Name: La detección directa de la actividad de acetato de formación de la enzima cinasa de acetato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Aprende a medir directamente la actividad de la acetato cinasa en dirección de formación de acetato mediante espectrofotometría. Este método determina parámetros cinéticos enzimáticos basándose en el consumo de acetil fosfato.

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Este trabajo fue apoyado por el premio NSF # 0920274 y Carolina del Sur de la Estación Experimental del proyecto (SC-1700340) para KSS. Este documento es el N º 5929 Contribución Técnica de la Estación Experimental de la Universidad de Clemson.

El esquema general de este protocolo se describe en la figura 1. 1. Preparación para la solución de las curvas de calibración y ensayos <ol><li> Preparar 100 ml de una 2 mol / L de hidroxilamina-HCl. Pesar 13,9 g de clorhidrato de hidroxilamina (MW 69,49 g / mol) y se disuelven en aproximadamente 50 ml de agua destilada, agua desionizada (DDC 2 O). Ajustar el pH a 7.0 con pellets de hidróxido de potasio o una solución concentrada. Llevar el volumen final de 100 ml. La solución se puede almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de 30 días o menos 4 ° C durante un máximo de 90 días. </li><li> Preparar 100 ml de cloruro férrico una / solución de ácido clorhídrico. Pesar 13,5 g de cloruro férrico (MW 270,32 g / mol) y se disuelven en aproximadamente 50 ml ddH 2 O. Añadir 41,3 ml de ácido clorhídrico concentrado (12,1 mol / L) y llevar a un volumen final de 100 ml. La concentración final de cloruro férrico será de 0,5 mol / L y la concentración final de ácido clorhídrico será de 5 mol/ L. La solución se almacena a temperatura ambiente. </li><li> Preparar 100 ml de una 1.84 mol / L de ácido trichoroacetic. Pesar 30,0 g de ácido tricloroacético (MW 163,39 g / mol), se disuelven en ddH2O y llevar el volumen final de 100 ml. La solución se almacena a temperatura ambiente. </li><li> Preparar 5 ml de un 0,1 mol / L solución de fosfato de acetilo. Pesar 0,092 g de fosfato de acetilo (MW 184,06 g / mol), se disuelven en ddH2O y llevar el volumen final de 5 ml. Alícuota de la solución a tubos de microcentrífuga (0,25 ml por tubo) y congelar a -20 ° C hasta su uso. Solución descongelada debe ser colocado en hielo y se puede utilizar durante aproximadamente 1 hora. Solución de fosfato de acetil que ha sido descongelado no debe volver a congelarse y reutilizarse. </li><li> Preparar 5 ml de un 0,1 mol / L de ADP. Pesar 0,24 g de ADP (MW 472,5 g / mol), se disuelven en ddH2O, y llevar el volumen final de 5 ml. Alícuota de la solución en tubos de microcentrífuga (0,5 ml por tubo) y congelar a -20 ° C hastauso. Mantener la solución descongelada en el hielo hasta su uso. </li><li> Prepare 50 ml de una 1 mol / L de Tris. Pesar 6,06 g de Tris (MW 121,14 g / mol), y se disuelven en 40 ml ddH 2 O. Ajustar el pH de la solución a 7,0 con ácido clorhídrico y alcanzar un volumen final de 50 ml. Guarde la solución a temperatura ambiente. </li><li> Prepare 10 ml de un 1 mol / L de solución de cloruro de magnesio. Pesar 2,03 g de cloruro de magnesio (MW 203,31 g / mol), se disuelven en ddH2O, y alcanzar un volumen final de 10 ml. Guarde la solución a temperatura ambiente. </li><li> Prepare 25 ml de solución de desarrollo mediante la mezcla de volúmenes iguales de la solución de ácido de cloruro férrico / clorhídrico y la solución de ácido tricloroacético. Solución de desarrollo deben estar preparados frescos cada día y se almacena a temperatura ambiente. </li></ol> 2. Preparación de una curva estándar de fosfato acetil <ol><li> Una curva estándar de fosfato de acetilo se genera utilizando cantidades conocidas de acetil fosfato. Una curva estándar de seis a eighpuntos t es adecuado. Las normas deben variar entre 0,03 a 0,9 moles moles por cada 300 l, que se correlaciona con la concentración final de 0,1 a 3 mmol / L. Diluir la solución de fosfato de valores acetilo a las concentraciones adecuadas de solución de Tris 100 mM en un volumen final de 300 mL. Una muestra de control sin acetil fosfato también deben estar preparados. </li><li> Incubar cada estándar y el control de los 37 ° C en un bloque de calor durante 1 minuto. </li><li> Añadir 50 l de la solución de clorhidrato de hidroxilamina a cada norma y el control y la mezcla agitando tres veces. Coloque el estándar en un bloque de 60 ° C de calor y se incuba durante cinco minutos. </li><li> Añadir 100 ml de solución de desarrollo de las normas y el control, la mezcla agitando tres veces, y permitir que se desarrolle el color de al menos un minuto a temperatura ambiente. </li><li> Centrífuga