Name: Filtrado de contenido de alta en las enfermedades neurodegenerativas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Aprenda a utilizar ensayos de alto contenido en modelos celulares para cuantificar vías afectadas en enfermedades neurodegenerativas. Este método automatizado permite analizar el crecimiento neuronal y la función mitocondrial con precisión.

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Agradecemos a los programadores de Hamilton y especialistas de apoyo y Blaas Eva de asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por dos Ayudas a la inversión del Nuevo Orden Mundial (911-07-031 y 40-00506-98-10011), El Prinses Beatriz Fonds Wetenschapsprijs 2009 y el Campus de Neurociencias de Amsterdam, SJ con el apoyo de Ti-Pharma: T5-207.

1. Automatizado de células adherentes proceso de cultivo (Figura 1) 20 <ol><li> Prepare el sistema de cultivo de células automatizado para la entrada de las placas de cultivo celular. Consumibles de carga (por ejemplo, puntas de pipeta, placas de cultivo celular, placas de ensayo) en el sistema utilizando la interfaz gráfica de usuario (GUI). Asegúrese de que hay suficientes medios de cultivo celular, tampón fosfato salino (PBS) y tripsina en el sistema robótico. </li><li> Manual de la semilla dos placas omnitray con 2 x 10 6 células por placa, de la línea de neuroblastoma SH-SY5Y células. Mantener las células en Opti-MEM con 10% de suero fetal bovino (SFB). Poner los platos en el robot de cultivo celular mediante la GUI. Las células se incubaron a 37 º C y 5% CO 2. </li><li> Elegir qué protocolo de cultivo celular debe iniciarse 20. Uno puede elegir entre un proceso de cultivo de células adherentes 22, el cultivo y la expansión de células madre embrionarias (ES) las células en células alimentadoras del ratón 23 o el cultivo de la suspensión cells 22. </li><li> Seleccione el protocolo de cultivo de células adherentes (Figura 1) y asegurar la adherencia archivos de la línea celular específica de parámetros se ajustan de manera que el umbral de confluencia (el área de la placa omnitray que contiene las células) se ha fijado en 70%. Establecer el tiempo total de tripsinización a dos minutos. </li><li> Instruir al robot para preparar nuevos platos omnitray, con un número de células de siembra de 2 x 10 6 células por placa. </li><li> Platos de entrada omnitray en el sistema de cultivo celular utilizando el protocolo automatizado de cultivo de células adherentes (Figura 1). Este protocolo incluye los siguientes pasos: las placas se incuban y la imagen hasta llegar al umbral de confluencia pre-definidos. Si las células no alcanzan el umbral de confluencia dentro de los 5 lecturas, las placas se eliminan del sistema. Al llegar a la confluencia del umbral definido por el usuario, se lavan las células, y contó con tripsina. Un determinado número de células se añaden a las placas de omnitray nuevo y si hay un número suficiente de células, una insensible especificadoer de placas de ensayo son transportados a la cubierta y un número determinado de células en cada pocillo. Las placas de ensayo puede ser fotografiado directamente con el microscopio integrado o salida del sistema para su posterior procesamiento. </li><li> Indicar al sistema que preparar 4 placas de ensayo por placa omnitray, con un total de 5.000 células por pocillo. </li></ol> 2. ARNhc la producción de virus y de las planchas en las placas de ensayo (Tiempo: 6 días) <ol><li> Crecen las poblaciones bacterianas de glicerol que contiene los vectores shRNA (Open Biosystems, TRC1) durante la noche en 2 ml de los medios de comunicación medio Luria-Bertani conteniendo 100 mg / ml de ampicilina (Sigma-Aldrich). </li><li> Extracto de plásmidos siguiendo el protocolo del fabricante (Promega Asistente MagneSil TFX). </li><li> Producir virus con el Consorcio de RNAi de alto rendimiento de la producción lentivirales (96 pocillos) el protocolo 24. Trabajar con lentivirus es relativamente seguro, porque las partículas de virus para la transducción de la replicación son deficientes y de divisiónestrategias gen de embalaje se utilizan para su producción. Sin embargo, cuando se trabaja con lentivirus, los procedimientos de bioseguridad adicionales son necesarias para reducir al mínimo el riesgo para uno mismo y los demás 25. Todos los experimentos deben realizarse en un laboratorio de nivel MLII o BSL2 seguridad. Todos los plásticos (pipetas, platos de plástico, los medios de comunicación) que han estado en contacto con partículas de lentivirus se incuban con cloro durante 24 horas antes de su eliminación. </li><li> Calcular la multiplicidad de infección (MOI) de los lentivirus, determinando el porcentaje de células GFP positivos con el plásmido GFP pLKO.1 (Sigma-Aldrich). </li><li> Placa de lentivirus en las placas de ensayo, con una MOI de 3. </li></ol> 3. Transducción de lentivirus y la diferenciación neuronal de células SH-SY5Y (Tiempo: 6 días) <ol><li> Las células se añaden a las placas de ensayo (véase el paso 1.7). De carga placas de ensayo que contienen lentivirus ARNhc en el sistema de cultivo de células automatizado. </li><li> Después de 24 horas, los medios de comunicación en laplacas de ensayo se cambiará a Opti-MEM que contiene 0,5% de SFB y 0,1 M de ácido retinoico para iniciar el proceso de diferenciación. La diferenciación de las células SH-SY5Y permite la visualización de las estructuras neuríticas y sincroniza la división celular. </li><li> Continuar la incubación de las placas de ensayo en los medios de diferenciación, durante 5 días. Esto asegura la máxima caída de la expresión del gen diana. </li><li> El día 5, se añaden 50 mM H 2 O 2 a la mitad de las placas de ensayo durante 24 horas para estimular la translocación de DJ1 a la mitocondria. </li><li> El día 6, añadir CmxROS