Name: 醋酸形成醋酸酶激酶活性的直接检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: 学习直接检测醋酸激酶在醋酸形成方向的活性，通过测量乙酰磷酸消耗来确定酶动力学参数。该方法适用于利用乙酰磷酸或乙酰辅酶A的其他酶类研究。

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本工作由美国国家科学基金会（NSF）资助项目 #0920274 及南卡罗来纳州实验站项目（SC-1700340）资助，项目负责人为 KSS。本文为克莱姆森大学实验站第 5929 号技术贡献。

本方案的整体流程如图1所示。
1. 标准曲线与检测用溶液的配制
<ol>
	<li>配制 100 mL 的 2 mol/L 盐酸羟胺溶液。称取 13.9 g 盐酸羟胺（分子量 69.49 g/mol），溶于约 50 mL 去离子水（ddH2O）中。使用氢氧化钾颗粒或浓溶液调节 pH 至 7.0，定容至 100 mL。该溶液可在室温下保存最多 30 天，或在 4 °C 下保存最多 90 天。</li>
	<li>配制 100 mL 的氯化铁/盐酸溶液。称取 13.5 g 氯化铁（分子量 270.32 g/mol），溶于约 50 mL ddH2O 中。加入 41.3 mL 浓盐酸（12.1 mol/L），定容至 100 mL。最终氯化铁浓度为 0.5 mol/L，盐酸最终浓度为 5 mol/L。该溶液在室温下保存。</li>
	<li>配制 100 mL 的 1.84 mol/L 三氯乙酸溶液。称取 30.0 g 三氯乙酸（分子量 163.39 g/mol），溶于 ddH2O 中并定容至 100 mL。该溶液在室温下保存。</li>
	<li>配制 5 mL 的 0.1 mol/L 乙酰磷酸溶液。称取 0.092 g 乙酰磷酸（分子量 184.06 g/mol），溶于 ddH2O 中并定容至 5 mL。将溶液分装至微量离心管中（每管 0.25 mL），于 -20 °C 冻存直至使用。解冻后的溶液应置于冰上，可使用约 1 小时。解冻后的乙酰磷酸溶液不得再次冷冻和重复使用。</li>
	<li>配制 5 mL 的 0.1 mol/L ADP 溶液。称取 0.24 g ADP（分子量 472.5 g/mol），溶于 ddH2O 中并定容至 5 mL。将溶液分装至微量离心管中（每管 0.5 mL），于 -20 °C 冻存直至使用。使用前将解冻后的溶液置于冰上保存。</li>
	<li>配制 50 mL 的 1 mol/L Tris 溶液。称取 6.06 g Tris（分子量 121.14 g/mol），溶于 40 mL ddH2O 中。用盐酸调节溶液 pH 至 7.0，定容至 50 mL。该溶液在室温下保存。</li>
	<li>配制 10 mL 的 1 mol/L 氯化镁溶液。称取 2.03 g 氯化镁（分子量 203.31 g/mol），溶于 ddH2O 中并定容至 10 mL。该溶液在室温下保存。</li>
	<li>通过等体积混合氯化铁/盐酸溶液和三氯乙酸溶液，配制 25 mL 显色液。显色液应每天新鲜配制，并在室温下保存。</li>
</ol>
2. 乙酰磷酸标准曲线的制备
<ol>
	<li>使用已知量的乙酰磷酸生成乙酰磷酸标准曲线。六到八个数据点的标准曲线较为合适。标准品的浓度范围应为每300 μL含0.03 μmol至0.9 μmol，对应最终浓度为0.1至3 mmol/L。将乙酰磷酸储备液用100 mM Tris溶液稀释至适当浓度，终体积为300 μL。同时应制备一份不含乙酰磷酸的对照样品。</li>
	<li>将各标准品及对照样品置于37 °C金属浴中孵育1分钟。</li>
	<li>向每个标准品及对照样品中加入50 μL盐酸羟胺溶液，振荡混匀三次。将反应管转移至60 °C金属浴中，孵育5分钟。</li>
	<li>向各标准品及对照样品中加入100 μL显色液，振荡混匀三次，并在室温下静置至少1分钟以使颜色充分显色。</li>
	<li>将所有标准品及对照样品在微量离心机中以18,000 × g离心1分钟。</li>
	<li>使用1 mL塑料比色皿，在540 nm波长下进行分光光度测定，以对照样品作为空白对照。</li>
	<li>使用合适的数据分析与绘图软件（例如Kaleidagraph、Synergy Software）绘制标准曲线。理想情况下，R2值应达到0.99或更高。数据以540 nm处的吸光度对乙酰磷酸的微摩尔数（μmol）作图。</li>
</ol>
3. 乙酸激酶活性测定
<ol>
	<li>使用上述溶液，配制反应混合液，使其终浓度为 0.1 mol/L Tris 缓冲液、10 mmol/L 氯化镁、5 mmol/L ADP 和 2 mmol/L 乙酰磷酸。配制 10 mL 反应体系需加入 8.2 mL ddH2O、1.0 mL Tris 溶液、0.1 mL 氯化镁溶液、0.5 mL ADP 溶液和 0.2 mL 乙酰磷酸溶液。将反应混合液分装为每管 300 μL 至微量离心管中。为测定动力学参数并优化底物浓度，可在反应中固定一种底物浓度，改变另一种底物的浓度。</li>
	<li>将反应体系在 37 °C 金属浴中预孵育 1 分钟。</li>
	<li>向反应体系中加入适量酶液，并立即将离心管放回 37 °C 金属浴中。同时设置不加酶的对照反应。若进行多个反应，应在特定时间间隔依次向各管中加入酶液，并准确记录时间。（注意：所用酶量需经优化，以确保反应中乙酰磷酸或 ADP 底物不会完全耗尽——参见讨论部分）</li>
	<li>反应 5 分钟后，向每个反应体系及对照管中加入 50 μL 盐酸羟胺溶液，混匀后立即置于 60 °C 金属浴中。若进行多个反应，此步骤应与加酶时间保持相同的时间间隔。</li>
	<li>将反应体系及对照管在 60 °C 金属浴中孵育 5 分钟。</li>