con todas las normas y el control en una microcentrífuga a 18.000 xg durante 1 minuto. </li><li> Mediciones de las muestras por espectrofotometría unt 540 nm con cubetas de plástico de 1 ml, utilizando el control como el espacio en blanco para espectrofotometría. </li><li> Generar una curva estándar utilizando el análisis de datos y el software adecuados de gráficos (por ejemplo, KaleidaGraph, Synergy Software). Valores de R 2 de 0.99 o superior son deseables. Los datos se representan como la absorbancia a 540 nm frente a moles de fosfato presente acetilo. </li></ol> 3. Ensayo para la actividad quinasa de acetato <ol><li> Utilizando las soluciones descritas, prepare una mezcla de reacción que contiene una concentración final de 0,1 buffer mol / L Tris, 10 mmol / L de cloruro de magnesio, 5 mmol / L de ADP, y 2 mmol / L acetil fosfato. Una mezcla de 10 ml de reacción se requieren 8,2 ml ddH2O, 1,0 ml de solución de Tris, 0,1 ml de solución de cloruro de magnesio, 0,5 ml de solución de ADP, y 0,2 ml de solución de fosfato de acetilo. Distribuir la mezcla de reacción de 300 alícuotas a tubos de microcentrífuga. Para la determinación de parámetros cinéticos y la optimización de las concentraciones de sustrato, un sustrato puede servariado y la otra sostenía a una concentración constante en las reacciones. </li><li> Pre-incubar la reacción durante 1 minuto a 37 ° C en un bloque de calor. </li><li> Agregar la cantidad deseada de enzima a la reacción y devolvió el tubo en el bloque de 37 º C de calor. También incluyen una reacción de control para que no se añade la enzima. Si las reacciones se realizan varias, añadir la enzima a los tubos a intervalos de tiempo específicos. Asegúrese de mantener la noción del tiempo. (NOTA: La cantidad de enzima que se utilizará tendrá que ser optimizado para asegurar que todos los de la acetil fosfato o sustrato ADP no se agotará - véase la sección de discusión) </li><li> Después de 5 minutos, agregar 50μl de la solución de clorhidrato de hidroxilamina a cada reacción y el control, mezclar y colocar los tubos en un bloque de 60 ° C de calor. Si varias reacciones se llevan a cabo, esto debe hacerse en el mismo intervalo de tiempo que la enzima se añadió. </li><li> Incubar las reacciones y controlar el durante 5 minutos a 60 ° C. </li><li> Añadir 100 ymu; L de la solución de desarrollo de cada reacción y el control, mezclar y colocar en un soporte de tubos en el banco de laboratorio. De formación de color por lo menos durante 1 minuto. </li><li> Centrifugar todos los tubos en una microcentrífuga a 18.000 xg durante 1 minuto. </li><li> Mediciones de muestras con un espectrofotómetro a 540 nm con cubetas de plástico de 1 ml y determinar la cantidad de fosfato presente acetil en comparación con la curva estándar de fosfato de acetilo. </li><li> La cantidad de sustrato acetil fosfato reducido se puede determinar restando la cantidad de acetil fosfato que queda después de la reacción enzimática de la cantidad de acetil fosfato presente en la enzima de control insuficiente. Realizar análisis de datos a partir de datos de gráficos y el software adecuados (por ejemplo, KaleidaGraph, Synergy Software). R 2 valores superiores a 0,97 son deseables. </li></ol> 4. Los resultados representativos: El propósito de este ensayo es medir la actividad de acetato quinasa en la directaión de la formación de acetato. Esto se hace mediante la medición de consumo de sustrato acetil fosfato, ya que no existe una medición sencilla y directa para la producción de acetato. Acetil fosfato que queda después de un momento dado durante la reacción enzimática se convierte en hidroxamato acetil y, posteriormente, al complejo hidroxamato férrico, que tiene un color rojizo (Figura 2) que se puede medir a 540 nm. La curva estándar de absorbancia frente trazado actual moles acetil fosfato en las normas se utiliza para determinar la cantidad de acetil fosfato restante en cada reacción. La curva estándar debe ser lineal a través del punto cero. Una curva estándar representativo se muestra en la Figura 3 tiene una pendiente de 1,2332 unidades de absorbancia por presentar mol acetil fosfato y un valor de R 2 de 0,99, indicando que los datos se ajusta a la ecuación lineal también. La ecuación para el ajuste lineal a los datos de la curva estándar se utiliza para el cálculo de la cantidad de acetil fosfato restante en la reacción. Los molesde acetil fosfato consumido se determina como la diferencia entre los moles de acetil fosfato presente en la reacción de control que carecen de la enzima y la moles de acetil fosfato que queda después de la reacción enzimática. Purificada, recombinante M. quinasa