Seguimiento de señalización dentro de los agregados de células hipóxicas encapsulado

El objetivo general de este procedimiento es monitorizar la respuesta celular a la hipoxia en agregados celulares encapsulados en PEG. En el primer paso, las células dispersas se infectan con el virus marcador y luego se cultivan en un agitador para permitir la formación de agregados. La siguiente clavija lineal se funcionaliza y el borde PEG DM se purifica.

A continuación, los agregados celulares se encapsulan en un hidrogel PEG DM. Finalmente, los hidrogeles se cultivan en diversas condiciones de oxígeno mientras se monitorean con fluorescencia para detectar la señal del marcador de hipoxia. En última instancia, la ubicación y el alcance de la actividad del factor inducible por hipoxia dentro de agregados encapsulados viables de células se pueden visualizar a través de microscopía fluorescente simple.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la encapsulación celular y la administración terapéutica basada en células, como ¿Dónde se produce la hipoxia dentro de los cultivos 3D y cómo afecta a la supervivencia y la función celular? Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia los enfoques de la medicina regenerativa y la terapia de las deficiencias hormonales, como la diabetes, debido al gran impacto de la hipoxia en los tejidos agregados y encapsulados. Se ha demostrado que la actividad del factor uno inducible por hipoxia se correlaciona con una gran reducción de la secreción de insulina de las células beta, lo que motiva los intentos de disociar los ojales primarios y reformarlos en pseudo ojales.

Áridos de diámetro reducido. Nuestro marcador puede indicar la actividad del factor inducible por hipoxia con agregados a nivel celular dentro de cualquier material encapsulante suelto. Se eligió el PEG como material de cápsula debido a sus propiedades de transferencia favorables, compatibilidad con citos y la facilidad con la que se puede modificar funcionalmente.

Después de pesar dos gramos de PEG en un frasco de vidrio de 40 mililitros con aproximadamente 308 microlitros de metanfetamina, acrílico, anhídrido y cierre el frasco sin apretar con una tapa de plástico duro. Cocine el vial en el microondas a temperatura alta durante dos minutos en un microondas doméstico estándar. Luego, con guantes resistentes al calor, agite completamente el vial y cocine la solución en el microondas a temperatura alta durante cinco minutos adicionales.

Deje brevemente que el vial se enfríe lo suficiente como para manipularlo y luego destape mientras agita el vial. Mezcle lentamente el cloruro de metileno, agitando la muestra según sea necesario hasta que la solución parezca clara y homogénea. A continuación, agregue la solución gota a gota a 200 mililitros de éter datílico frío agitado para precipitar el PEG dm.

A continuación, recoja el PEG DM por filtración al vacío y déjelo secar. Una vez que el PEG DM se haya secado, disuélvalo en unos 100 a 150 mililitros de agua desionizada. A continuación, dialice la solución contra agua desionizada durante cinco días en un tubo de diálisis con un límite de peso molecular de 1000 Daltons después de la diálisis.

Coloque la solución en recipientes apropiados y congélelos a menos 80 grados centígrados durante la noche. A continuación, liofilizar la solución durante cuatro días para generar un polvo blanco purificado de PEG DM para liberar las células de la superficie del matraz de cultivo tratado. Primero, aspire el medio, enjuague las células con calcio de 37 grados CEL, HBSS libre de magnesio y aspire el HBSS.

Ahora agregue dos mililitros de viajes a 37 grados Celsius y solución de EDTA, y permita que las células se incuben a 37 grados Celsius durante tres minutos. A continuación, sacuda firmemente el lado del matraz para liberar las células a ocho mililitros a 37 grados centígrados, a medio del matraz, y pipetee vigorosamente la suspensión de células hacia arriba y hacia abajo. Teniendo cuidado de no introducir burbujas.

Después de transferir la solución celular a un tubo centrífugo estéril de 15 mililitros, cuente las células con un hemocitómetro para determinar el número total de células que se infectarán. Agregue el volumen necesario de suspensión celular para lograr 400, 000 células por pocillo en los pocillos de una placa de cultivo en suspensión de seis pocillos, alícuota 50 microlitros de HBSS por pocillo de células a infectar en un tubo de microcentrífuga de 1,8 mililitros. A continuación, pipetee con cuidado la cantidad adecuada de suspensión de virus en el HBSS preparado.

