Selección y aislamiento de las colonias de humanos células madre pluripotentes inducidas a partir de fibroblastos adultos Reprogramado

En este artículo de video, los fibroblastos adultos humanos se reprograman para generar células madre pluripotentes utilizando vectores retrovirales. En primer lugar, los fibroblastos humanos se transducen con vectores retrovirales que codifican los factores de transcripción. T tres cuatro, SOX dos, KLF cuatro y cmic.

Los fibroblastos infectados se cultivan en células alimentadoras de embriones de ratón durante 14 a 28 días. Los cultivos resultantes se tiñen con el anticuerpo TRA 180 1 para identificar colonias de células reprogramadas. A continuación, las colonias positivas se transfieren a las placas que contienen MEF para su expansión.

La tinción inmunocitoquímica confirma la expresión de marcadores de pluripotencia y el establecimiento de líneas de células madre pluripotentes. A continuación, se deben realizar estudios adicionales para caracterizar aún más las líneas. En general, los individuos nuevos en la programación de células somáticas y los cultivos de células madre pluripotentes inducidas por humanos tendrán dificultades porque es difícil identificar las colonias correctas de IPSC.

La demostración del procedimiento estará a cargo de la Dra. Sula Pollak, postdoctora o becaria de mi laboratorio. Comience este procedimiento colocando células Phoenix AM FO a una densidad de aproximadamente siete a 8 millones de células por placa de 10 centímetros en 10 mililitros de DMEM con alto contenido de glucosa en la incubadora y cultive durante la noche. Al día siguiente, prepare mezclas de transfección que consisten en 12 microgramos de un vector que codifica T, tres, cuatro SOX, dos klf, cuatro cmic o GFP gen y 35 microlitros, pocos genes seis, en un volumen total de 500 microlitros de DMEM de alta glucosa libre en suero con L glutamina.

Incubar las mezclas durante 20 minutos. Luego, para transfectar las células fénix, pipetee suavemente los complejos de ADN en las placas que contienen células fénix, que deben tener un 70 a 80% de confluentes. Incubar las células a 37 grados centígrados después de seis a ocho horas.

Aspire el medio y reemplácelo con ocho mililitros de DMEM de alta glucosa con antibióticos. A continuación, devuelva las placas a la incubadora durante 12 horas después de la incubación. Utilice una pipeta para aspirar y recoger el medio que contiene el virus.

Luego reemplace el medio y repita este proceso cada 12 horas hasta que el medio se haya recogido cuatro veces. Guarde el medio a cuatro grados centígrados. Una vez que se haya recolectado todo el medio, combine todas las porciones, luego viértalo a través de un filtro superior de tubo de 0.45 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros para eliminar las células desprendidas y los desechos.

El medio filtrado, que contiene partículas virales, puede conservarse en el refrigerador durante dos semanas sin perder actividad infecciosa. No se recomienda la congelación. El día antes del procedimiento de transducción, descongele el stock congelado de fibroblastos humanos adultos y agregue una vez 10 a la quinta célula por cada pocillo de placas recubiertas de gelatina de seis pocillos.

Al día siguiente, en un tubo cónico de 50 mililitros, combine 3,5 mililitros de T cuatro SOX dos, klf cuatro y medio viral cmic, y agregue poly brain a una concentración final de seis microgramos por litro como control. Prepare un mililitro de medio viral GFP, tres mililitros de medio de cultivo, medio y policerebro a una concentración final de seis microgramos por mililitro. Aspire el medio de la placa que contiene fibroblastos humanos.

A continuación, añada cuatro mililitros de medio viral mezclado o medio de control, centrifugar las placas a 1600 G durante una hora a 20 grados centígrados después de la centrifugación. Incubar las placas durante aproximadamente 12 horas. A continuación, sustituya el medio viral por un medio de cultivo de fibroblastos e incube durante otras 12 horas.

Repita este proceso desde la infección hasta el cultivo en medio fibroblástico, dos veces más después de la última infección. Cultivo de los fibroblastos en DMEM durante 48 horas. A continuación, compruebe la eficacia de la infección de las transducciones paralelas con el medio retroviral GFP.

A continuación, iniciar la reprogramación de células somáticas a pluripotentes. Los fibroblastos infectados se cultivan en medio de células madre embrionarias humanas o medio HES de semilla de ratón embrionario, fibroblastos o MEF a una densidad de aproximadamente dos veces 10 a la quinta célula por pocillo de la gelatina tratada. Placa de seis pocillos en el medio de crecimiento de fibroblastos al día siguiente.

Dividir los fibroblastos humanos infectados utilizando 0,05% de tripsina EDTA y sembrarlos a una densidad de aproximadamente 1,2 veces 10 por cuarto pocillo en el medio de crecimiento de fibroblastos. Al día siguiente. Reemplace el medio con un medio HES que contenga butirato de sodio de 0.5 milimolares durante los primeros siete días de la reprogramación.

Cambie el medio a diario. Reemplace los medios con medios HES sin butirato de sodio y continúe con la reprogramación durante siete a 21 días adicionales. Cambie el medio diariamente todos los días.