thermophila acetato fue ensayada mediante el protocolo descrito. Para el experimento se muestra en la Figura 4, la concentración de ADP se mantuvo constante en 5 mmol / L y la concentración de acetil fosfato en la reacción fue variada para determinar el m K de acetil fosfato. Como era de esperar, este experimento demuestra que la enzima siguiente estándar de Michaelis-Menten, como la cinética de cada sustrato y produce una curva de saturación hiperbólica al trazar la actividad frente a la concentración de fosfato de acetilo. La aparente K m valor de acetil fosfato fue de 0,27 ± 0,01 mmol / L, que se compara favorablemente con el valor publicado K m de 0,47 ± 0,01 mmol / L, junto con el dedecir 13. El ensayo directo también se puede utilizar para medir la actividad de las quinasas de acetato que utilizan otros sustratos de la ATP, que no es posible con la prueba estándar acoplados. Recombinante E. histolytica acetato quinasa 16, que produce PP i en lugar de ATP en la dirección de acetato de formación, fue sometido a esta prueba con fosfato de sodio en lugar de ADP. La concentración de fosfato de sodio en la reacción se mantuvo constante a 0,2 mol / L y la concentración de acetil fosfato era variada. En cuanto a la M. thermophila quinasa acetato, la E. quinasa histolytica acetato seguido de Michaelis-Menten, como la cinética de acetil fosfato y una curva de saturación hiperbólica se observó (Figura 5). La aparente K m valor de acetil fosfato fue de 0,50 ± 0,006 mmol / L. Reeves y Guthrie 15 determina un valor de K m de 0,06 mmol / L de acetil fosfato de la enzima nativa, cómo embargo, la enzima fue parcialmente purificada y su ensayo involucró a cuatro enzimas de acoplamiento que también fueron sólo parcialmente purificada. Por lo tanto, es difícil comparar directamente estos valores. Protocolo de Régimen <ol><li> Generar una curva estándar de fosfato de acetilo </li><li> Diluir la enzima a la concentración deseada </li><li> Prepare la mezcla de reacción y la alícuota de 300 l con tubos de microcentrífuga </li><li> Reacciones preincubar a 37 ° C durante 1 minuto </li><li> Inicio reacciones mediante la adición de enzimas a intervalos de tiempo específicos </li><li> Añadir hidroxilamina en los mismos intervalos de detener las reacciones y se incuba a 60 ° C durante 5 minutos </li><li> Añadir cloruro férrico / solución de ácido tricloroacético para el desarrollo de color </li><li> Centrifugar los tubos a 18.000 xg durante 1 minuto </li><li> Medir la absorbancia a 540 nm </li><li> Determinar la cantidad de acetil fosfato consumido en comparación con la curva estándar </li></ol>tp_upload/3474/3474fig1.jpg "/&gt; Figura 1. Esquema de Protocolo <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Normas acetil fosfato. Aumento de las concentraciones de fosfato de acetilo reacciona con hidroxilamina y el color se desarrolló tal como se describe. El control que carecen de acetil fosfato es de color amarillo brillante, y las reacciones que contienen cantidades crecientes de acetil fosfato son sucesivamente de color más oscuro. Este cambio de color se mide a 540 nm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Ejemplo de curva estándar acetil fosfato. Cantidades variables de acetil fosfato se hicieron reaccionar con hidroxilamina y el desarrollo de soluciones de color y se midió la absorbancia a 540 nm. La absorbancia a 540 nm frente a fosfato de moles acetil fue trazada y un ajuste lineal de los datos se aplicó. &lt;/ P&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Utilización de acetil fosfato por el M. ATP que producen thermophila quinasa acetato. La actividad enzimática se determinó en la dirección de la formación de acetato en presencia de 5 mmol / L de ADP con diferentes concentraciones de acetil fosfato. La cantidad consumida de acetil fosfato se determinó como la diferencia entre el importe de partida de acetil fosfato en la reacción y la cantidad de acetil fosfato que queda después de la reacción enzimática. Los ensayos se realizaron por triplicado con barras de error se muestra. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Utilización de acetil fosfato por el PP i-producción de E. histolytica quinasa acetato. La actividad enzimática en la dirección de la formación de acetato se determinó en presencia de 0.2 mol / L de fosfato de sodio con diferentes concentraciones de acetil fosfato. La cantidad consumida de acetil fosfato se determinó como la diferencia entre el importe de partida de acetil fosfato en la reacción y la cantidad de acetil fosfato que queda después de la reacción enzimática. Los ensayos se realizaron por triplicado con barras de error se muestra.

