Desplegable de proteínas de unión a calmodulina

El objetivo general de este procedimiento es probar las proteínas que se unen a Cal Modlin de una manera dependiente del calcio. Esto se logra recolectando primero las proteínas de interés. A continuación, las velocidades de seroidad de calmodulina están preparadas para la unión a proteínas.

A continuación, las proteínas se incuban con velocidades serológicas de calmodulina. Por último, se alude a las proteínas que se unen de forma dependiente del calcio. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran proteínas que se unen a la calmodulina en presencia o ausencia de calcio a través de análisis de sangre occidental.

La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos existentes, como la cromatografía en calma y la inmunoprecipitación, es que requiere menos proteína y menos tiempo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización del modlin de vaca, como qué proteínas se unen al modlin de vaca de manera dependiente del calcio y cómo las modificaciones postraduccionales pueden afectar su unión al modlin de vaca. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de manipulación de las cuentas son esenciales y la descripción del resus y la retención de las cuentas es difícil de seguir sin verla.

Para preparar el tejido para la inyección homogénea, cortes organotípicos del hipocampo con un virus que contiene un plásmido que expresa la proteína recombinante de interés. En este ejemplo, la proteína recombinante está etiquetada con GFP como Neuro Grandin. Deje que el tejido exprese la proteína durante la noche aproximadamente de 12 a 18 horas después de la inyección viral, agregue un mililitro de tampón de disección a una placa de Petri.

Transfiera el tejido cultivado con inserto a la placa de Petri y agregue dos mililitros de tampón de disección al inserto para sumergir el tejido con un bisturí. Recoja de cinco a 10 cortes de tejido organotípico del hipocampo raspando suavemente el tejido para liberarlo de la membrana del inserto con una pipeta de pasto invertida. Transfiera el tejido suspendido a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

A continuación, centrifugar las muestras a 1500 RCF durante un minuto. Para separar el tejido del tampón de disección, extraiga con cuidado el sobrenadante por aspiración. Asegúrese de no alterar el pellet.

Por cada rebanada utilizada, añadir el tejido a 30 a 60 microlitros de tampón de homogeneización con una pipeta de un mililitro con punta cortada, y luego homogeneizarlo a fondo con un mortero antes de devolver el homogeneizado a su tubo original. Para eliminar los restos celulares, centrifugar el homogeneizado restante a 1100 RCF durante 10 minutos y recoger cuidadosamente la nariz por aspiración evitando la contaminación del pellet. Alícuota 10%del sobrenadante como muestra de la entrada.

Guarde el sobrenadante restante en hielo durante la preparación de las perlas de cal sero para su uso. Más tarde, por cada pipeta desplegable de 400 microlitros de cal suspendida Modlin Sero se acelera en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros con un fondo relativamente plano para maximizar el área de superficie y la interacción de las soluciones con las perlas durante las incubaciones, gire el tubo de microcentrífuga de lado para humedecer las perlas y luego centrifugue las perlas a 21, 000. RCF durante 30 segundos.

Y retire con cuidado el sobrenadante por aspiración. Asegúrese de no alterar las perlas para lavarlas a 100 microlitros del tampón de homogeneización respectivo que contiene dos milímetros de cloruro de calcio o perlas que se utilizan para extraer las proteínas de unión de calcio cal modlina. O dos milimolares E-D-T-A-A conocido quelante de calcio para perlas que se utilizan para reducir las proteínas de unión a la modlina apocal.

Golpee suavemente el tubo hasta Resus. Suspenda las perlas y centrifugue a 1500 RCF durante un minuto. Retire con cuidado el sobrenadante por aspiración, asegurándose de no alterar las perlas para unir las proteínas a los esferones de calmodulina para su extracción.

Comience dividiendo el SNAT en dos volúmenes iguales. Dependiendo de la condición por alícuota, agregue la cantidad adecuada de cloruro de calcio o EDTA al supernat hasta una concentración final de dos milimolares. Añadir el sobrenadante a las perlas lavadas en el tampón de homogeneización adecuado.

Golpee suavemente el tubo para mezclar. Incubar las muestras a cuatro grados centígrados durante tres horas en un agitador. Suspendemos las cuentas cada 30 minutos aproximadamente para aumentar la eficiencia de la encuadernación.

A continuación, centrifugar las muestras a 1500 RC F durante tres minutos. Retirar 50 microlitros de sobrenadante como muestra de proteína no unida y retirar con cuidado el snat restante por aspiración y desecho. Lavar las perlas tres veces como antes con 100 microlitros del tampón de homogeneización adecuado.

El paso más difícil en este procedimiento es la eluciana de las proteínas diana de una manera eficiente. La mejor manera de garantizar el éxito es utilizar el tipo correcto de tubo para minimizar la pérdida de cordones y resuspender adecuadamente los cordones en el calentamiento del tampón de elución. El tampón de elución de antemano también puede ayudar significativamente a eluir la proteína a 50 microlitros de tampón elucian a las perlas.

Las muestras que fueron homogeneizadas y unidas en tampón que contiene calcio se aluden en tampón que contiene EDTA y las muestras que tenían tampón que contiene EDTA se aluden con calcio. Incubar las perlas a temperatura ambiente durante 30 minutos en una coctelera. Mezcle las cuentas golpeando suavemente el tubo aproximadamente cada cinco minutos.

Centrifugar las perlas a 1500 RCF durante tres minutos y retirar con cuidado los 50 microlitros de SNAT para la muestra de proteína unida por aspiración. Asegúrate de no alterar las cuentas. Llevar a cabo SDS page y western blot para identificar la proteína de interés como control positivo en la condición opuesta.

Proteína Prop Pro conocida por unirse a Cal Modlin. Esta figura muestra un ejemplo de un ensayo de extracción de Cal Modlin que prueba la unión de Cal MODLIN de GFP TAG Neuro Grandin en comparación con el neuro Grandin endógeno. La entrada homogénea muestra que GFP neuro Grandin se expresó además de la neuro grandina endógena y la quinasa 2 dependiente de calmodulina cálcica, como se esperaba en función de la unión conocida de neuro Grandin endógeno.

Se aludió a Neuro Grandin marcado con GFP en ausencia de calcio y no se unió en presencia de calcio. Por el contrario, la quinasa dos dependiente de calmodulina cálcica de control se aludió solo en presencia de calcio y no se unió en su ausencia. Esto demuestra que las perlas de calmodulina funcionaban correctamente y que la UEE era eficiente.

Lo más importante es que esto muestra que la neuro sonrisa GFP se une a Apoch Cal Modlin de manera similar a la forma endógena, lo que sugiere que la etiqueta GFP no alteró la función de una proteína recombinante. Una vez que se domina esta técnica, sin incluir la página SDS y el análisis de sangre occidental, se puede terminar en seis horas cuando se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar etiquetar todas las muestras y tubos para la condición adecuada porque cualquier cambio en la concentración de calcio puede comprometer todo el experimento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar de manera eficiente la capacidad de proteínas particulares para unirse a un módulo CAL de una manera dependiente del calcio.

Recolectando las proteínas de interés, incubándolas con el comodulante SRO preparado adecuadamente, eludiendo las proteínas unidas y probándolas mediante análisis de sangre occidentales.