Células vivas imágenes de la migración de las células que expresan proteínas de fluorescencia etiquetado en una matriz tridimensional

Procesos celulares, tales como la migración celular tradicionalmente han sido estudiados en dos dimensiones, las superficies de plástico rígido. Este informe describe una técnica para visualizar de manera directa la localización de proteínas y el análisis de la dinámica de proteínas en las células que migran de una manera más fisiológicamente relevantes, matriz tridimensional.

Esta demostración tiene como objetivo obtener imágenes de proteínas marcadas con fluorescencia en células vivas en una matriz 3D. En primer lugar, generar líneas celulares estables que expresen proteínas marcadas con fluorescencia. Siembra estas células en una matriz de colágeno en 3D, luego adquiere imágenes de lapso de tiempo de las células migratorias usando un microscopio confocal.

En última instancia, los resultados iluminan la localización y la dinámica de las proteínas dentro de las células migratorias a través de imágenes de lapso de tiempo y análisis de FP, observando la dinámica y la localización de proteínas en 3D y en tiempo real. Ofrece una vía para abordar cuestiones fundamentales en la migración celular. Por ejemplo, ¿cómo se regulan los contactos adhesivos mediante proteínas citoplasmáticas?

Y también cómo estos contactos son perturbados por inhibidores específicos. En una placa P 35, las células de cultivo con una fluidez del 80 al 90% transfectan las células con el plásmido de interés utilizando lipo 2000 según las instrucciones del fabricante. A continuación, coloque las células en una incubadora.

Al día siguiente, divida las células en dos placas de Petri P one 50 e incube durante la noche. Reponga el medio para agregar 50 microgramos por mililitro de G 4 18. Continuar el cultivo bajo selección de antibióticos durante dos semanas.

Examine el cultivo en busca de 18 colonias resistentes. A continuación, utilizando un microscopio fluorescente invertido. Identifique y marque las colonias positivas para GFP.

Lave las celdas dos veces con PBS. Después del segundo lavado, deje una fina capa de líquido para evitar que las células se sequen para cada colonia marcada. Limpie lo más cerca posible alrededor del borde con un hisopo de algodón esterilizado y pipetee 10 microlitros de tripsina en la colonia.

Repita rápidamente para cada colonia. A continuación, incubar la placa a 37 grados centígrados para el desprendimiento de las células. Verifique la apariencia redonda bajo un microscopio.

Agregue 10 microlitros de tripsina en cada colonia, pipetee para separar completamente las células de la placa. Luego, transfiera cada colonia de células a un solo pocillo de un cultivo de placa de 24 pocillos para amplificar las colonias estables. A continuación, evalúe la expresión proteica de las colonias utilizando Western blot estándar e inmunofluorescencia.

Expanda las líneas celulares seleccionadas Modificación de la superficie del vidrio. El plato inferior permite una unión óptima del colágeno. Pipetear 300 microlitros de solución de silosación en la porción de vidrio de cada plato P 35 con una abertura de 10 milímetros.

Incubar durante una hora a temperatura ambiente. Aspire la solución y lave con agua filtrada tres veces durante 10 minutos cada una. Retire el agua y coloque los platos en una placa caliente de 50 grados centígrados durante 1,5 horas.

Coloque la parte superior de los platos ligeramente alejada del plato para permitir que se sequen. Después de que los platos secos se hayan enfriado, pipetee 300 microlitros de solución de glutaraldehído al 2% en la porción de vidrio de cada plato. Incubar durante una hora, luego lavar con PB S3 veces durante 10 minutos cada una.

Proceda a esterilizar los platos mediante la exposición a la luz ultravioleta durante una hora. Primer pellet de 100 microlitros de partículas trazadoras fluorescentes por centrifugación. Deseche el líquido y vuelva a suspender las partículas en 500 microlitros de medio.

Realice cinco lavados, luego vuelva a suspender las partículas en 30 microlitros de medio. A continuación, recoja las células que expresan GFP utilizando tripsina y prepare una suspensión de 2 millones de células por mililitro en una pipeta de tubo einor de 240 microlitros de medio de crecimiento. Agregue 12,6 microlitros de montones de un molar, 20 microlitros de agua filtrada, 50 microlitros de solución celular y 10 microlitros de partículas fluorescentes.