	<li>向每个反应体系及对照管中加入 100 μL 显色液，混匀后置于实验台上的试管架中。显色时间至少 1 分钟。</li>
	<li>将所有离心管在微量离心机中以 18,000 × g 离心 1 分钟。</li>
	<li>使用 1 mL 塑料比色皿，在 540 nm 波长下进行分光光度测定，通过与乙酰磷酸标准曲线比较，确定各反应中剩余乙酰磷酸的含量。</li>
	<li>乙酰磷酸底物的消耗量可通过对照管（无酶）中的乙酰磷酸含量减去酶促反应后剩余的乙酰磷酸量计算得出。使用合适的数据处理与绘图软件（如 Kaleidagraph、Synergy Software）进行数据分析，R2 值应大于 0.97 为宜。</li>
</ol>
4. 典型结果：
该实验的目的是测定乙酸激酶在乙酸生成方向上的活性。由于乙酸的生成缺乏简便直接的检测方法，因此通过测定乙酰磷酸底物的消耗量来实现。在酶促反应进行一定时间后，剩余的乙酰磷酸会转化为乙酰羟肟酸，再进一步形成高铁羟肟酸复合物，该复合物呈红色（图2），可在540 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标绘制标准曲线 μmole标准品中的乙酰磷酸用于确定每个反应中剩余乙酰磷酸的含量。标准曲线应通过零点呈线性关系。图3所示的代表性标准曲线斜率为每单位吸光度1.2332 μmole 乙酰磷酸存在且为 R2 0.99，表明数据与线性方程拟合良好。该线性拟合方程用于计算反应中剩余乙酰磷酸的量。 μmole乙酰磷酸盐消耗量的测定是通过计算消耗前后的差值得出的 μmole对照反应中不含酶时存在的乙酰磷酸分子数 μmole酶促反应后剩余的乙酰磷酸含量
采用所述方案对纯化的重组M. thermophila乙酸激酶进行酶活测定。在图4所示实验中，反应体系中ADP浓度保持恒定在5 mmol/L，通过改变乙酰磷酸浓度以测定乙酰磷酸的Km值。结果如预期所示，该酶对每种底物均表现出典型的米氏动力学特征，酶活性随乙酰磷酸浓度增加呈现双曲线型饱和曲线。乙酰磷酸的表观Km值为0.27 ± 0.01 mmol/L，与已报道的偶联测定法所得Km值（0.47 ± 0.01 mmol/L）相比具有良好的一致性13。
直接测定法还可用于检测利用除ATP以外底物的乙酸激酶活性，而标准偶联测定法无法实现这一点。对重组纯化的E. histolytica乙酸激酶16（在生成乙酸的方向上产生PPi而非ATP）进行该测定，以磷酸钠替代ADP作为反应物。反应中磷酸钠浓度保持在0.2 mol/L不变，乙酰磷酸浓度则进行梯度变化。与M. thermophila乙酸激酶类似，E. histolytica乙酸激酶对乙酰磷酸表现出类似米氏动力学的特征，观察到双曲线型饱和曲线（图5）。乙酰磷酸的表观Km值为0.50 ± 0.006 mmol/L。Reeves和Guthrie15测定天然酶的乙酰磷酸Km值为0.06 mmol/L；然而，他们的酶仅部分纯化，且测定过程涉及四种偶联酶，这些酶也仅为部分纯化。因此，这些数值难以直接比较。
实验方案示意图
<ol>
	<li>绘制乙酰磷酸标准曲线</li>
	<li>将酶稀释至所需浓度</li>
	<li>配制反应混合液，并分装 300 μl 至微量离心管中</li>
	<li>在 37 °C 预孵育反应体系 1 分钟</li>
	<li>按特定时间间隔加入酶以启动反应</li>
	<li>在相同时间间隔加入羟胺终止反应，并在 60 °C 孵育 5 分钟</li>
	<li>加入三氯化铁/三氯乙酸溶液以显色</li>
	<li>在 18,000 × g 离心 1 分钟</li>
	<li>测定 540 nm 处的吸光度</li>
	<li>通过与标准曲线比较，确定消耗的乙酰磷酸量</li>
</ol>
<img alt="乙酰磷酸测定实验方案，步骤包括酶稀释、反应、540 nm 处测定吸光度。" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1. 实验方案示意图
<img alt="比色分析；比色皿；实验；光谱仪装置；浓度测量。" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2. 乙酰磷酸盐标准品。将不同浓度的乙酰磷酸盐与羟胺反应，并按所述方法显色。不含乙酰磷酸盐的对照组呈亮黄色，而含有递增浓度乙酰磷酸盐的反应体系颜色依次加深。该颜色变化在 540 nm 处进行测定。
<img alt="吸光度与乙酰磷酸；线性拟合曲线；分光光度分析；研究数据。" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3. 乙酰磷酸样品标准曲线。将不同量的乙酰磷酸与盐酸羟胺及显色液反应后，于540 nm处测定吸光度。以540 nm处的吸光度对乙酰磷酸的微摩尔数（μmoles）作图，并对数据进行线性拟合。
<img alt="乙酰磷酸消耗图；酶动力学；浓度与消耗量；数据点分析。" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4. 产ATP的M. thermophila乙酸激酶对乙酰磷酸的利用。在含有5 mmol/L ADP的条件下，测定酶促反应向生成乙酸方向进行时不同浓度乙酰磷酸下的酶活性。乙酰磷酸的消耗量通过反应开始时的乙酰磷酸量与酶促反应结束后剩余的乙酰磷酸量之差确定。实验均设三个重复，误差线表示结果偏差。
<img alt="乙酰磷酸消耗量随浓度变化的曲线图，展示生化研究中的反应动力学" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5. 乙酰磷酸在磷酸转移酶系统中的利用i-产生 E. histolytica 乙酸激酶在含有0.2 mol/L磷酸钠及不同浓度乙酰磷酸的体系中，测定酶在乙酸生成方向上的活性。乙酰磷酸的消耗量通过反应开始时的乙酰磷酸量与酶促反应后剩余的乙酰磷酸量之差确定。实验均设三个重复，误差线表示结果差异。