Mitotracker (Invitrogen) a las células a una concentración final de 200 nM por pocillo y se incuba a 37 ° C durante 30 minutos. </li><li> Se puede indicar al sistema que las placas de imagen directamente usando la cámara de HC o placas se pueden exportar desde el sistema para su posterior procesamiento. </li></ol> 4. Inmunotinción automatizado de placas de ensayo (Tiempo: 2 días) La calidad de imagen es paramount para la realización de una sensible y fiable HCS. El daño a la monocapa celular, debido a pipeteo inexacto puede conducir a mala calidad de imagen y resultados irreproducibles. Con el fin de minimizar el daño de la capa celular, la inmunotinción se realizó utilizando una estación robótica. El procedimiento es similar a uno que ha sido descrito previamente 26, pero se ha personalizado para aumentar el rendimiento y reducir el uso de consumibles. <ol><li> Fijar las células con 100 l de paraformaldehído al 4% de pre-calentado a 37 ° C. Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lavar las células con 200 l de PBS durante 5 minutos, 3 veces. </li><li> Incubar las placas de ensayo con 200 l de PBS que contenía 0,1% de Triton (PBST) durante 10 minutos. </li><li> Lavar las células con 200 l de PBS durante 5 minutos, 3 veces. </li><li> Incubar las placas de ensayo con 200 l de buffer de bloque (PBST con FBS al 5%) durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Lavar las células con 200 l de PBS durante 5 minutos, 3 veces. </li><li> Incubar con el ejerdebido anticuerpos primarios noche a 4 ° C: <ol><li> Cabra DJ1 N20 (Santa Cruz, 5 mg / ml) </li><li> Conejo β-tubulina III (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) </li></ol></li><li> Al día siguiente, lavar las células con 200 l de PBS durante 5 minutos, 3 veces. </li><li> Incubar las placas de ensayo con los siguientes anticuerpos secundarios de 1 hora a temperatura ambiente: <ol><li> AlexaFluor 488 burro anti-cabra (Invitrogen, 2 mg / ml) </li><li> AlexaFluor 647 cabra anti-conejo (Invitrogen, 2 mg / ml </li></ol></li><li> Lavar las células con 200 l de PBS durante 5 minutos, 3 veces. </li><li> Las células se incuban con Hoechst (Invitrogen, 1 mg / ml) durante 10 minutos. </li><li> Lavar las células con 200 l de PBS durante 5 minutos, 3 veces. </li><li> Las placas se almacenan a 4 ° C hasta que se pueden obtener imágenes. </li></ol> 5. Imagen de alto contenido de adquisición y análisis de imágenes (Tiempo: 5 días) <ol><li> Imagen de un total de 30 campos por bien con la lente del objetivo de 20x. Visualizar DJ1 con la FITC conjunto de filtros, la mitocondria con el conjunto de filtros TRITC, β-tubulina III con el conjunto de filtros Cy5 y los núcleos utilizando el conjunto de filtro UV (Figura 3). </li><li> Analizará las imágenes utilizando el Bioapplication análisis compartimental (Cellomics, ThermoFisher) para determinar la intensidad media de la señal de Mitotracker dentro de las mitocondrias. (Figura 4 B, F). </li><li> Para determinar el coeficiente promedio de superposición entre DJ1 y las mitocondrias, analizará las imágenes utilizando el bioapplication colocalización Cellomics (Cellomics, ThermoFisher). Definir regiones de interés (ROI) de la siguiente manera: Un retorno de la inversión - el núcleo (Figura 4 A, E), retorno de la inversión B - las mitocondrias (Figura 4 B, F). Excluir a un retorno de la inversión de retorno de la inversión B para asegurar un análisis de sólo el citoplasma. Definir la mitocondria como región objetivo I y DJ1 como objetivo la II Región (Figura 4 C, G). </li><li> Analizará las imágenes utilizando el bioapplication perfiles neuronales (Cellomics, ThermoFisher) para rastrear la longitud media de las neuritas de la tinción de la tubulina β-III (Figura4D, H). </li><li> Placas de imagen con la Opera LX automático confocal lector (Perkin-Elmer). Imagen de un total de 30 campos por bien con la lente del objetivo 60x con inmersión en agua. Visualizar las mitocondrias con el láser de 561 nm y los núcleos de excitación UV. </li><li> Analizará las imágenes utilizando el Spot-Edge-Ridge (SER), con textura algoritmo características. El filtro de SER-Ridge transmite la intensidad de píxeles que forman como patrones de canto. Cuanto más fragmentado de la mitocondria, mayor será la puntuación SER-Ridge (Figura 8). </li></ol> 6. La normalización de datos y análisis <ol><li> Importar los datos desde el software de análisis de imagen en el BioConductor CellHTS2 paquete para el entorno de software R (R versión 2.11.1, la versión BioConductor 2.6). </li><li> Logaritmo de base (2) transformar los datos antes de la placa por medio de normalización basado en 27, 28. No aplique el ajuste de variación por placa. </li><li> Para identificar los modificadores del fenotipo, utilizar un ANOVA de dos vías entre los diferent grupos de tratamiento, es decir las células no tratadas infectadas revueltos vs revueltos células tratadas frente a la toxina células diana del gen no tratados frente a las células diana del gen tratado (figuras 5-7). </li></ol> 7. Los resultados representativos Las mutaciones en DJ1 dar lugar a la aparición temprana-recesivo parkinsonismo 21, pero no está claro cómo la pérdida de DJ1 da lugar al fenotipo de la enfermedad. Se sabe que las células deficientes de DJ1 son más susceptibles a la muerte celular oxidativo inducido por el estrés y en respuesta al estrés oxidativo, DJ1 transloca desde el citoplasma a la mitocondria 29, 30. Mediante la construcción de los ensayos de HC para controlar estos fenotipos, podemos identificar los genes que regulan o afectan fenotipos asociados a DJ1. Este enfoque puede ayudar a descifrar los caminos dentro de la cual DJ1 funciones y que podrían estar involucrados en la patogénesis de la enfermedad. Ejemplo de una interacción con epistáticos DJ1 (Figura 5): Derribo