Ahora agregue el volumen apropiado de virus diluido a cada pocillo para lograr el MOI deseado y, a continuación, agregue medio a cada pocillo para aumentar el volumen total a 1,7 mililitros. Finalmente, coloque la placa en un agitador orbital Dentro de la incubadora, coloque el agitador en una configuración baja de aproximadamente 100 RPM para que el medio se lave suavemente alrededor del pocillo y permita que las celdas se agreguen durante 24 a 36 horas. Comience cortando la punta cónica de una jeringa de plástico de un mililitro y colocándola abierta en un estante para crear un recipiente en el que se formará el hidrogel.

A continuación, pipetee 20 microlitros de solución fotoactiva de PEG DM en el extremo abierto de la jeringa sobre el émbolo, asegurándose de que el volumen cubra toda la superficie del émbolo. Ajuste el émbolo en pequeños incrementos para lograr una superficie de fluido plana. Ahora vuelva a colocar la pipeta en la gradilla y colóquela debajo de una lámpara UV durante aproximadamente ocho minutos para permitir la reticulación del hidrogel.

Durante este tiempo, el volumen de pipeta contiene el número deseado de células y agregados en un tubo de microcentrífuga de 1,8 mililitros. Tapar el tubo y luego centrifugar las celdas y los agregados durante cinco minutos a 130 gs. Luego, con una micropipeta, retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el gránulo de celda en la punta del tubo.

A medida que el cabezal del medio se acerca al pellet, utilice una punta de pipeta más fina de 10 microlitros para dispersar uniformemente los agregados celulares por toda la solución precursora de gel y asegurarse de que estén completamente encapsulados. Es la parte más complicada de este procedimiento. Al realizar este paso, tenga cuidado de lijar y transferir el pellet suavemente.

Ahora, vuelva a suspender suavemente el pellet celular en 20 microlitros de la solución PEG DM fotoactiva. Con una punta de pipeta de boca ancha y agregue la suspensión celular a la jeringa encima de la porción de hidrogel reticulado, exponga la jeringa a ocho minutos adicionales de luz ultravioleta para completar la construcción del hidrogel. Al terminar, las celdas deben estar completamente encapsuladas dentro del hidrogel cilíndrico.

Finalmente, agregue un mililitro de HBSS en un pocillo de una placa de 24 pocillos y un mililitro de medio en otro. A continuación, expulse el hidrogel de la jeringa al HBSS para lavar brevemente el gel. Transfiera el gel al medio y cultive la placa en las condiciones deseadas.

En cualquier punto durante el cultivo, se pueden obtener imágenes de las células mediante microscopía fluorescente para rastrear el inicio del lugar de señalización hipóxica, la placa de 24 pocillos en la etapa del microscopio, centrando el pocillo con el hidrogel debajo del objetivo. La señal es lo suficientemente específica como para identificar las células de señalización individuales, pero la resolución puede ser inadecuada para determinar la localización de la señal intracelular. En las células de señalización, la señal se observa típicamente de manera uniforme en todo el citoplasma.

Esta figura muestra un ejemplo representativo de agregados minx encapsulados en un hidrogel PEG dentro de la celda de gel. Los agregados deben estar completamente encerrados en la matriz y distribuidos homogéneamente para permitir un mejor transporte de nutrientes, como se ve aquí. Observe cómo el gel de reticulación es sólido en todo momento, tomando la forma del recipiente en el que se realizó la reacción.

En esta figura, se muestra la señalización representativa de hipoxia fluorescente en un mínimo de seis células agregadas en un hidrogel PEG DM, células que se encapsularon y luego se colocaron en incubación al 20% de oxígeno durante 44 horas. En la imagen de la izquierda no muestran señales de hipoxia, mientras que las células que se encapsularon y luego se incubaron en oxígeno al 2% durante 44 horas. Como se muestra en la pantalla de la derecha, la hipoxia de señal ubicua clara también se puede rastrear en otros tipos de células.

Esta figura muestra la señalización hipóxica representativa en agregados de células madre mesenquimales encapsuladas. Como se ve en la figura de la izquierda, la señal fluorescente no es detectable a las 12 horas en 2% de oxígeno, luego, como se ve en la figura central, es más evidente después de 24 horas y 2% de oxígeno. Y finalmente, como se ve a la derecha se expresa altamente después de 96 horas y 2%oxígeno siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos como Eliza, el análisis de proteínas secretadas y los ensayos de viabilidad celular para correlacionar la señalización hipóxica con el fenotipo celular. Con este desarrollo, esta técnica podría allanar el camino para que los investigadores en los campos de la ingeniería de tejidos y la administración terapéutica basada en células exploren la función de supervivencia y la diferenciación de las células dentro de andamios y materiales de encapsulación.