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No hay conflictos de interés declarado.

La detección de acetil fosfato en este ensayo depende de una suficiente concentración de clorhidrato de hidroxilamina y la concentración y la acidez de la solución de cloruro férrico. Alteración del volumen de ensayo requiere la reconsideración de estos dos componentes. Las reacciones enzimáticas que se describe aquí se realizaron a 37 ° C con la terminación hidroxilamina realiza a 60 ° C durante 5 minutos. Esta temperatura más alta es fundamental para permitir la rápida transformación de la acetil fosfato restante a hi...

<table border="1"><tr><td width="160"> Nombre del reactivo </td><td width="108"> Empresa </td><td width="134"> Número de catálogo </td><td width="103"> Comentarios </td></tr><tr><td> Acetil fosfato </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 01409 </td><td> La sal de litio (97%) </td></tr><tr><td> Fosfato de sodio monobásico (deshidratación) </td><td> ThermoFisher </td><td> S381 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de sodio dibásico (anhidro) </td><td> ThermoFisher </td><td> S374 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de magnesio (hexahidratado) </td><td> ThermoFisher </td><td> M33 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> ThermoFisher </td><td> B152 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro férrico (hexahidratado) </td><td> ThermoFisher </td><td> I88 </td><td></td></tr><tr><td> El ácido tricloroacético </td><td> ThermoFisher </td><td> A324 </td><td></td></tr><tr><td> Hidroxilamina hidrocloruro </td><td> ThermoFisher </td><td> H330 </td><td></td></tr><tr><td> 5&#39;-difosfato de adenosina sal de sodio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A2754 </td><td></td></tr><tr><td> BIOMATE III Espectrofotómetro </td><td> ThermoFisher </td><td> 142982082 </td><td> Estándar de UV / Vis espectrofotómetro </td></tr></table>

la detección directa de la actividad de acetato de formación de la enzima cinasa de acetato