de DJ1 en las células expuestascon los resultados de toxinas en una mayor pérdida de la viabilidad celular (BAR-B: imagen-B) en comparación con las células infectadas con revueltos lentivirus (BAR-A: imagen-A). Derribo de un gen diana tiene un efecto similar a la observada en las células con una caída DJ1 (BAR-C: imagen-C). Derribo de dos DJ1 y un gen diana resulta en una pérdida mucho mayor de la viabilidad celular de la pérdida de genes, ya sea solo (BAR-D:-D la imagen). Esto sugiere una interacción entre epistáticos DJ1 y la meta de genes A. Ejemplo de un gen regulador DJ1 translocación (Figura 6): Cuando las células son expuestas a una toxina, DJ1 transloca desde el citoplasma a las mitocondrias, que se cuantifica mediante un coeficiente más elevado solapamiento entre DJ1 y las mitocondrias (BAR-A: A versus imagen BAR-C: la imagen C). En las células B, donde ha sido la meta de genes silenciados, menos DJ1 transloca a la mitocondria en las células son expuestas a la toxina. Esto sugiere que el objetivo B gen está involucrado en el transporte de DJ1 a la mitocondria. (BAR-B: imagen B y D-BAR: la imagen D) Ejemplo de un gen involucrado en consecuencia neuronal (Figura 7): Derribo de C del gen diana en el medio silvestre de tipo SH-SY5Y células da como resultado un aumento significativo de la duración de neuritas (BAR-B: imagen-B) en comparación con las células infectadas por lentivirus que expresan revueltos shRNA (BAR-A: imagen A). Este efecto se pierde en las células incubadas con la toxina (BAR-C y D). Ejemplo de un gen involucrado en la morfología mitocondrial (Figura 8): La infección de tipo salvaje células SH-SY5Y con ARNhc objetivo gen D produce una disminución en el valor de la segmentación mitocondrial SER-Ridge (Figura 8, C y D de la imagen) en comparación con las células infectadas por lentivirus revueltos (Figura 8, A y B de la imagen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig1_lg.jpg"><img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1."></a> Figura 1 Esquema del protocolo automatizado de cultivo de células.: ntent "&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig2_lg.jpg"><img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2."></a> Figura 2 Presentación esquemática del proceso de selección, análisis de imágenes y los métodos estadísticos utilizados durante el proceso de selección:. I) Las células se cultivan hasta que son confluentes y posteriormente sembraron en las placas de ensayo que contiene los lentivirus shRNA. Las células se diferencian durante 5 días y la toxina se añade a las placas durante 24 horas. Las placas de ensayo se emiten desde el sistema y immunostained. La cantidad de tiempo necesario para que cada uno de los procesos se indica entre paréntesis. ii) Los datos se realiza a través una cámara HC (la viabilidad celular, la translocación de proteínas y extensión neuronal) y un sistema automatizado de imágenes confocal (morfología mitocondrial). Los datos son exportados a CellHTS2 paquete en R, base (2) transformación logarítmica y normalizado. ANOVA de dos vías se utiliza para identificar las interacciones significativas entre las diferentes variables. Figura 3. Composiciones de imágenes de células adquirida por HC imágenes. A) Las células no tratadas, B) Las células tratadas con H 2 O 2. DJ1 tiene la etiqueta de color verde, las mitocondrias en rojo y los núcleos en azul. Tinción neuritas no está resaltado. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4."> Figura 4. Cuantificación de varias funciones celulares obtenidos a partir de una HCS. AD) no se trata SH-SY5Y células. EH) H 2 O 2 tratados con las células SH-SY5Y. A, E) Los núcleos de segmentación y definición de retorno de la inversión A, B, F) Identificación y cuantificación de las mitocondrias B, retorno de la inversión, C, G) Identificación de DJ1, Target del canal II, D, G) La identificación y el cálculo de la longitud de las neuritas promedio. Las células cerca de la orilla de la imagen son excluidos del análisis. Imágenes en los recuadros son las imágenes antes del análisis. <imgalt figura src='"/' files></imgalt> Figura 5. La identificación de un gen en epistasis con DJ1 (letras en las barras corresponden a las letras en las imágenes). Imágenes de la A a D son SH-SY5Y células marcadas con Mitotracker CMXRos (rojo) que se utilizó para la cuantificación de la salud celular. <img alt="Figura 6." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig6.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 6."> Figura 6. La identificación de un gen regulador DJ1 translocación (letras en las barras corresponden a las letras en las imágenes). Imágenes de la A a D son SH-SY5Y células marcadas por DJ1 (verde), las mitocondrias (rojo) y núcleos (azul) que se utilizaron para la cuantificación de DJ1 translocación a la mitocondria. <img alt="Figura 7." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig7.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 7."> Figura 7. Identificación de un gen involucrado en consecuencia neuronal (letras en las barras corresponden a las letras en las imágenes). Imágenes de la A a D son SH-SY5Y células marcadas para la β-tubulina III (verde) y núcleos (azul) que se utiliza para la cuantificación de la longitud de las neuritas. <img alt="Figura 8." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig8.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 8."> Figura 8. La identificación de un gen implicado en la regulación de la morfología mitocondrial. Imagen de A y C son imágenes compuestas de SH-SY5Y células infectadas con revuelto ARNhc o un objetivo del shRNA gen D, respectivamente. Las mitocondrias son de color rojo, mientras que los núcleos son de color azul. Imagen B y D son las visualizaciones de la cuantificación SER-Ridge.

