La detección directa de la actividad de acetato de formación de la enzima cinasa de acetato

Este experimento tiene como objetivo una medida directa de la actividad formadora de acetato quinasa. Inicie la reacción agregando enzima a una mezcla de reacción que contenga el fosfato de acetilo y sustratos DP. Luego agregue clorhidrato de hidroxilamina para convertir el fosfato de acetilo restante en hidroxilato de acetil.

Agregue una solución de desarrollo para convertir el acetilhidroxilato en un complejo de hidroxilato férrico coloreado que se pueda medir. El espectrofotometría, basado en la cantidad de sustrato de fosfato de acetilo consumido en los resultados de la reacción, permite determinar los parámetros cinéticos de la enzima. La ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que se basa en la medición directa del consumo de fosfato de acetilo en lugar de desacoplar la producción de un TP a la reducción de un A DP. Debido a que este ensayo no se basa en una producción de TP, se puede utilizar para un nuevo grupo de acetato quinasas, que producen fosfato de potencia en lugar de un TP Para una curva estándar de seis a ocho puntos, diluya la solución de material de fosfato de acetilo en 100 milimolares triss hasta un volumen de muestra final de 300 microlitros también incluya una muestra de control sin fosfato de acetilo equilibre todas las muestras en un bloque de calor de 37 grados Celsius para Un momento.

Ahora, agregue 50 microlitros de clorhidrato de hidroxilamina molar, mezcle agitando tres veces e incube en un bloque de calor a 60 grados centígrados durante cinco minutos. Luego agregue 100 microlitros de mezcla de solución de revelado agitando tres veces y deje que el color se desarrolle durante al menos un minuto a temperatura ambiente. Centrifugar las muestras utilizando cubetas de plástico para el espectrofotómetro.

Mida las muestras a 540 nanómetros. Proceda a generar una curva estándar de absorbencia a 540 nanómetros frente a micromoles de fosfato acetílico con un software de análisis de datos y gráficos adecuado. Calcula el valor de r al cuadrado.

Distribuya 300 alícuotas de microlitros de mezcla de reacción a los tubos de microcentrífuga. Recuerde incluir una reacción de control sin tubos de equilibrio enzimático durante un minuto a 37 grados centígrados. Si se realizan varias reacciones, agregue enzima a los tubos a intervalos de tiempo específicos e inmediatamente devuelva cada tubo al bloque de calor de 37 grados Celsius.

Después de cinco minutos, agregue 50 microlitros de clorhidrato de hidroxilamina molar, mezcle e incube cinco minutos a 60 grados centígrados. Luego agregue 100 microlitros de la solución de revelado, mezcle y colóquela a temperatura ambiente para el desarrollo del color. A continuación, centrifugar las muestras a 18.000 veces G durante un minuto.

Proceda a medir la absorbancia a 540 nanómetros. Determine la cantidad de fosfato de acetilo presente en comparación con la curva estándar de fosfato de acetilo. Los datos se pueden trazar y ajustar a la ecuación de McKayla Cementin para la determinación de los parámetros cinéticos.

Este ensayo determina el consumo del sustrato de acetilfosfato para medir la actividad de la acetato quinasa en la dirección de la formación de acetato. El fosfato de acetilo que queda después de un tiempo determinado durante la reacción enzimática se convierte en oxibato de acetilo y, posteriormente, en complejo hidroxiato férrico, que tiene un color rojizo que se puede medir a 540 nanómetros. Esta curva estándar típica que representa la absorbencia a 540 nanómetros frente a los micromoles de fosfato de acetilo tiene una pendiente de 1,2332 unidades de absorbencia por micromol de fosfato de acetilo.

El valor de r cuadrado resultante de 0,99 indica que los datos encajan bien con la ecuación lineal como se muestra aquí. Este ensayo se puede utilizar para determinar la KM de fosfato de acetilo para diversas preparaciones enzimáticas. A cinco milimolares, un DP con concentraciones variables de acetilfosfato acetil quinasa recombinante purificado a partir de metanol Sarina thermophilic sigue la cinética estándar similar al cemento McKayla para cada sustrato, lo que da como resultado un KM aparente de 0,27 más o menos 0,01 milimolares acetilfosfato.

A diferencia del ensayo acoplado estándar, este ensayo directo puede medir la actividad de las acetato quinasas que utilizan sustratos distintos de un TP. Por ejemplo, en la utilización de acetilfosfato por la quinasa de acetato inba histolytica productora de pirofosfato, el fosfato de sodio se sustituyó por un DP en la mezcla de reacción. La curva resultante indica un valor aparente de KM de 0,50 más o menos 0,006 milimolares de acetil fosfato. Después de ver este video, debería tener una buena idea sobre cómo medir la actividad de la acetato quinasa directamente determinando la cantidad de fosfato de acetilo consumido.

Un factor clave para obtener resultados reproducibles es ser consistente en cada paso, especialmente en la adición de enzima y en el paso de mezcla.