<ol><li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ATPase+domain+common+to+prokaryotic+cell+cycle+proteins%2C+sugar+kinases%2C+actin%2C+and+hsp70+heat+shock+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).</li>
<li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+evolution+of+similar+enzymatic+function+on+different+protein+folds%3A+the+hexokinase%2C+ribokinase%2C+and+galactokinase+families+of+sugar+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases.</a> Protein Sci. 2, 31-40 (1993).</li>
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<li>Aceti, D. J., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+acetate+kinase+from+acetate-grown+Methanosarcina+thermophila.+Evidence+for+regulation+of+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of acetate kinase from acetate-grown Methanosarcina thermophila. Evidence for regulation of synthesis.</a> J. Biol. Chem. 263, 15444-15448 (1988).</li>
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<li>Ingram-Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+acetate+binding+pocket+in+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase.</a> J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).</li>
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<li>Reeves, R. E., Guthrie, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetate+kinase+%28pyrophosphate%29.+A+fourth+pyrophosphate-dependent+kinase+from+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).</li>
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<li>Lipmann, F., Tuttle, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+micromethod+for+determination+of+acyl+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A specific micromethod for determination of acyl phosphates.</a> J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).</li>
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<li>Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+phosphorylation+of+acetate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic phosphorylation of acetate.</a> J. Biol. Chem. 211, 737-756 (1954).</li>
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</ol>