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</ol>

No tenemos nada que revelar

Con la disminución de los costos de HT / HC sistemas de selección celular, combinadas con la disponibilidad de potentes herramientas de todo el genoma para modificar la función del gen, HT / HC pantallas son cada vez más comunes en el mundo académico. El enfoque ha sido aplicado con éxito en diversas áreas de investigación tales como la identificación de dianas terapéuticas en el cáncer de 9, 31-33 y 34-36 el desarrollo embrionario e incluso tiene un gran potencial para su aplicación en el desciframiento de las vías implicadas en los trastornos neuropsiquiátricos 37,38. Sin embargo la aplicación de este sistema requiere una importante inversión de tiempo y esfuerzo con la optimización de procesos a menudo tomar un mínimo de 6 meses. Todos los pasos, como los tiempos de tripsinización, las velocidades de pipeteado y densidades de siembra deben ajustarse, para asegurar que las células están sanas y crecen constantemente. Prevención de la contaminación bacteriana es uno de los retos más difíciles que enfrenta el cultivo de células automatizado con los protocolos de limpieza semanal en combination con lavado constante de todas las líneas de orientación líquido con etanol al 70% que sea necesaria para los cultivos libres de contaminación. También será necesario mejorar la robótica, para que otros instrumentos, como microscopios confocal de alta resolución y -80 ° C congeladores para el almacenamiento de compuestos pueden ser integrados. También hay limitaciones que deben ser abordados para mejorar la velocidad sensible, y la utilidad de este método para estudiar las redes de genes e identificar los genes implicados en las vías patógenas molecular. Para llevar a cabo una pantalla de HT / HC y asegurar que los datos fiables se recogen varios aspectos que deben optimizarse. En primer lugar, la fiabilidad de la medición es de suma importancia y depende de la solidez y la sensibilidad del ensayo. Por ejemplo, los ensayos descritos anteriormente son adecuados para pantallas más pequeñas, pero son difíciles de implementar en una escala amplia del genoma, debido a los pasos de procesamiento número requerido antes de la adquisición de imágenes.Por lo tanto, habría que construir líneas celulares estables que expresan el gen reportero, lo que permitiría obtener imágenes directas y conducir a una variación disminuido debido a la reducción del número de pasos de procesamiento. En la actualidad, el diseño de un ensayo que describe con precisión y fiabilidad cuantifica un fenotipo de interés es un importante cuello de botella en el proceso de selección de HC. Muchas pantallas se llevan a cabo en células de mamíferos utilizando diferentes bibliotecas de RNAi, que sufren de los efectos fuera del objetivo, la eficacia limitada de silenciamiento génico y la cobertura del genoma incompleto. Así, las bibliotecas deben ser más específicas, potentes y tienen una mejor cobertura. Se están realizando esfuerzos para crear tales se espera que esos esfuerzos mejorarán la reproducibilidad de HT / HC SCRE<html> en hits. Una de las limitaciones de muchas pantallas de gran escala basada en células es que se llevan a cabo en células de neuroblastoma, ya que puede ser manipulada genéticamente y se cultivan para un gran número con relativa facilidad. Sin embargo, la relevancia de los &quot;hits&quot; identificados en el ex modelos in vivo de cultivo celular para la función in vivo es cuestionable, especialmente porque el cerebro se compone de tipos de células altamente especializadas que forman una red densa y compleja de conexiones sinápticas a funcionar como una unidad altamente integrada. Como consecuencia de ello, es común que llega a identificarse con el método de detección se ha descrito anteriormente, se validan en las pantallas secundarias mediante técnicas adicionales y en los modelos más fisiológicos relevantes 39. Para mejorar la traducción de accesos identificados durante HCS, los modelos más representativos y sofisticados, tales como células primarias y células diferenciadas, madre o de los sistemas de co-cultivo deben ser desarrollados y adaptados para HT / HC enfoques. ntent &quot;&gt; Con una combinación de cultivo de células automatizado y HC imágenes un rápido puede tener nuevas ideas en función de cómo las neuronas y determinar las vías que son importantes para el desarrollo de la enfermedad. La combinación de HCS / HTS de datos con información generada desde otros enfoques&quot; ómicas &quot;, que se entonces sería posible construir una visión de la biología de sistemas enfermedades del cerebro, lo que facilita el desarrollo terapéutico.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> AI.CELLHOST </td><td> HAMILTON </td><td> <a href="http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/">http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/</a> </td></tr><tr><td> OPTI-MEM </td><td> INVITROGEN </td><td> 31985-054 </td></tr><tr><td> Ácido retinoico </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> OMNITRAY PLACAS </td><td> NUNC </td><td> 465219 </td></tr><tr><td> 96 placas de cultivo BIEN </td><td> GRENIER </td><td> 655086 </td></tr><tr><td> DJ1 N20 ANTICUERPOS </td><td> SANTA CRUZ </td><td> SC27004 </td></tr><tr><td> BETA-III tubulina anticuerpo </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> T3952 </td></tr><tr><td> CMXROS MitoTracker </td><td> INVITROGEN </td><td> M-7512 </td></tr><tr><td> Hoechst-33342 </td><td> INVITROGEN </td><td> H1399 </td></tr><tr><td> PERÓXIDO DE HIDRÓGENO </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> 216763-100ML </td></tr><tr><td> TRIPSINA </td><td> INVITROGEN </td><td> 25050014 </td></tr><tr><td> Fosfato de Dulbecco solución salina tamponada </td><td> INVITROGEN </td><td> 14190086 </td></tr><tr><td> PROMEGA WIZARD MagneSil TFX </td><td> PROMEGA </td><td> A2380 </td></tr><tr><td> ARNhc CLONES </td><td> Open Biosystems </td><td> <a href="http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/TRCLibraryDetails/">http://www.openbiosystems</a>.com / RNAi / shRNALibraries / TRCLibraryDetails / </td></tr><tr><td> CELLOMICS BIOAPPLICATIONS </td><td> THERMO-FISHER </td><td> <a href="http://www.thermo.com/hcs">http://www.thermo.com/hcs</a> </td></tr></tbody></table>

