Filtrado de contenido de alta en las enfermedades neurodegenerativas

El objetivo general del siguiente experimento consiste en utilizar ensayos de alto contenido en modelos celulares de enfermedades para cuantificar las vías afectadas en enfermedades neurodegenerativas. Para lograrlo, se introduce un modelo celular del fenotipo de la enfermedad en el sistema automatizado de cultivo celular, y las células se incuban hasta alcanzar el número celular requerido. A continuación, las células se dividen, se cuentan y se distribuyen en placas de 96 pocillos que contienen lentivirus que expresan diversos ARNh dirigidos contra SH.

Después de seis días de diferenciación celular, las células se recuperan del sistema para inmunotinción e imágenes de alto contenido. Finalmente, las imágenes se analizan mediante una variedad de algoritmos de análisis para cuantificar características relacionadas con la salud celular, el crecimiento neuronal y la función mitocondrial.

Los resultados también se analizan mediante un análisis de dos vías en Novas para identificar efectos de interacción significativos. Este método puede acelerar la obtención de respuestas a preguntas clave sobre la función de los genes relacionados con enfermedades y las vías en las que funcionan en conjunto. Esto conducirá entonces a una mejor comprensión de los mecanismos patógenos implicados en las enfermedades neurodegenerativas.

Para comenzar el proceso de cultivo celular, prepare el sistema automatizado de cultivo celular para la introducción de placas de cultivo celular. Cargue los consumibles, como puntas de pipeta, placas de cultivo celular y placas de ensayo, en el sistema. Asegúrese también manualmente de que haya suficiente medio de cultivo celular, PBS y tripsina en el sistema.

Siembre dos placas de bandeja omni con dos veces 10 a la seis células por placa de la línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y. Mantenga las células en medio óptimo con 10% de suero bovino fetal (FBS) y coloque las placas en el estante de entrada del robot de cultivo celular. Mediante la interfaz gráfica de usuario o GUI, seleccione el protocolo de cultivo celular adherente A y ajuste los archivos de parámetros específicos de la línea celular adherente A para que el umbral de confluencia se establezca en 70%.

El tiempo total de acondicionamiento es de dos minutos. Instruya al sistema para que prepare nuevas placas tipo omni con un número de células de asiento de dos veces 10 a la sexta células por placa. Instruya al sistema para que prepare placas de ensayo por cada placa tipo omni con un total de 5.000 células por pocillo e incube las células a 37 grados Celsius y 5 %CO2.

Los siguientes pasos están involucrados en este protocolo de cultivo celular de adherencia. Las placas se incuban y se toman imágenes hasta que las células alcancen el umbral predeterminado de confluencia. Si las células no alcanzan el umbral de confluencia dentro de cinco lecturas, se retiran las placas del sistema.

Una vez que las células alcanzan el umbral de confluencia definido por el usuario, se lavan, se tripsinizan y se cuentan. Se añade un número predeterminado de células a nuevas placas omni trait, y si hay un número suficiente de células, se transporta a la plataforma un número específico de placas de ensayo y se dispensa un número definido de células en cada pocillo. Finalmente, las placas de ensayo pueden ser directamente observadas mediante el microscopio integrado o extraídas del sistema para su posterior procesamiento, iniciando así el procedimiento de producción de virus.

Inocular medio LB que contiene ampicilina con stocks glicerolados bacterianos que contienen los vectores HRNA y cultivar durante la noche; al día siguiente, centrifugar las células y eliminar el sobrenadante; extraer los plásmidos utilizando el sistema de purificación de plásmidos Wizard Magnus. El ADN plasmídico final que contiene E EIT se recoge en placas de 96 pocillos. El lentivirus S-H-R-N-A se produce utilizando el consorcio RNAi, mediante una producción lentiviral en placas de 96 pocillos; todos los experimentos deben realizarse en un laboratorio de seguridad ML dos o BSL dos LA, y todos los reactivos y materiales desechables utilizados deben descontaminarse con cloro al 30 % después de su uso.