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Quinasa de acetato, un miembro del acetato y el azúcar-quinasa Hsp70-actina (ASKHA) superfamilia de enzimas 1-5, es el responsable de la fosforilación reversible de acetato de acetil fosfato que utilizan ATP como sustrato. Acetato de quinasas son muy abundantes en las bacterias, que se encuentra en un género de Archaea, y también están presentes en los microbios de la Eukarya 6. El acetato quinasa mejor caracterizados es que a partir del metano que producen thermophila archaeon Methanosarcina 14.07. Una quinasa acetato de que sólo se puede utilizar PP i ATP, pero no en la dirección de la acetil-fosfato forman se ha aislado de Entamoeba histolytica, el agente causante de la disentería amebiana, y hasta el momento sólo se han encontrado en este género 15,16. En la dirección de la formación de acetil fosfato, acetato de actividad quinasa se mide típicamente usando el ensayo de hidroxamato, describió por primera vez por Lipmann17-20, un ensayo acoplado en lo que se suma la conversión de ATP a ADP a la oxidación de NADH a NAD + por la piruvato quinasa enzimas lactato deshidrogenasa y 21,22, o un ensayo de medición de la liberación de fosfato inorgánico después de la reacción del producto acetil fosfato con hidroxilamina 23. Actividad en la dirección opuesta, el acetato de formación de la dirección se mide mediante el acoplamiento de la formación de ATP a partir de ADP a la reducción de NADP + a NADPH por las enzimas hexoquinasa y glucosa 6-fosfato deshidrogenasa 24. Aquí se describe un método para la detección de la actividad quinasa de acetato en la dirección de la formación de acetato que no requiere de enzimas de acoplamiento, sino que se basa en la determinación directa del consumo de acetil fosfato. Después de la reacción enzimática, fosfato restante acetil se convierte en un complejo hidroxamato férrico que se puede medir espectrofotométricamente, como para el ensayo de hidroxamato. Por lo tanto, a diferencia del stensayo andard junto a esta dirección, que depende de la producción de ATP a partir de ADP, este ensayo directo se pueden utilizar para las quinasas de acetato que producen ATP o PP i.

Un método para la determinación de la actividad quinasa de acetato se describe. Este ensayo utiliza una reacción directa para determinar la actividad enzimática y la cinética de la cinasa de acetato en la dirección de acetato de formación con diferentes aceptores fosforilo. Además, este método puede ser utilizado para el ensayo de fosfato de otros o acetil de acetil-CoA utilizando enzimas.

La detección directa de la actividad de acetato de formación de la enzima cinasa de acetato

La acetato quinasa, un miembro de la superfamilia de enzimas acetato y azúcar quinasa-Hsp70-actina (ASKHA)1-5, es responsable de la fosforilación reversible de ...

