nanómetros, y la extensión en ausencia de fuerza puede despreciarse en los ajustes modificados del modelo WLC. Las longitudes de persistencia efectivas son de 35 nanómetros para el ADN de 1.298 pares de bases y de 25 nanómetros para el ADN de 247 pares de bases tras su desarrollo. Este método allanó el camino para una serie de mediciones nanomecánicas sobre ADN y complejos de ADN con proteínas, incluyendo un estudio de la cinética de formación y ruptura de bucles de ADN mediados por proteínas reguladoras.