无利益冲突声明。

本实验中乙酰磷酸的检测依赖于足够浓度的盐酸羟胺，以及氯化铁溶液的浓度和酸度。若改变实验体系的体积，则需重新评估这两个组分的用量。本文所述的酶促反应在37°C下进行，而羟胺终止反应则在60°C下持续5分钟。较高的温度对于将残留的乙酰磷酸快速转化为乙酰羟肟酸至关重要。显色步骤的时间以及吸光度的测定相对不敏感，可在加入羟胺溶液后5至15分钟内完成。在测定吸光度前，样品应进行离心处理，因为样品的酸性可能导致酶沉淀，从而因浊度而非真实的颜色变化导致吸光度读数偏高。显色反应产物在10至15分钟后开始降解。
该酶动力学分析实验的主要难点在于确定所用酶的用量以及反应第一步的运行时间。这些参数必须针对每种酶通过实验经验来确定，以确保酶活性不会过高而导致所有乙酰磷酸底物被完全消耗。在绘制动力学曲线时，应对每个反应时间点的乙酰磷酸消耗百分比给予仔细关注。通常情况下，在动力学曲线中浓度较低的变量组分应导致乙酰磷酸消耗达到90%或略高，而在底物浓度达到饱和时，乙酰磷酸的消耗应接近10%或略低。一旦确定了最优酶浓度，即可进一步确定用于测定动力学常数的底物浓度范围。
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<table><tbody><tr><td>乙酰磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01409</td><td>锂盐（97%）</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠（二水合物）</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>S381</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠（无水）</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>S374</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁（六水合物）</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>B152</td><td></td></tr><tr><td>氯化铁（六水合物）</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>I88</td><td></td></tr><tr><td>三氯乙酸</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>A324</td><td></td></tr><tr><td>盐酸羟胺</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>H330</td><td></td></tr><tr><td>&lt;p align=&quot;center">5&amp;rsquo;-二磷酸腺苷 &lt;/p&gt; 钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Biomate III 分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>142982082</td><td>标准紫外/可见光分光光度计</td></tr></tbody></table>

直接检测酶乙酸激酶的乙酸生成活性

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

乙酸激酶属于乙酸和糖激酶-Hsp70-肌动蛋白（ASKHA）酶超家族1-5，可利用ATP作为底物，催化乙酸可逆地磷酸化生成乙酰磷酸。乙酸激酶广泛存在于细菌（Bacteria）中，在古菌（Archaea）的一个属中也有发现，并且在真核微生物（Eukarya）中同样存在6。目前研究最为深入的乙酸激酶来源于产甲烷古菌Methanosarcina thermophila7-14。已从引起阿米巴痢疾的病原体溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）中分离出一种乙酸激酶，该酶在生成乙酰磷酸的方向上只能利用PPi而不能利用ATP，迄今为止仅在该属中发现此类酶15,16。
在乙酰磷酸生成方向，乙酸激酶活性通常通过羟肟酸测定法来检测，该方法最早由Lipmann描述17-20，是一种偶联测定法，其中ATP转化为ADP的过程通过丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的作用与NADH氧化为NAD+相偶联21,22，或通过检测乙酰磷酸产物与羟胺反应后释放的无机磷酸的测定法23。在相反的乙酸生成方向上的活性，则通过ADP生成ATP的过程与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和己糖激酶催化NADP+还原为NADPH的反应相偶联来测定24。
本文介绍一种检测乙酸激酶催化生成乙酸方向活性的方法，该方法无需使用偶联酶，而是基于对乙酰磷酸消耗量的直接测定。酶促反应结束后，剩余的乙酰磷酸被转化为铁-羟肟酸复合物，可通过分光光度法进行检测，类似于羟肟酸测定法。因此，与依赖ADP生成ATP的标准偶联测定法不同，这种直接测定法可用于检测生成ATP或PPi的乙酸激酶。