filtrado de contenido de alta en las enfermedades neurodegenerativas

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

La anotación funcional de los genomas, la construcción de las redes moleculares y la identificación de nuevos objetivos farmacológicos, son retos importantes que deben abordarse como un asunto de gran urgencia 4.1. Múltiples enfoques complementarios &quot;ómicas&quot; han dado pistas sobre los factores de riesgo genéticos y mecanismos patogénicos subyacentes numerosas enfermedades neurodegenerativas, pero la mayoría de los resultados aún requieren validación funcional 5. Por ejemplo, un reciente estudio del genoma de asociación amplia de la enfermedad de Parkinson (EP), identificado loci muchos de los nuevos factores de riesgo de la enfermedad, pero la variante causal subyacente (s) o mecanismo patogénico no se conoce 6, 7. A medida que cada región asociada puede contener varios genes, la evaluación funcional de cada uno de los genes en los fenotipos asociados con la enfermedad, utilizando las técnicas tradicionales de la biología celular sería demasiado larga. También hay una necesidad de entender las redes moleculares que vinculanmutaciones genéticas que causan los fenotipos. Se espera que los fenotipos de la enfermedad son el resultado de múltiples interacciones que se han interrumpido. La reconstrucción de estas redes con los métodos tradicionales molecular llevaría mucho tiempo. Por otra parte, las predicciones de la red de estudios independientes de los componentes individuales, el enfoque reduccionista, es probable que subestimar la complejidad de la red 8. Esta subestimación podría, en parte, explicar la baja tasa de éxito de la aprobación del medicamento debido a efectos secundarios indeseables o tóxicos. Obtener una perspectiva de la red de caminos de la enfermedad relacionada con HT / HC métodos de selección celular, y la identificación de los nodos clave dentro de estas vías, podría conducir a la identificación de objetivos que son más adecuadas para la intervención terapéutica. Selección de alto rendimiento (HTS) es una metodología ideal para tratar estos temas 9-12. pero los métodos tradicionales de una sola dimensión integral y ensayos celulares, que utilizan simstic lecturas de los procesos biológicos complejos. No fueron capaces de cuantificar de forma simultánea los fenotipos observados en muchas enfermedades neurodegenerativas como el déficit en el transporte axonal o alteraciones en la morfología de 13 propiedades, 14. Este enfoque no puede ser utilizado para investigar la naturaleza dinámica de los procesos celulares o eventos patogénicos que ocurren en un subconjunto de las células. Para cuantificar estas características hay que pasar a la multi-dimensional fenotipos denominados de alto contenido de detección (HCS) 4, 15-17. HCS es la cuantificación basada en células de varios procesos simultáneamente, lo que proporciona una representación más detallada de la respuesta celular a diversas perturbaciones en comparación con el HTS. HCS tiene muchas ventajas sobre HTS 18, 19, pero la realización de un alto rendimiento (HT), de alto contenido (HC) en la pantalla de los modelos neuronales es problemático debido a los altos costos, la variación ambiental y el error humano. Con el fin de detectar la respuesta celular en un &#39;phenomics&#39; escalacon HC imagen que uno tiene que reducir la variación y error, al tiempo que aumenta la sensibilidad y reproducibilidad. En este documento se describe un método para llevar a cabo con precisión y fiabilidad pantallas ARNhc con el cultivo de células automatizado 20 y HC de imágenes neuronales en modelos celulares. Se describe la forma en que han utilizado esta metodología para identificar moduladores de una proteína en particular, DJ1, que cuando está mutado causa parkinsonismo autosómico recesivo 21. La combinación de la versatilidad de la HC de imágenes con los métodos de HT, es posible cuantificar con precisión una gran cantidad de fenotipos. Esta tarde podría ser utilizado para avanzar en nuestra comprensión del genoma, las vías involucradas en la patogénesis de la enfermedad, así como identificar posibles dianas terapéuticas.

Se describe una metodología que combina el cultivo de células automatizadas con alto contenido de imágenes para visualizar y cuantificar múltiples procesos celulares y de las estructuras, de un modo de alto rendimiento. Estos métodos pueden ayudar en la anotación más funcional de los genomas, así como identificar las redes de genes de enfermedades y los posibles objetivos farmacológicos.