Por último, agregue 167 microlitros de colágeno de dermis bovina, una solución mezcle bien la solución. Ahora transfiera 80 microlitros a la porción de vidrio del plato en silos preparado. Incubar a 37 grados centígrados durante 50 minutos para que el gel se polimerice.

A continuación, añada con cuidado dos mililitros de sustrato. Equilibre la cámara del microscopio a una temperatura de estado estable de 37 grados centígrados para reponer el medio celular. Para mantener un pH neutro para las imágenes DIC, cambie la parte superior de la placa por una tapa de vidrio con una tira delgada de paraforma.

Cubra el costado del plato para evitar la evaporación para un objetivo de inmersión en aceite. Coloque una gota de líquido de inmersión en la posición del objetivo. El gel de colágeno que contiene la placa en la etapa del microscopio para que la placa entre en contacto con el líquido de inmersión.

Enfoque la muestra y busque las celdas de interés para la imagen para minimizar la deriva de la etapa. Deje que el plato se asiente durante unos 45 minutos. Antes de iniciar una captura larga, especifique los parámetros de adquisición de imágenes para los experimentos de adición de inhibidores.

Prepare los medios suplementados con el fármaco a la concentración de trabajo deseada. Reponga el medio celular para mantener un pH neutro, pero no selle con perfil. Transfiera la muestra al microscopio y proceda con la toma de imágenes en el momento del tratamiento farmacológico.

Detenga la imagen, capture y retire con cuidado la parte superior del plato sin alterar el plato. Aspire el medio y pipetee el medio que contiene el medicamento en la placa. Luego, vuelva a colocar el plato con cuidado.

La configuración de la capa superior varía según el sistema. Por lo tanto, consulte las instrucciones del fabricante. Primero establezca los parámetros para la obtención de imágenes de células vivas.

Para el fotoblanqueo. Pruebe estos parámetros en celdas de práctica para obtener suficiente potencia láser para fotoblanquear la señal fluorescente sin dañar la célula. A continuación, inicie la captura de imágenes en la muestra adquiriendo al menos cinco fotogramas.

A continuación, fotoblanquea la región de interés. Continúe capturando durante el tiempo de recuperación. Mida la intensidad fluorescente promedio del área fotoblanqueada antes y después del fotoblanqueo a lo largo del tiempo, utilizando un software de análisis estadístico.

Ajusta la curva de recuperación a la ecuación exponencial. Obtenga los parámetros de medio tiempo e intensidad final a partir de la curva de ajuste exponencial. A continuación, calcule la fracción móvil tomando la relación entre las intensidades de fluorescencia final e inicial.

Estas imágenes 3D de células vivas muestran células epiteliales sanas que expresan actina GFP. Después de cuatro días de cultivo, estas células formaron un quiste en una matriz de colágeno 3D. Algunas células migraron a lo largo de la superficie del quiste, mientras que otras migraron dentro del interior del quiste.

La deformación de la matriz como resultado de las fuerzas de tracción ejercidas por las células migratorias, se analiza a través del desplazamiento de las partículas trazadoras incrustadas en la matriz circundante. Aquí se muestra el efecto de la inhibición de la quinasa RO sobre la fuerza de tracción. Los movimientos de las partículas trazadoras se muestran como una imagen de proyección máxima de diferentes puntos de tiempo y cada punto de tiempo está pseudocoloreado.

Alternativamente, las imágenes de una partícula trazadora individual se muestran como un montaje para mostrar el movimiento de la partícula trazadora. Con el tiempo, esta partícula trazadora se acercó y se alejó del borde de salida de la célula migratoria antes y después de la adición de Y 2 7 6 3 2 respectivamente. El análisis frap sigue a las células que expresan actina GFP a medida que migran en una matriz tridimensional que indica una recuperación de fluorescencia típica. Después de un experimento de fotoblanqueo en configuraciones de láser optimizadas, la intensidad de fluorescencia de la región de interés disminuye visiblemente en comparación con el nivel de fondo, al tiempo que se mantienen las células sanas y sin daños.

Este gráfico muestra el ajuste de la curva de recuperación con una función exponencial. Una vez dominado, la siembra de las células en la matriz puede llevar una hora. No olvide que trabajar con trimetilo de tres aminoácidos propil, puede ser extremadamente peligroso.

Por lo tanto, tome precauciones como trabajar en la campana química. Recuerde también mantener condiciones estériles cuando trabaje con células en una matriz 3D.