Caracterización electrofisiológica de las buenas prácticas agrarias que expresan las poblaciones de células en la retina intacta

El objetivo general de este procedimiento es estudiar las respuestas a la luz y la morfología de neuronas individuales en la retina intacta mediante el uso de una línea de ratones que expresa un marcador fluorescente exclusivamente en tipos celulares específicos. Esto se logra primero mediante la disección del ojo para obtener una retina aislada. El segundo paso consiste en colocar la retina bajo un microscopio de barrido láser y visualizar una célula mediante excitación infrarroja de dos fotones.

Una micropipeta se utiliza entonces para obtener una configuración de registro por parche de célula completa para la grabación y llenado con colorante. En última instancia, este preparado permite registrar las respuestas celulares a la fotoestimulación y revela la morfología de la célula registrada mediante microscopía confocal. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como el registro por parche sin guía en la retina, es que el registro puede dirigirse visualmente hacia una célula marcada con fluorescencia sin estimular la retina con la luz de excitación.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación retiniana, como cuál es la contribución de una población determinada de células al procesamiento de la información visual, incluso si dicha población celular tiene baja densidad y no presenta características morfológicas distintivas que faciliten su identificación. Comience este experimento adaptando al ratón a la oscuridad durante al menos tres horas antes del experimento.

Mientras tanto, prepare la solución extracelular según se describe en el manuscrito adjunto y burbujee con carbógeno a temperatura ambiente. A continuación, sacrifique el ratón y enucleé los ojos con un par de tijeras curvas para iris. Trasládelos a un recipiente con solución extracelular.

Luego, colóquelo bajo un microscopio estereoscópico con un par de tijeras de resorte. Retire la córnea y el cuerpo ciliar abriendo el globo ocular a lo largo de la ora serrata. Extraiga el cristalino y separe cuidadosamente la retina del epitelio pigmentario.

A continuación, corte el nervio óptico entre la retina y el epitelio pigmentario. Retire la retina del vaso ocular. Tenga en cuenta que el interior de la retina enrollada es el lado de las células ganglionares.

El exterior es el lado de los fotorreceptores. Posteriormente, retire el vítreo de la superficie retiniana interna tirando suavemente de él con la ayuda de un palillo de madera. A continuación, realice incisiones cortas a lo largo del perímetro de la retina para facilitar el aplanamiento del tejido.

A continuación, transfiera la retina a la cámara de registro con el lado de los fotorreceptores hacia abajo. Extiéndala sobre el fondo de vidrio con un pincel fino y fíjela con un marco de nailon sobre un aro de acero inoxidable. Coloque la cámara de registro en la oscuridad bajo un microscopio vertical de escaneo láser.

Suprafusione continuamente la preparación retiniana a no menos de cinco mililitros por minuto. Con solución extracelular oxigenada con carbónico calentada a 35 grados Celsius, el microscopio está situado sobre una mesa de aire amortiguadora de vibraciones dentro de una jaula de Faraday. Para blindaje electrónico, cubra la jaula con una cortina opaca para mantener la preparación en la oscuridad.

También bloqueamos la luz de los monitores de computadora mediante películas rojas transparentes. Ajuste el láser infrarrojo a longitudes de onda de 850 a 870 nanómetros o más largas. Cambie a la condición de modo bloqueado y utilice excitación de dos fotones para visualizar células que expresan GFP.

Para la grabación mediante parche, llene micropipetas de vidrio de borosilicato con la solución intracelular que contiene una sonda fluorescente, como se describe en el manuscrito adjunto. Luego, inserte la micropipeta en el porta-pipeta. Asegúrese de que el electrodo de referencia esté en contacto con la solución extracelular en la cámara de grabación.

A continuación, aplique presión al microelectrodo dirigido hacia una célula que expresa GFP utilizando un objetivo de inmersión en agua de 40 aumentos. Los cuerpos celulares de los ómicos se encuentran en la capa de células ganglionares, así como en la parte proximal de la capa intercalar, antes de que el microelectrodo entre en contacto con la célula diana y atraviese la membrana limitante interna en la superficie retiniana. La penetración exitosa se reconoce por la solución intracelular que es expulsada desde la punta del microelectrodo y por la separación de la membrana limitante interna del tejido retiniano subyacente. El colorante fluorescente presente en la solución intracelular puede revelar la posición del microelectrodo en la imagen de dos fotones mientras se aproxima a la célula deseada.

Luego, libere la presión del micropipeta y obtenga una configuración de registro de parche de célula entera. En el modo de fijación de corriente, un registro utilizable debe mostrar un potencial de membrana de menos 50 a menos 55 milivoltios y durar al menos 20 minutos. Después de eso, presente los estímulos visuales creados en un monitor de computadora.

Ajuste la intensidad del estímulo insertando filtros de densidad neutra en la trayectoria del haz y regule la posición espacial del estímulo al centro de la célula registrada. A continuación, inicie el protocolo de estimulación y registre las respuestas a la luz. Utilice el generador de estímulos para activar el software de registro.

Incluya un fotodiodo dentro del trayecto del haz para registrar el momento del estímulo. Tenga cuidado de no extraer el cuerpo celular al retraer la micropipeta. Cuando se realice la tinción, permita que el agente fluorescente se difunda en la célula registrada durante 30 a 45 minutos.

Aquí se muestra un ejemplo de células que expresan GFP en una preparación plana de retina bajo su promotor para la tirosina hidroxilasa, donde pueden distinguirse dos poblaciones por el brillo de la señal GFP. Las células dopaminérgicas de tipo uno, ubicadas en la capa intercalar, expresan una fluorescencia débil, como lo indican las cabezas de flecha en la figura A. Las células de tipo dos están intensamente marcadas y tienen sus cuerpos celulares ya sea en la capa mostrada mediante flechas en la figura A, o desplazadas en la capa de células ganglionares, como se observa en la figura B. La figura C muestra la estratificación dendrítica de las células de tipo dos en el estrato tres de la capa plexiforme interna; aquí se presenta un ejemplo de la morfología de una célula de tipo dos inyectada con el trazador neurobiotina.

El trazador se visualizó posteriormente mediante unión a estreptavidina marcada con fluorescencia, que se muestra aquí en magenta. A continuación se presentan diferentes patrones de respuesta de una célula de tipo dos ubicada en la capa de células ganglionares frente a luz blanca. Se utilizó un estímulo prolongado de tres segundos para lograr una mejor distinción de los componentes de la respuesta al estímulo, al inicio y al final, siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos como experimentos farmacológicos, imágenes de calcio o inmunoquímica para responder preguntas adicionales, como el papel funcional de un tipo celular determinado en la circuitería retiniana.