Este experimento tiene como objetivo medir directamente la actividad formadora de acetato de la acetato quinasa. Inicie la reacción añadiendo enzima a una mezcla de reacción que contiene acetil fosfato y sustratos DP. Luego, añada clorhidrato de hidroxilamina para convertir el acetil fosfato restante en acetil hidroxilato.Añada la solución reveladora para convertir el acetil hidroxilato en un complejo coloreado de hidroxilato férrico que puede medirse espectrofotométricamente. Según la cantidad de sustrato de acetil fosfato consumido en la reacción, los resultados permiten la determinación de los parámetros cinéticos de la enzima. La ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes radica en que se basa en la medición directa del consumo de acetil fosfato, en lugar de desacoplar la producción de ATP a la reducción de ADP. Dado que este ensayo no depende de la producción de ATP, puede utilizarse para un nuevo grupo de acetato quinasas, que producen fosfato de pantotenilo en lugar de ATP. Para una curva estándar de seis a ocho puntos, diluya la solución madre de acetil fosfato en tris 100 milimolar hasta un volumen final de muestra de 300 microlitros. Incluya también una muestra control sin acetil fosfato. Incube todas las muestras en un bloque calefactor a 37 grados Celsius durante un minuto.Ahora, agregue 50 microlitros de hidrocloruro de hidroxilamina dos molar, mezcle agitando tres veces e incube en un bloque térmico a 60 grados Celsius durante cinco minutos. Luego, agregue 100 microlitros de la solución reveladora, mezcle agitando tres veces y deje que el color se desarrolle durante al menos un minuto a temperatura ambiente. Centrifugue las muestras utilizando cubetas de plástico para el espectrofotómetro.Mida las muestras a 540 nanómetros. Proceda a generar una curva estándar de absorbancia a 540 nanómetros frente a micromoles de acetil fosfato utilizando un software adecuado de análisis de datos y graficación. Calcule el valor de r cuadrado.Distribuya alícuotas de 300 microlitros de la mezcla de reacción en tubos de microcentrífuga. Recuerde incluir una reacción control sin enzima y equilibre los tubos durante un minuto a 37 grados Celsius. Si se realizan varias reacciones, agregue la enzima a los tubos en intervalos de tiempo específicos y regrese inmediatamente cada tubo al bloque térmico a 37 grados Celsius.Después de cinco minutos, agregue 50 microlitros de hidroxilamina clorhidrato dos molar, mezcle e incube cinco minutos a 60 grados Celsius. Luego agregue 100 microlitros de la solución de revelado, mezcle y coloque a temperatura ambiente para el desarrollo del color. A continuación, centrifugue las muestras a 18.000 ×g durante un minuto.Proceda a medir la absorbancia a 540 nanómetros. Determine la cantidad de acetil fosfato presente mediante comparación con la curva patrón de acetil fosfato. Los datos pueden graficarse y ajustarse a la ecuación de McKayla Cementin para la determinación de los parámetros cinéticos.Este ensayo determina el consumo del sustrato acetil fosfato para medir la actividad de la acetato quinasa en la dirección de formación de acetato. El acetil fosfato remanente después de un tiempo determinado durante la reacción enzimática se convierte en acetil oxbiato y posteriormente en un complejo férrico de hidroxiato, que presenta un color rojizo que puede medirse a 540 nanómetros. Esta curva estándar típica, que representa la absorbancia a 540 nanómetros frente a los micromoles de acetil fosfato, tiene una pendiente de 1,2332 unidades de absorbancia por micromol de acetil fosfato.El valor resultante de r cuadrado de 0,99 indica que los datos se ajustan bien a la ecuación lineal como se muestra aquí. Este ensayo puede utilizarse para determinar la KM de la acetil fosfato para diversas preparaciones enzimáticas. A cinco milimolar de ADP con concentraciones variables de acetil fosfato, la acetato quinasa recombinante purificada de Methanolobacterium thermophilicum sigue una cinética de tipo Michaelis-Menten estándar para cada sustrato, lo que da como resultado una KM aparente de 0,27 ± 0,01 milimolar de acetil fosfato.A diferencia del ensayo acoplado estándar, este ensayo directo puede medir la actividad de acetato quinasas que utilizan sustratos distintos al ATP. Por ejemplo, en la utilización de acetil fosfato por la acetato quinasa de Entamoeba histolytica que produce pirofosfato, se sustituyó fosfato de sodio por ADP en la mezcla de reacción. La curva resultante indica un valor aparente de KM de 0,50 ± 0,006 milimolar de acetil fosfato. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo medir directamente la actividad de acetato quinasa determinando la cantidad de acetil fosfato consumida.Un factor clave para obtener resultados reproducibles consiste en ser constante en cada paso, especialmente al agregar la enzima y durante la etapa de mezclado.

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Investigación

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Biología

Este protocolo describe los pasos necesarios para ejecutar ensayos de desacetilación in vitro e in vivo con el fin de establecer el papel de las proteínas como sustratos de desacetilación específicos para las sirtuinas y estudiar más a fondo el papel de la acetilación reversible de lisina como modificación postraduccional.