El procedimiento para la producción de lentivirus no se demostrará en este video, pero requiere cuatro días y consta de los siguientes pasos. Primero, las células empaquetadoras se siembran el día cero en la tarde siguiente. El día uno, las células empaquetadoras se transfectan con tres plásmidos de lentivirus 18 horas después de la transfección.

El día dos, el medio se reemplaza por medio fresco con alta concentración de BSA o suero. 24 horas después del cambio de medio. El día tres, se cosecha el virus y el medio se vuelve a reemplazar con medio fresco con alta concentración de BSA o suero.

Finalmente, 24 horas después de la primera cosecha del virus, el día cuatro, se cosecha nuevamente el virus y se descartan las células empaquetadoras para calcular la multiplicidad de infección o MOI del lentivirus. Transduzca células SHSY5Y con diluciones seriadas del virus e incube las células a 37 grados Celsius. Setenta y dos horas posteriores a la transducción, visualice la expresión de GFP mediante microscopía y determine el porcentaje de células positivas para GFP. Plaque el lentivirus S-H-R-N-A en placas de ensayo con un MOI de tres. Tras sembrar el lentivirus SH-RNA en las placas de ensayo, cargue las placas en el sistema automatizado de cultivo celular para la transducción lentiviral.

Después de 24 horas, el medio en las placas de ensayo se cambiará a medio óptimo que contiene 0,5 % de FBS y 0,1 micromolar de ácido retinoico. Para iniciar el proceso de diferenciación, continúe la incubación de las placas de ensayo en el medio de diferenciación durante cinco días para asegurar la reducción máxima de la expresión del gen diana; al quinto día, agregue H2O2 a la mitad de las placas de ensayo durante 24 horas para estimular la translocación de la proteína DJ1 a las mitocondrias. Al sexto día, agregue MIT tracker a las células a una concentración final de 200 nanomolares por pozo e incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos.

Después de esto, las placas pueden transportarse al sistema de imagen de alto contenido o HC para la adquisición de imágenes. Alternativamente, las placas pueden extraerse del sistema para su procesamiento adicional, como tinción inmunohistoquímica. Para la adquisición de imágenes de alto contenido, se capturarán un total de 30 campos por pocillo utilizando el objetivo de 20 x, visualizando DJ uno con el conjunto de filtros fitzy, mitocondrias con el conjunto de filtros trixy, beta tres tubulina con el conjunto de filtros S cinco y núcleos con el conjunto de filtros UV.

Este es un ejemplo de imágenes compuestas de células obtenidas mediante imágenes de alto contenido. En el panel A se muestran tres células no tratadas y en el panel B se muestran células tratadas con H2O dos. DJ uno está marcado en verde, las mitocondrias en rojo y los núcleos en azul. Para determinar el coeficiente de superposición promedio entre DJ uno y las mitocondrias, analice las imágenes utilizando la aplicación biológica de colocalización.

Defina las regiones de interés. ROI de la siguiente manera: ROIA, núcleo, figura cuatro A y E; y ROIB, mitocondrias, figura cuatro B y F. Excluya ROIA de ROIB. Para asegurar el análisis exclusivo del citoplasma, defina las mitocondrias como la región diana uno y DJ uno como la región diana dos, figura cuatro C y G. Analice las imágenes utilizando la aplicación bio de análisis compartimental com para determinar la intensidad media de la señal del marcador MIT dentro de las mitocondrias.

Figura cuatro B y F para trazar las longitudes promedio de las neuritas a partir de la tinción de beta tres tubulina. Analice las imágenes utilizando la aplicación bioinformática de perfilado neuronal, figura cuatro D y H, en las placas de imágenes siguientes usando el lector confocal automatizado opera lx.