Filtrado de contenido de alta en las enfermedades neurodegenerativas

La anotación funcional de los genomas, la construcción de redes moleculares y la identificación de nuevas dianas farmacológicas son desafíos importantes que deben ser...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en utilizar ensayos de alto contenido en modelos celulares de enfermedades para cuantificar las vías afectadas en enfermedades neurodegenerativas. Para lograrlo, se introduce un modelo celular del fenotipo de la enfermedad en el sistema automatizado de cultivo celular, y las células se incuban hasta alcanzar el número celular requerido. A continuación, las células se dividen, se cuentan y se distribuyen en placas de 96 pocillos que contienen lentivirus que expresan diversos ARNh dirigidos contra SH.Después de seis días de diferenciación celular, las células se recuperan del sistema para inmunotinción e imágenes de alto contenido. Finalmente, las imágenes se analizan mediante una variedad de algoritmos de análisis para cuantificar características relacionadas con la salud celular, el crecimiento neuronal y la función mitocondrial.Los resultados también se analizan mediante un análisis de dos vías en Novas para identificar efectos de interacción significativos. Este método puede acelerar la obtención de respuestas a preguntas clave sobre la función de los genes relacionados con enfermedades y las vías en las que funcionan en conjunto. Esto conducirá entonces a una mejor comprensión de los mecanismos patógenos implicados en las enfermedades neurodegenerativas.Para comenzar el proceso de cultivo celular, prepare el sistema automatizado de cultivo celular para la introducción de placas de cultivo celular. Cargue los consumibles, como puntas de pipeta, placas de cultivo celular y placas de ensayo, en el sistema. Asegúrese también manualmente de que haya suficiente medio de cultivo celular, PBS y tripsina en el sistema.Siembre dos placas de bandeja omni con dos veces 10 a la seis células por placa de la línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y. Mantenga las células en medio óptimo con 10% de suero bovino fetal (FBS) y coloque las placas en el estante de entrada del robot de cultivo celular. Mediante la interfaz gráfica de usuario o GUI, seleccione el protocolo de cultivo celular adherente A y ajuste los archivos de parámetros específicos de la línea celular adherente A para que el umbral de confluencia se establezca en 70%.El tiempo total de acondicionamiento es de dos minutos. Instruya al sistema para que prepare nuevas placas tipo omni con un número de células de asiento de dos veces 10 a la sexta células por placa. Instruya al sistema para que prepare placas de ensayo por cada placa tipo omni con un total de 5.000 células por pocillo e incube las células a 37 grados Celsius y 5 %CO2.Los siguientes pasos están involucrados en este protocolo de cultivo celular de adherencia. Las placas se incuban y se toman imágenes hasta que las células alcancen el umbral predeterminado de confluencia. Si las células no alcanzan el umbral de confluencia dentro de cinco lecturas, se retiran las placas del sistema.Una vez que las células alcanzan el umbral de confluencia definido por el usuario, se lavan, se tripsinizan y se cuentan. Se añade un número predeterminado de células a nuevas placas omni trait, y si hay un número suficiente de células, se transporta a la plataforma un número específico de placas de ensayo y se dispensa un número definido de células en cada pocillo. Finalmente, las placas de ensayo pueden ser directamente observadas mediante el microscopio integrado o extraídas del sistema para su posterior procesamiento, iniciando así el procedimiento de producción de virus.Inocular medio LB que contiene ampicilina con stocks glicerolados bacterianos que contienen los vectores HRNA y cultivar durante la noche; al día siguiente, centrifugar las células y eliminar el sobrenadante; extraer los plásmidos utilizando el sistema de purificación de plásmidos Wizard Magnus. El ADN plasmídico final que contiene E EIT se recoge en placas de 96 pocillos. El lentivirus S-H-R-N-A se produce utilizando el consorcio RNAi, mediante una producción lentiviral en placas de 96 pocillos; todos los experimentos deben realizarse en un laboratorio de seguridad ML dos o BSL dos LA, y todos los reactivos y materiales desechables utilizados deben descontaminarse con cloro al 30 % después de su uso.El procedimiento para la producción de lentivirus no se demostrará en este video, pero requiere cuatro días y consta de los siguientes pasos. Primero, las células empaquetadoras se siembran el día cero en la tarde siguiente. El día uno, las células empaquetadoras se transfectan con tres plásmidos de lentivirus 18 horas después de la transfección.El día dos, el medio se reemplaza por medio fresco con alta concentración de BSA o suero. 24 horas después del cambio de medio. El día tres, se cosecha el virus y el medio se vuelve a reemplazar con medio fresco con alta concentración de BSA o suero.Finalmente, 24 horas después de la primera cosecha del virus, el día cuatro, se cosecha nuevamente el virus y se descartan las células empaquetadoras para calcular la multiplicidad de infección o MOI del lentivirus. Transduzca células SHSY5Y con diluciones seriadas del virus e incube las células a 37 grados Celsius. Setenta y dos horas posteriores a la transducción, visualice la expresión de GFP mediante microscopía y determine el porcentaje de células positivas para GFP. Plaque el lentivirus S-H-R-N-A en placas de ensayo con un MOI de tres. Tras sembrar el lentivirus SH-RNA en las placas de ensayo, cargue las placas en el sistema automatizado de cultivo celular para la transducción lentiviral.Después de 24 horas, el medio en las placas de ensayo se cambiará a medio óptimo que contiene 0,5 % de FBS y 0,1 micromolar de ácido retinoico. Para iniciar el proceso de diferenciación, continúe la incubación de las placas de ensayo en el medio de diferenciación durante cinco días para asegurar la reducción máxima de la expresión del gen diana; al quinto día, agregue H2O2 a la mitad de las placas de ensayo durante 24 