Ensayos de desacetilación para desentrañar la interacción entre las sirtuinas (SIRT2) y proteína-sustratos específicos

Este trabajo presenta un método de cribado de alto rendimiento utilizando un sistema universal de cribado genético de enzimas que teóricamente puede aplicarse a más de 200 enzimas. En este caso, el sistema de cribado único identifica tres enzimas diferentes (lipasa, celulasa y fosfatasa alcalina) simplemente cambiando el sustrato utilizado (acetato de p-nitrofenilo, p-nitrofenil-β-D-celobiósido y fosfato de fenilo).

Multienzimático de detección sistemática mediante un sistema de cribado genético de la enzima de alto rendimiento

Describimos un protocolo básico para cuantificar la actividad de la ATPasa in vitro. Este protocolo se puede optimizar en función del nivel de actividad y los requisitos de una ATPasa purificada determinada.

Medición<em&gt; In Vitro</em&gt; Actividad ATPasa para enzimática Caracterización

Aquí, se describe la preparación y uso de una sonda basada en la actividad (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato) que permite la detección y cuantificación de la forma activa de la enzima proinflamatoria N amidasa ácido -acylethanolamine (NAAA), tanto in vitro como ex vivo.

Preparación y<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de una sonda basada en la actividad de<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Ácido amidasa

Las proteínas quinasas son enzimas de señalización altamente evolucionadas y andamios que son críticos para la transducción de señales inter e intracelulares. Se presenta un protocolo para medir la actividad quinasa mediante el uso de adenosina trifosfato radiomarcado ([γ- 32 P] ATP), un método fiable para ayudar a la elucidación de la regulación de señalización celular.

Ensayo de la actividad de proteína quinasa con ATP radiomarcado

Expansión del código genético sirve como una poderosa herramienta para el estudio de una amplia gama de procesos biológicos, incluyendo acetilación de proteínas. Aquí demostramos un protocolo fácil aprovechar esta técnica para generar homogéneo acetilado proteínas en sitios específicos en células de Escherichia coli .

Un protocolo fácil de generar proteínas Site-Specifically acetiladas en Escherichia Coli

El objetivo de este protocolo es la etiqueta, enriquecer e identificar los sustratos de la proteína quinasa CK2 de una muestra biológica compleja como un lisado de célula o tejido homogeneizado. Este método aprovecha los aspectos únicos de la biología de CK2 para este propósito.

Identificación de los sustratos de quinasa CK2 novela utilizando un enfoque bioquímico versátil

Caracterizamos una nueva proteína quinasa utilizando enfoques bioquímicos robustos: análisis de Western Blot con un anticuerpo específico específico específico específico en diferentes líneas y tejidos celulares, interacciones por experimentos de coinmunoprecipitación, actividad quinasa detectada por Western Blot usando un anticuerpo fosfo-específico y por el etiquetado ATP de32P.

Caracterización a nivel molecular utilizando enfoques bioquímicos robustos de una nueva proteína kinasa

Aquí se presenta un ensayo de fluorescencia sensible para monitorear la actividad de la apolipoproteína N-aciltransferasa utilizando péptido diacilglicerilo y alquino-fosfolípidos como sustratos con química de clic.

Ensayo fluorométrico basado en química de clics para la apolipoproteína N-aciltransferasa desde la caracterización enzimática hasta el cribado de alto rendimiento

En este trabajo se presentan métodos ecotoxicológicos estandarizados para la evaluación de biomarcadores en especies de anuros neotropicales. Específicamente, este artículo detalla varias metodologías a diferentes escalas de evaluación ecotoxicológica, como los niveles genético, celular-histológico, bioquímico, morfológico e individual.

Metodologías ecotoxicológicas para evaluar biomarcadores a diferentes escalas en anuros neotropicales

Los ensayos químicos rápidos y precisos para detectar inhibidores específicos son una herramienta importante en el arsenal de desarrollo de fármacos. Aquí, presentamos un ensayo químico escalable de acetil-clic para medir la inhibición de la actividad de acetilación de HAT1.

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Aprende a medir directamente la actividad de la acetato cinasa en dirección de formación de acetato mediante espectrofotometría. Este método determina parámetros cinéticos enzimáticos basándose en el consumo de acetil fosfato.

La detección directa de la actividad de acetato de formación de la enzima cinasa de acetato

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