Desplegable de proteínas de unión a calmodulina

El objetivo general de este procedimiento es probar proteínas que se unen a la calmodulina de manera dependiente del calcio. Esto se logra primero recolectando las proteínas de interés. A continuación, se preparan perlas de calmodulina para la unión de proteínas.

Luego, las proteínas se incuban con perlas de calmodulina. Finalmente, se eluyen las proteínas que se unen de manera dependiente del calcio. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran proteínas que se unen a la calmodulina tanto en presencia como en ausencia de calcio mediante análisis por sanguado occidental.

La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos existentes, como la cromatografía en calma y la inmunoprecipitación, es que requiere menos proteína y menos tiempo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de señalización de la modlina bovina, como qué proteínas se unen a la modlina bovina de manera dependiente del calcio y cómo las modificaciones postraduccionales pueden afectar su unión a la modlina bovina. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de manipulación de las perlas son esenciales y la descripción de la resuspensión y retención de las perlas es difícil de seguir sin verla.

Para preparar el tejido para inyectar de forma homogénea rebanadas organotípicas del hipocampo con un virus que contiene un plásmido que expresa la proteína recombinante de interés. En este ejemplo, la proteína recombinante es Neuro Grandin marcada con GFP. Deje que el tejido exprese la proteína durante la noche, aproximadamente entre 12 y 18 horas después de la inyección viral, agregue un mililitro de tampón de disección a una placa de Petri.

Transfiera el tejido cultivado con el inserto a la placa de Petri y agregue dos mililitros de tampón de disección al inserto para sumergir el tejido utilizando un escalpelo. Recolecte de cinco a 10 cortes de tejido hipocampal organotípico raspando suavemente el tejido libre de la membrana del inserto con una pipeta Pasteur invertida. Transfiera el tejido en suspensión a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros.

A continuación, centrifugue las muestras a 1500 RCF durante un minuto. Para separar el tejido del tampón de disección, retire cuidadosamente el sobrenadante mediante aspiración. Asegúrese de no perturbar el precipitado.

Para cada corte utilizado, agregue el tejido a 30-60 microlitros de tampón de homogenización con una pipeta de un mililitro con la punta cortada y luego homogenice completamente usando un pistilo antes de devolver el homogenizado al tubo original. Con el fin de eliminar los restos celulares, centrifugue el homogenizado restante a 1100 RCF durante 10 minutos y recoja cuidadosamente el sobrenadante por aspiración, evitando la contaminación con el precipitado. Alícuota el 10 % del sobrenadante como muestra del "input".

Guarde el sobrenadante restante en hielo durante la preparación de las perlas de cal sero para su uso. Posteriormente, para cada precipitación, pipete 400 microlitros de cal Modlin Sero speeds en suspensión en un tubo microcentrífugo de dos mililitros con fondo relativamente plano para maximizar el área de superficie y la interacción de las soluciones con las perlas durante las incubaciones, gire el tubo microcentrífugo de lado para humedecer las perlas y luego centrifugue las perlas a 21.000 RCF durante 30 segundos.

Y retire cuidadosamente el sobrenadante mediante aspiración. Asegúrese de no perturbar las perlas para lavarlas con 100 microlitros del tampón de homogenización respectivo que contenga o bien dos milimoles de cloruro de calcio para las perlas que se usan para precipitar proteínas de unión a calcio-calmodulina, o bien dos milimoles de E-D-T-A, un quelante conocido de calcio, para las perlas que se usan para precipitar proteínas de unión a apocalmodulina.

Toque suavemente el tubo para resuspender. Suspenda las perlas y centrifugue a 1500 RCF durante un minuto. Retire cuidadosamente el sobrenadante por aspiración, asegurándose de no perturbar las perlas para unir las proteínas a las esferas de calmodulina para el ensayo de precipitación.

Comience dividiendo el SNAT en dos volúmenes iguales. Dependiendo de la condición por alícuota, agregue la cantidad adecuada de cloruro de calcio o EDTA al sobrenadante para alcanzar una concentración final de dos milimolar. Añada el sobrenadante a las perlas lavadas en el tampón de homogenización adecuado.

Toque suavemente el tubo para mezclar. Incube las muestras a cuatro grados Celsius durante tres horas en un agitador. Suspenderemos las perlas cada 30 minutos aproximadamente para aumentar la eficiencia de unión.

A continuación, centrifugue las muestras a 1500 RC F durante tres minutos. Retire 50 microlitros del sobrenadante como muestra de proteína no unida y elimine cuidadosamente el sobrenadante restante por aspiración, descartándolo. Lave las perlas tres veces como antes con 100 microlitros del tampón de homogenización adecuado.

El paso más difícil de este procedimiento es la elución eficiente de las proteínas diana. La mejor manera de garantizar el éxito consiste en utilizar el tipo adecuado de tubo para minimizar la pérdida de perlas y resuspender apropiadamente las perlas en tampón de elución precalentado. Calentar previamente el tampón de elución también puede ayudar significativamente. Para eluir la proteína, añada 50 microlitros de tampón de elución a las perlas.

Las muestras que fueron homogenizadas y ligadas en tampón que contenía calcio se pasan a tampón que contiene EDTA, y las muestras que contenían EDTA en el tampón se pasan a calcio. Incube los microgránulos a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador. Mezcle los microgránulos golpeando suavemente el tubo aproximadamente cada cinco minutos.

Centrifugar las perlas a 1500 RCF durante tres minutos y eliminar cuidadosamente mediante aspiración los 50 microlitros de SNAT para la muestra de proteína ligada. Asegurarse de no perturbar las perlas. Realizar electroforesis SDS-PAGE y transferencia western para identificar la proteína de interés como control positivo en la condición opuesta.

Proteína Pro conocida por unirse a calmodulina. Esta figura muestra un ejemplo de un ensayo de precipitación con calmodulina para evaluar la unión de Neurograndin con etiqueta GFP a calmodulina en comparación con la neurograndin endógena. La muestra de entrada homogénea muestra que se expresó neurograndin con etiqueta GFP además de la neurograndin endógena y la quinasa 2 dependiente de calmodulina y calcio, tal como se esperaba según la unión conocida de la neurograndin endógena.

La proteína Neuro Grandin marcada con GFP se eluyó en ausencia de calcio y no se unió en presencia de calcio. En contraste, la proteína control quinasa dependiente de calmodulina II se eluyó únicamente en presencia de calcio y permaneció sin unir en su ausencia. Esto demuestra que las perlas de calmodulina funcionaron correctamente y que la EEU fue eficiente.

Lo más importante es que esto demuestra que la neurogrina GFP se une a la apócalmodulina de manera similar a la forma endógena, lo que sugiere que la etiqueta GFP no alteró la función de la proteína recombinante. Una vez dominada esta técnica, sin incluir el análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS y transferencia Western, se puede finalizar en seis horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es fundamental recordar etiquetar todas las muestras y tubos según la condición adecuada, ya que cualquier cambio en la concentración de calcio puede comprometer todo el experimento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar eficientemente la capacidad de proteínas particulares para unirse a un módulo CAL de manera dependiente del calcio.

Mediante la recolección de las proteínas de interés, la incubación con las SRO moduladoras coadyuvantes adecuadamente preparadas, la elución de las proteínas unidas y el análisis mediante electroforesis seguida de transferencia (Western blot).