Seguimiento de señalización dentro de los agregados de células hipóxicas encapsulado

El objetivo general de este procedimiento es monitorear la respuesta celular a la hipoxia en agregados celulares encapsulados en PEG. En el primer paso, las células dispersas se infectan con el virus marcador y luego se cultivan en un agitador para permitir la formación de agregados. A continuación, el peg lineal se funcionaliza y se purifica el dímero de PEG DM.

Luego, los agregados celulares se encapsulan en un hidrogel de PEG DM. Finalmente, los hidrogeles se cultivan en diversas condiciones de oxígeno mientras se monitorea mediante fluorescencia la señal del marcador de hipoxia. En última instancia, la ubicación y el grado de actividad del factor inducible por hipoxia dentro de agregados celulares viables encapsulados pueden visualizarse mediante microscopía fluorescente sencilla.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de encapsulación celular y entrega terapéutica basada en células, como por ejemplo: ¿Dónde ocurre la hipoxia dentro de los cultivos tridimensionales y cómo afecta la supervivencia y función celular? Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia enfoques de medicina regenerativa y terapia de deficiencias hormonales, tales como la diabetes tipo 1, debido al gran impacto de la hipoxia en tejidos agregados y encapsulados. Se ha demostrado que la actividad del factor inducible por hipoxia uno se correlaciona con una secreción de insulina considerablemente reducida a partir de células beta, lo que motiva los intentos de disociar islotes primarios y reformarlos en islotes pseudo.

Agregados de diámetro reducido. Nuestro marcador puede indicar la actividad del factor inducible por hipoxia mediante agregados a nivel celular dentro de cualquier material encapsulante suelto. Se eligió el PEG como material de la cápsula debido a sus favorables propiedades de transferencia, compatibilidad citoplasmática y la facilidad con la que puede modificarse funcionalmente.

Después de pesar dos gramos de PEG en un vial de vidrio de 40 mililitros, agregue aproximadamente 308 microlitros de metacrilico anhídrido y cierre parcialmente el vial con una tapa de plástico duro. Someta el vial a microondas a potencia máxima durante dos minutos en un microondas doméstico estándar. Luego, usando guantes resistentes al calor, vortexe completamente el vial y sométalo nuevamente a microondas la solución a potencia máxima durante cinco minutos adicionales.

Deje enfriar brevemente el vial lo suficiente como para poder manipularlo, luego desenrosque la tapa mientras gira suavemente el vial. Incorpore lentamente cloruro de metileno, agitando la muestra en vórtex según sea necesario hasta que la solución aparezca clara y homogénea. A continuación, añada la solución gota a gota a 200 mililitros de éter dietílico frío bajo agitación para precipitar el PEG dm.

Luego, recupere el PEG DM mediante filtración al vacío y déjelo secar. Una vez que el PEG DM esté seco, disuélvalo en aproximadamente de 100 a 150 mililitros de agua desionizada. A continuación, diализar la solución frente a agua desionizada durante cinco días en tubos de diálisis con un límite de exclusión de peso molecular de 1000 Daltons tras la diálisis.

Transferir la solución a recipientes adecuados y congelarlos a menos 80 grados Celsius durante la noche. Luego, liofilizar la solución durante cuatro días para obtener un polvo blanco purificado de PEG DM para liberar las células de la superficie del frasco de cultivo tratado. Primero, aspirar el medio, lavar las células con HBSS libre de calcio y magnesio a 37 grados Celsius y aspirar el HBSS.

Ahora agregue dos mililitros de trips a 37 grados Celsius y solución de EDTA, y deje que las células se incuben a 37 grados Celsius durante tres minutos. Luego golpee firmemente el costado del matraz para desprender las células y agregue ocho mililitros de medio a 37 grados Celsius al matraz, pipeteando vigorosamente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo, teniendo cuidado de no introducir burbujas.

Después de transferir la solución celular a un tubo cónico estéril de 15 mililitros, cuente las células mediante un hemocitómetro para determinar el número total de células que se infectarán. Añada el volumen necesario de suspensión celular para obtener 400.000 células por pocillo en los pocillos de una placa de cultivo en suspensión de seis pocillos; alícuote 50 microlitros de HBSS por pocillo de células a infectar en un tubo microcónico de 1,8 mililitros. A continuación, pipetee cuidadosamente la cantidad adecuada de suspensión vírica en el HBSS preparado.