本文描述了一种测定乙酸激酶活性的方法。该检测方法利用直接反应来测定乙酸激酶在生成乙酸方向上的酶活性及动力学，适用于不同的磷酸基受体。此外，该方法还可用于检测其他利用乙酰磷酸或乙酰辅酶A的酶。

乙酸激酶是乙酸和糖激酶-热休克蛋白70-肌动蛋白（ASKHA）酶超家族的成员之一，负责乙酸可逆的磷酸化反应……

本实验旨在直接测定乙酸激酶的乙酸形成活性。通过向含有乙酰磷酸和DP底物的反应混合物中加入酶来启动反应。然后加入盐酸羟胺，将剩余的乙酰磷酸转化为乙酰羟肟酸。加入显色液，将乙酰羟酸盐转化为可检测的有色三价铁羟酸盐复合物。通过分光光度法测定反应中消耗的乙酰磷酸底物量，从而确定酶动力学参数。该方法相较于现有技术的优势在于，其直接测量乙酰磷酸的消耗量，而非通过ATP生成与ADP还原的解偶联反应来间接测定。由于该检测方法不依赖ATP的生成，因此可用于一类新型乙酸激酶的研究，这类酶生成的是磷酸化能量分子（power phosphate），而非ATP。为建立包含六至八个数据点的标准曲线，将乙酰磷酸储备液用100毫摩尔/升Tris缓冲液稀释，最终样品体积为300微升；同时设置不含乙酰磷酸的对照样品。将所有样品置于37摄氏度恒温金属浴中平衡1分钟。现在，加入 50 µL 的 2 M 盐酸羟胺溶液，振荡混匀 3 次，然后在 60 °C 的加热块中孵育 5 分钟。接着加入 100 µL 显色液，振荡混匀 3 次，室温下显色至少 1 分钟。使用塑料比色皿将样品离心后用于分光光度计检测。在 540 纳米处测定样品的吸光度。使用适当的数据分析和绘图软件，绘制 540 纳米处吸光度与乙酰磷酸微摩尔数的标准曲线。计算 r 平方值。将300微升反应混合物分装至微量离心管中。请记得设置一个不加酶的对照反应，并将所有管子在37摄氏度下平衡1分钟。若同时进行多个反应，需在特定时间间隔内向各管中加入酶，并立即将每支管子放回37摄氏度的加热块中。五分钟后，加入50 µL的2摩尔盐酸羟胺溶液，混匀，并在60°C下孵育5分钟。然后加入100 µL显色液，混匀后于室温放置进行显色。随后将样品在18,000 ×g下离心1分钟。在540纳米处测定吸光度。通过与乙酰磷酸标准曲线比较，确定样品中乙酰磷酸的含量。数据可作图并拟合至McKayla Cementin方程，以确定动力学参数。该实验通过测定乙酰磷酸底物的消耗量，以检测乙酸激酶在生成乙酸方向上的酶活性。在酶促反应进行一定时间后，剩余的乙酰磷酸被转化为乙酰羟基丁酸盐，进而形成红色的氢氧化铁复合物，其在540纳米处的吸光度可进行测定。此典型的乙酰磷酸标准曲线以540纳米处的吸光度对乙酰磷酸的微摩尔数作图，其斜率为每微摩尔乙酰磷酸1.2332吸光度单位。所得的 R² 值为 0.99，表明数据与此处所示的线性方程拟合良好。该检测可用于测定不同酶制剂对乙酰磷酸的 KM 值。在 5 毫摩尔浓度的 ADP 条件下，使用不同浓度的乙酰磷酸对来自甲醇嗜热菌的纯化重组乙酸激酶进行实验，结果显示每种底物均符合典型的 Michaelis-Menten 动力学特征，乙酰磷酸的表观 KM 值为 0.27 ± 0.01 毫摩尔。与标准的偶联测定法不同，这种直接测定法能够测量利用除ATP以外底

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