Compruebe si hay cambios morfológicos en las células transducidas. Las colonias de células comenzarán a emerger aproximadamente 10 días después de transferir los fibroblastos transducidos a las células alimentadoras. Las colonias que contienen las células reprogramadas ahora se conocen como células madre pluripotentes inducidas humanas o células IPS humanas.

Las colonias de células IPS humanas estarán listas para ser aisladas en 14 a 28 días después de sembrarlas en las celdas alimentadoras de MEF. En esta etapa, las colonias de células IPS humanas pueden transferirse a placas que contengan MEF o a placas cubiertas de matrigel aquí. La transferencia a las placas contenedoras de MEF se demuestra un día antes de recoger las colonias de células IPS humanas Siembra placas de 24 pocillos que contienen células alimentadoras de MEF radiadas con rayos gamma en un medio de crecimiento de fibroblastos.

Incubar a 37 grados centígrados con 5% de CO2 el día en que se recogerán las colonias de células IPS humanas. Aspire el medio de crecimiento de fibroblastos de los ME Fs y enjuáguelos con PBS para eliminar cualquier rastro de FBS. A continuación, agregue 0,5 mililitros de célula madre embrionaria humana o medio HES que contenga 10 micromolares inhibidor de roca Y 2 7 6 3 2 a cada pocillo A continuación, utilizando un microscopio montado en una campana de flujo laminar, examine las placas de reprogramación para la formación de colonias de células IPS humanas.

Si es necesario, extraiga los fibroblastos que rodean las colonias de células IPS humanas con una aguja de calibre 21. Enjuague las placas con PBS y agregue medio HES fresco que contenga el anticuerpo específico TRA 180 1 stain alive. Regrese las celdas a la incubadora a 37 grados centígrados con 5% de CO2.

Después de 30 minutos, reemplace el medio con medio HES fresco suplementado con 10 inhibidores de rocas micromolares. A continuación, observa las colonias bajo el microscopio fluorescente. Marque TRA de una a 81 colonias positivas.

Usando un marcador de objetivo con una aguja de calibre 21. Corta las colonias de células IPS humanas positivas TRA 180 1 en varios trozos pequeños. A continuación, utilizando una pipeta automática, transfiera fragmentos de colonias de células IPS humanas a pocillos individuales de la placa de 24 pocillos con ME Fs. Evite transferir células que no sean IPS.

Coloque las placas en la incubadora y permita que las colonias de células IPS humanas se adhieran durante 24 a 36 horas y cambie de medio diariamente. Las colonias de células IPS humanas con una morfología correcta similar a la HE serán visibles 48 horas después de la transferencia inicial a una placa de 24 pocillos, pasando manualmente colonias de células IPS humanas cada seis a ocho días cortándolas con una placa de aguja de calibre 21. Expansión de cultivos en una placa de 12 pocillos y posteriormente en una placa de seis pocillos después de la expansión clonal.

Y el establecimiento de las líneas celulares IPS humanas analiza la expresión de los marcadores de pluripotencia TRA uno, 60, SSEA, cuatro, T, tres, cuatro, SOX, dos y nanog utilizando inmunoquímica una vez que se han establecido las líneas. La caracterización detallada puede implicar in vitro e in vivo. Análisis de diferenciación, análisis de cariotipos, análisis de estudios de metilación de silenciamiento transgénico y estudios de expresión génica.

La transducción eficiente con un medio que contiene retrovirus es fundamental para una reprogramación exitosa para determinar la eficacia de la transducción viral. Se visualizaron fibroblastos adultos humanos derivados de un paciente con ataxia de Friedrichs después de dos infecciones consecutivas con medio retroviral GFP, cuando los fibroblastos se infectaron por incubación simple con medio viral, se transducen menos del 20% de las células. Sin embargo, cuando la adición de los medios retrovirales GFP fue seguida inmediatamente por la eficiencia de la transducción, aumentó drásticamente.

Aquí, más del 80% de las células se transducen para llevar a cabo una caracterización inicial de las colonias de células IPS humanas aisladas. La expresión de los marcadores de pluripotencia característicos de las células madre embrionarias humanas se evaluó mediante inmunoquímica, como se muestra aquí. Las colonias aisladas de células IPS humanas fueron positivas para los marcadores de pluripotencia.

T tres, cuatro, SOX, dos nano, SSEA, cuatro y TRA, uno, 60 ADN. La tinción de Cos con DPI que se muestra en los paneles superiores se detecta tanto en las colonias de células IPS humanas como en las células alimentadoras. Estos resultados demuestran que las células IPS humanas obtenidas utilizando este protocolo de reprogramación expresan marcadores de pluripotencia apropiados característicos para las células madre pluripotentes humanas indiferenciadas.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo reprogramar con éxito fibroblastos humanos en células madre pluripotentes utilizando la transacción retroviral identificada correctamente, inducir colonias de células madre pluripotentes humanas y realizar la caracterización inicial de las HI PC.