La detección directa de la actividad de acetato de formación de la enzima cinasa de acetato

Este experimento tiene como objetivo medir directamente la actividad formadora de acetato de la acetato quinasa. Inicie la reacción añadiendo la enzima a una mezcla de reacción que contiene el acetil fosfato y los sustratos DP. Luego, añada clorhidrato de hidroxilamina para convertir el acetil fosfato restante en acetil hidroxilato.

Añada la solución de revelado para convertir el acetil hidroxilato en un complejo coloreado de hidroxilato férrico que pueda medirse espectrofotométricamente. La cuantificación del sustrato de acetil fosfato consumido en la reacción permite determinar los parámetros cinéticos de la enzima. La ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes radica en que se basa en la medición directa del consumo de acetil fosfato, en lugar de en el desacoplamiento de la producción de TP con la reducción de un ADP. Dado que este ensayo no depende de la producción de TP, puede utilizarse para un nuevo grupo de acetato quinasas que producen fosfato de poder en lugar de TP. Para una curva estándar de seis a ocho puntos, diluya la solución stock de acetil fosfato en tris 100 milimolar hasta un volumen final de muestra de 300 microlitros; también incluya una muestra control sin acetil fosfato. Incube todas las muestras en un bloque térmico a 37 grados Celsius durante un minuto.

A continuación, agregue 50 microlitros de hidroxilamina clorhidrato dos molar, mezcle agitando tres veces e incube en un bloque térmico a 60 grados Celsius durante cinco minutos. Luego, agregue 100 microlitros de la solución reveladora, mezcle agitando tres veces y deje que el color se desarrolle durante al menos un minuto a temperatura ambiente. Centrifugue las muestras utilizando cubetas de plástico para el espectrofotómetro.

Mida las muestras a 540 nanómetros. Proceda a generar una curva estándar de absorbancia a 540 nanómetros frente a micromoles de acetil fosfato utilizando un software adecuado para el análisis de datos y la elaboración de gráficos. Calcule el valor de r cuadrado.

Distribuya alícuotas de 300 microlitros de la mezcla de reacción en tubos de microcentrífuga. Recuerde incluir un control de reacción sin enzima y equilibre los tubos durante un minuto a 37 grados Celsius. Si se realizan varias reacciones, agregue la enzima a los tubos en intervalos de tiempo específicos y regrese inmediatamente cada tubo al bloque térmico a 37 grados Celsius.

Después de cinco minutos, agregue 50 microlitros de hidroxilamina clorhidrato dos molar, mezcle e incube cinco minutos a 60 grados Celsius. Luego agregue 100 microlitros de la solución de revelado, mezcle y coloque a temperatura ambiente para el desarrollo del color. A continuación, centrifugue las muestras a 18.000 ×g durante un minuto.

Proceda a medir la absorbancia a 540 nanómetros. Determine la cantidad de acetil fosfato presente mediante la comparación con la curva patrón de acetil fosfato. Los datos pueden representarse gráficamente y ajustarse a la ecuación de McKayla Cementin para la determinación de los parámetros cinéticos.

Este ensayo determina el consumo del sustrato acetil fosfato para medir la actividad de la acetato quinasa en la dirección de formación de acetato. El acetil fosfato restante después de un tiempo determinado durante la reacción enzimática se convierte en acetil oxibato y posteriormente en un complejo férrico hidroxiato, que tiene un color rojizo que puede medirse a 540 nanómetros. Esta curva estándar típica, que representa la absorbancia a 540 nanómetros frente a micromoles de acetil fosfato, tiene una pendiente de 1,2332 unidades de absorbancia por micromol de acetil fosfato.

El valor resultante de r cuadrado de 0,99 indica que los datos se ajustan bien a la ecuación lineal tal como se muestra aquí. Este ensayo puede utilizarse para determinar la KM de la acetil fosfato para diversas preparaciones enzimáticas. A cinco milimolar de ADP y con concentraciones variables de acetil fosfato, la acetato quinasa recombinante purificada de Methanolobacterium thermophilicum sigue una cinética típica tipo Michaelis-Menten para cada sustrato, lo que resulta en una KM aparente de 0,27 ± 0,01 milimolar de acetil fosfato.

A diferencia del ensayo acoplado estándar, este ensayo directo puede medir la actividad de acetato quinasas que utilizan sustratos distintos al ATP. Por ejemplo, en la utilización de acetil fosfato por la acetato quinasa de Entamoeba histolytica que produce pirofosfato, se sustituyó el ATP por fosfato sódico en la mezcla de reacción. La curva resultante indica un valor aparente de KM de 0,50 ± 0,006 milimolar de acetil fosfato. Tras ver este video, debería tener una buena idea de cómo medir directamente la actividad de la acetato quinasa determinando la cantidad de acetil fosfato consumida.

Un factor clave para obtener resultados reproducibles consiste en ser constante en cada paso, especialmente al agregar la enzima y durante la etapa de mezclado.