Visualice las mitocondrias con el láser de 561 nanómetros y los núcleos con la imagen de excitación UV. Un total de 30 campos por pocillo utilizando la lente objetivo de 60x con inmersión en agua. Finalmente, analice las imágenes utilizando el algoritmo de características de textura de borde de punto o SER.

El filtro de cresta SER transmite la intensidad en píxeles que forman patrones similares a crestas. Cuanto más fragmentadas estén las mitocondrias, mayor será la puntuación de cresta SER. En este video, se utilizaron ensayos de alto contenido o ensayos HC para identificar moduladores de la proteína DJ-1A, cuya pérdida provoca parkinsonismo autosómico recesivo.

Este primer resultado representativo ilustra una interacción epistática con DJ uno. El gráfico de barras de la izquierda muestra unidades de fluorescencia normalizadas y las imágenes de la derecha muestran células SHSY cinco Y marcadas en rojo con mito tracker para la cuantificación de la viabilidad celular.

Se observó que la inhibición de DJ uno en células expuestas a la toxina provocó una mayor pérdida de viabilidad celular en comparación con las células infectadas con lentivirus aleatorio. La inhibición del gen diana A tuvo un efecto similar al observado en células con inhibición de DJ uno. Sin embargo, la inhibición tanto de DJ uno como del gen diana A provocó una pérdida significativamente mayor de viabilidad celular que la pérdida de cualquiera de los genes por separado, lo que sugiere una interacción epistática entre DJ uno y el gen diana A. Este siguiente ejemplo corresponde a un gen que regula la translocación de DJ uno.

El gráfico de barras muestra el coeficiente de superposición normalizado entre DJ uno y las mitocondrias, lo que refleja la translocación de DJ uno desde el citoplasma hacia las mitocondrias. Los paneles A a D son imágenes de células SHSY cinco Y marcadas en verde para DJ uno, en rojo para mitocondrias y en azul para núcleos. Cuando las células se exponen a una toxina, DJ uno se transloca desde el citoplasma hacia las mitocondrias, lo cual se cuantifica mediante un coeficiente de superposición mayor entre DJ uno y las mitocondrias.

En células en las que el gen diana B ha sido silenciado, menos DJ uno se transloca a las mitocondrias cuando las células se exponen a la toxina, lo que sugiere que el gen diana B está implicado en el transporte de DJ uno hacia las mitocondrias. Aquí se muestra un ejemplo de un gen implicado en el crecimiento neuronal. Las longitudes normalizadas de las neuritas se muestran en el gráfico de barras, y las células utilizadas para la cuantificación de las longitudes de las neuritas se observan en las imágenes, con beta tres tubulina en verde y núcleos en azul.

La inhibición del gen diana C en células SHSY cinco Y de tipo salvaje provoca un aumento significativo en la longitud de las neuritas en comparación con las células infectadas con lentivirus que expresan ARNsh aleatorio. Este efecto se pierde en las células incubadas con toxina. Finalmente, estos resultados muestran un ejemplo de un gen implicado en la morfología mitocondrial.

Los valores promedio de la segmentación de las crestas SER mitocondriales en células SHSY cinco Y infectadas con ARNsc o ARN-A dirigido al gen D se muestran en la gráfica. La imagen A y la imagen C son imágenes compuestas de células SHSY cinco Y infectadas con ARNsc o ARN-A dirigido al gen D, respectivamente. Las mitocondrias están coloreadas en rojo, mientras que los núcleos están coloreados en azul.

Las imágenes B y D son visualizaciones de la cuantificación de las crestas del RER observadas aquí. La infección de células SHSY cinco Y de tipo salvaje con HRNA que diana el gen D provoca un aumento en el valor de segmentación de las crestas mitocondriales del RER en comparación con las células infectadas con lentivirus aleatorizado. Este enfoque puede allanar el camino para que los investigadores en el campo de la neurodegeneración exploren y anoten las vías implicadas en la patogénesis de la enfermedad de manera oportuna.

Esto conducirá entonces a mejores objetivos para el desarrollo terapéutico.