horas para estimular la translocación de la proteína DJ1 a las mitocondrias. Al sexto día, agregue MIT tracker a las células a una concentración final de 200 nanomolares por pozo e incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos.Después de esto, las placas pueden transportarse al sistema de imagen de alto contenido o HC para la adquisición de imágenes. Alternativamente, las placas pueden extraerse del sistema para su procesamiento adicional, como tinción inmunohistoquímica. Para la adquisición de imágenes de alto contenido, se capturarán un total de 30 campos por pocillo utilizando el objetivo de 20 x, visualizando DJ uno con el conjunto de filtros fitzy, mitocondrias con el conjunto de filtros trixy, beta tres tubulina con el conjunto de filtros S cinco y núcleos con el conjunto de filtros UV.Este es un ejemplo de imágenes compuestas de células obtenidas mediante imágenes de alto contenido. En el panel A se muestran tres células no tratadas y en el panel B se muestran células tratadas con H2O dos. DJ uno está marcado en verde, las mitocondrias en rojo y los núcleos en azul. Para determinar el coeficiente de superposición promedio entre DJ uno y las mitocondrias, analice las imágenes utilizando la aplicación biológica de colocalización.Defina las regiones de interés. ROI de la siguiente manera: ROIA, núcleo, figura cuatro A y E; y ROIB, mitocondrias, figura cuatro B y F. Excluya ROIA de ROIB. Para asegurar el análisis exclusivo del citoplasma, defina las mitocondrias como la región diana uno y DJ uno como la región diana dos, figura cuatro C y G. Analice las imágenes utilizando la aplicación bio de análisis compartimental com para determinar la intensidad media de la señal del marcador MIT dentro de las mitocondrias.Figura cuatro B y F para trazar las longitudes promedio de las neuritas a partir de la tinción de beta tres tubulina. Analice las imágenes utilizando la aplicación bioinformática de perfilado neuronal, figura cuatro D y H, en las placas de imágenes siguientes usando el lector confocal automatizado opera lx.Visualice las mitocondrias con el láser de 561 nanómetros y los núcleos con la imagen de excitación UV. Un total de 30 campos por pocillo utilizando la lente objetivo de 60x con inmersión en agua. Finalmente, analice las imágenes utilizando el algoritmo de características de textura de borde de punto o SER.El filtro de cresta SER transmite la intensidad en píxeles que forman patrones similares a crestas. Cuanto más fragmentadas estén las mitocondrias, mayor será la puntuación de cresta SER. En este video, se utilizaron ensayos de alto contenido o ensayos HC para identificar moduladores de la proteína DJ-1A, cuya pérdida provoca parkinsonismo autosómico recesivo.Este primer resultado representativo ilustra una interacción epistática con DJ uno. El gráfico de barras de la izquierda muestra unidades de fluorescencia normalizadas y las imágenes de la derecha muestran células SHSY cinco Y marcadas en rojo con mito tracker para la cuantificación de la viabilidad celular.Se observó que la inhibición de DJ uno en células expuestas a la toxina provocó una mayor pérdida de viabilidad celular en comparación con las células infectadas con lentivirus aleatorio. La inhibición del gen diana A tuvo un efecto similar al observado en células con inhibición de DJ uno. Sin embargo, la inhibición tanto de DJ uno como del gen diana A provocó una pérdida significativamente mayor de viabilidad celular que la pérdida de cualquiera de los genes por separado, lo que sugiere una interacción epistática entre DJ uno y el gen diana A. Este siguiente ejemplo corresponde a un gen que regula la translocación de DJ uno.El gráfico de barras muestra el coeficiente de superposición normalizado entre DJ uno y las mitocondrias, lo que refleja la translocación de DJ uno desde el citoplasma hacia las mitocondrias. Los paneles A a D son imágenes de células SHSY cinco Y marcadas en verde para DJ uno, en rojo para mitocondrias y en azul para núcleos. Cuando las células se exponen a una toxina, DJ uno se transloca desde el citoplasma hacia las mitocondrias, lo cual se cuantifica mediante un coeficiente de superposición mayor entre DJ uno y las mitocondrias.En células en las que el gen diana B ha sido silenciado, menos DJ uno se transloca a las mitocondrias cuando las células se exponen a la toxina, lo que sugiere que el gen diana B está implicado en el transporte de DJ uno hacia las mitocondrias. Aquí se muestra un ejemplo de un gen implicado en el crecimiento neuronal. Las longitudes normalizadas de las neuritas se muestran en el gráfico de barras, y las células utilizadas para la cuantificación de las longitudes de las neuritas se observan en las imágenes, con beta tres tubulina en verde y núcleos en azul.La inhibición del gen diana C en células SHSY cinco Y de tipo salvaje provoca un aumento significativo en la longitud de las neuritas en comparación con las células infectadas con lentivirus que expresan ARNsh aleatorio. Este efecto se pierde en las células incubadas con toxina. Finalmente, estos resultados muestran un ejemplo de un gen implicado en la morfología mitocondrial.Los valores promedio de la segmentación de las crestas SER mitocondriales en células SHSY cinco Y infectadas con ARNsc o ARN-A dirigido al gen D se muestran en la gráfica. La imagen A y la imagen C son imágenes compuestas de células SHSY cinco Y infectadas con ARNsc o ARN-A dirigido al gen D, respectivamente. Las mitocondrias están coloreadas en rojo, mientras que los núcleos están coloreados en azul.Las imágenes B y D son visualizaciones de la cuantificación de las crestas del RER observadas aquí. La infección de células SHSY cinco Y de tipo salvaje con HRNA que diana el gen D provoca un aumento en el valor de segmentación de las crestas mitocondriales del RER en comparación con las células infectadas con lentivirus aleatorizado. Este enfoque puede allanar el camino para que los investigadores en el campo de la neurodegeneración exploren y anoten las vías implicadas en la patogénesis de la enfermedad de manera oportuna.Esto conducirá entonces a mejores objetivos para el desarrollo terapéutico.