Ahora, agregue el volumen adecuado del virus diluido a cada pocillo para alcanzar la MOI deseada, y luego añada medio a cada pocillo hasta completar un volumen total de 1,7 mililitros. Finalmente, coloque la placa sobre un agitador orbital dentro del incubador, ajuste el agitador a una velocidad baja de aproximadamente 100 RPM para que el medio lave suavemente el interior del pocillo y permita que las células se agreguen durante 24 a 36 horas. Comience cortando la punta cónica de una jeringa plástica de un mililitro y colóquela con la abertura hacia arriba en un soporte para crear un recipiente en el cual se formará el hidrogel.

A continuación, pipetee 20 microlitros de solución de PEG DM fotoactiva en el extremo abierto de la jeringa, directamente sobre el émbolo, asegurándose de que el volumen cubra toda la superficie del émbolo. Ajuste el émbolo en pequeños incrementos para lograr una superficie plana del líquido. Ahora coloque la pipeta nuevamente en el soporte y coloque el soporte debajo de una lámpara UV durante aproximadamente ocho minutos para permitir la reticulación del hidrogel.

Durante este tiempo, pipetee el volumen que contiene el número deseado de células y agregados en un tubo microcentrífugo de 1,8 mililitros. Tape el tubo y luego centrifugue las células y los agregados durante cinco minutos a 130 ×g. A continuación, utilizando una micropipeta, retire cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el botón celular en la punta del tubo.

A medida que la punta del medio se acerque al precipitado, utilice una punta de pipeta más fina de 10 microlitros para distribuir uniformemente los agregados celulares en toda la solución precursora del gel, asegurándose de que queden completamente encapsulados. Esta es la parte más complicada de este procedimiento. Al realizar este paso, tenga cuidado de resuspender y transferir suavemente el precipitado.

Ahora, resuspenda suavemente el sedimento celular en 20 microlitros de la solución de PEG DM fotoactiva. Utilizando una punta de pipeta de boca ancha, agregue la suspensión celular a la jeringa sobre la porción de hidrogel reticulado y exponga la jeringa a ocho minutos adicionales de luz UV para completar la construcción del hidrogel. Al finalizar, las células deben estar completamente encapsuladas dentro del hidrogel cilíndrico.

Finalmente, agregue un mililitro de HBSS en un pocillo de una placa de 24 pocillos y un mililitro de medio a otro. A continuación, expulse el hidrogel de la jeringa dentro del HBSS para lavar brevemente el gel. Transfiera el gel al medio y cultive la placa bajo las condiciones deseadas.

En cualquier momento durante el cultivo, las células pueden observarse mediante microscopía de fluorescencia para rastrear el inicio de la señalización hipóxica; coloque la placa de 24 pocillos sobre la platina del microscopio, centrando el pocillo con el hidrogel bajo el objetivo. La señal es lo suficientemente específica como para identificar células individuales en señalización, aunque la resolución podría ser inadecuada para determinar la localización intracelular de la señal. En las células que presentan señalización, la señal se observa típicamente de forma uniforme en todo el citoplasma.

Esta figura muestra un ejemplo representativo de agregados minx encapsulados en un hidrogel de PEG dentro de la celda de gel. Los agregados deben estar completamente encerrados en la matriz y distribuidos de manera homogénea para permitir un mejor transporte de nutrientes, como se observa aquí. Observe cómo el gel reticulado es sólido en toda su extensión, adoptando la forma del recipiente en el que se llevó a cabo la reacción.

En esta figura se muestra la señalización fluorescente representativa de hipoxia en células min six agregadas en un hidrogel de PEG DM, células que fueron encapsuladas y luego incubadas al 20 % de oxígeno durante 44 horas. Las imágenes de la izquierda no muestran señalización de hipoxia, mientras que las células que fueron encapsuladas y luego incubadas al 2 % de oxígeno durante 44 horas, como se muestra a la derecha, exhiben una señal clara y ubicua. La hipoxia también puede rastrearse en otros tipos celulares.

Esta figura muestra una señalización hipóxica representativa en agregados de células madre mesenquimales encapsuladas. Como se observa en la figura de la izquierda, la señal fluorescente no es detectable a las 12 horas en un 2% de oxígeno; luego, como se ve en la figura central, es más evidente después de 24 horas y 2% de oxígeno. Y finalmente, como se muestra a la derecha, está altamente expresada después de 96 horas y 2% de oxígeno siguiendo este procedimiento.

Otros métodos como ELISA, análisis de proteínas secretadas y ensayos de viabilidad celular pueden realizarse para correlacionar la señalización hipóxica con el fenotipo celular. Con este avance, esta técnica podría allanar el camino para que investigadores en los campos de la ingeniería de tejidos y la administración de terapias basadas en células exploren la función de supervivencia y la diferenciación de células dentro de andamios y materiales de encapsulación.