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Investigación

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Medicine

Medicina

Este artículo describe un nuevo protocolo y el reactivo conjunto diseñado para la medición sensible de los efectos neurotóxicos de los compuestos y los tratamientos en co-cultivos de neuronas y astrocitos utilizando el análisis de contenido de alta. Los resultados demuestran que el análisis de contenido de alta tecnología representa una apasionante novela para la evaluación de la neurotoxicidad.

A neuronales y astrocitos Co-cultivo de ensayo para el análisis de alto contenido de neurotoxicidad

Fuente: Bétemps, D., et al.,  Detección de α-sinucleína asociada a enfermedades mediante ELISA mejorado en el cerebro de ratones transgénicos que sobreexpresan la α-sinucleína mutada A53T humana. J. Vis. Exp. (2015). Este video muestra el procedimiento para detectar la proteína α-sinucleína asociada a enfermedades neurodegenerativas en tejido cerebral de ratones transgénicos utilizando ELISA. Los pasos incluyen la homogeneización de tejidos, la centrifugación y la detección ELISA de la proteína...

Detección de la proteína α-sinucleína asociada a enfermedades neurodegenerativas mediante ELISA

Se presenta un método de diagnóstico rápido y de bajo costo para la identificación de los reguladores transcripcionales utilizando alto rendimiento transfecciones robóticos y un ensayo de luciferasa dual brillo casero. Este protocolo genera rápidamente datos funcionales directos de lado a lado para miles de genes y es fácilmente modificable para apuntar cualquier gen de interés.

Selección de alto rendimiento funcional utilizando un doble resplandor de ensayo de luciferasa Homemade

Se describe un alto rendimiento, múltiplex, y el ensayo de líquido cefalorraquídeo proteómica dirigida (CSF) desarrollado con potencial para la traducción clínica. La prueba se puede cuantificar marcadores potenciales y factores de riesgo para la neurodegeneración, tales como las variantes de la apolipoproteína E (E2, E3 y E4), y medir su expresión alélica.

Un alto rendimiento, multiplexado y dirigida proteómico CSF ​​ensayo para cuantificar neurodegenerativas Biomarcadores y apolipoproteína E isoformas Estado

Se describe aquí un enfoque de detección de comportamiento escalonado que puede usarse para detectar compuestos que exhiben eficacia in vivo en comportamientos motores cognitivos y funcionales en modelos de ratón transgénicos de  beta - amiloidosis y tauopatía. Estos métodos se optimizan para examinar los compuestos para la actividad en tareas de memoria de trabajo y de corto plazo.

Evaluación de la Alternancia Espontánea, el Reconocimiento de Objetos Novelos y la Clasificación de Miembros en Modelos de Ratón Transgénico de la Neuropatología Amiloide-β y Tau

Se describe un método para cuantificar la agregación de proteínas mal plegadas. Nuestros detalles del protocolo lentivirales inducida por generación de línea celular estable, proyección de imagen confocal automatizado y análisis de imágenes de agregados proteicos. Como una aplicación ilustrativa, se estudió el efecto de pequeñas moléculas en la promoción de la agregación de SOD1 en una forma dependiente de dosis y tiempo.

Desarrollo de ensayos para cuantificación de contenido alto de Sod1 mutante de la proteína total formación en células vivas

Esta metodología produce árboles de decisión que se dirigen a grupos de población más propensos a sufrir de deterioro cognitivo leve y son útiles para la detección selectiva rentable de la enfermedad.

Un enfoque de aprendizaje automático para diseñar un examen selectivo eficiente del deterioro cognitivo leve

Presentamos un protocolo utilizando un enfoque genético directo para la detección de mutantes que exhiben neurodegeneración en Drosophila melanogaster. Incorpora un ensayo de escalada, análisis histológico, mapeo genético y secuenciación de ADN para identificar en última instancia nuevos genes relacionados con el proceso de neuroprotección.

En Vivo Forward Genetic Screen para Identificar Nuevos Genes Neuroprotectores en Drosophila melanogaster

Describimos la producción de cultivos mixtos de astrocitos y células precursoras de oligodendrocitos derivadas de células madre neurales fetales o adultas que se diferencian en oligodendrocitos maduros, y el modelado in vitro de estímulos nocivos. El acoplamiento con una técnica de detección de alto contenido basada en células construye un sistema de detección de drogas confiable y robusto.

Diferenciación de cribado de alto contenido y análisis de maduración de cultivos de células precursoras de oligodendrocitos derivados de células madre neurales fetales y adultas

Los fibroblastos de pacientes portadores de mutaciones causantes de la enfermedad en el Parkinson genes representan un fácil...

El uso de fibroblastos humanos primarios para la Supervisión de fenotipos mitocondriales en el campo de la enfermedad de Parkinson

Aprenda a utilizar ensayos de alto contenido en modelos celulares para cuantificar vías afectadas en enfermedades neurodegenerativas. Este método automatizado permite analizar el crecimiento neuronal y la función mitocondrial con precisión.

Filtrado de contenido de alta en las enfermedades neurodegenerativas

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