Células vivas imágenes de la migración de las células que expresan proteínas de fluorescencia etiquetado en una matriz tridimensional

Esta demostración tiene como objetivo obtener imágenes de proteínas marcadas con fluorescencia en células vivas dentro de una matriz 3D. Primero, genere líneas celulares estables que expresen proteínas marcadas con fluorescencia. Siembre estas células en una matriz de colágeno 3D y luego adquiera imágenes de tiempo récord de células migrantes utilizando un microscopio confocal.

En última instancia, los resultados iluminan la localización y dinámica de proteínas dentro de células migratorias mediante imágenes de lapso de tiempo y análisis de proteínas fluorescentes, observando la dinámica y localización proteica en 3D y en tiempo real. Ofrece una vía para abordar preguntas fundamentales en la migración celular. Por ejemplo, ¿cómo regulan las proteínas citoplasmáticas los contactos adhesivos?

Y también cómo se ven perturbados estos contactos por inhibidores específicos. En una cultura en placa P 35 con células al 80-90 % de confluencia, transfecte las células con el plásmido de interés utilizando lipo 2000 según las instrucciones del fabricante. A continuación, coloque las células en un incubador.

Al día siguiente, divida las células en dos placas de Petri P150 e incube durante la noche. Reponga el medio añadiendo 50 microgramos por mililitro de G418. Continúe el cultivo bajo selección con antibiótico durante dos semanas.

Examine el cultivo en busca de colonias resistentes a G cuatro 18. Luego, utilizando un microscopio fluorescente invertido, identifique y marque las colonias positivas para GFP.

Lave las células dos veces con PBS. Después del segundo lavado, deje una capa delgada de líquido para evitar que las células se sequen en cada colonia marcada. Pase un hisopo de algodón esterilizado lo más cerca posible del borde y agregue 10 microlitros de tripsina sobre la colonia mediante pipeta.

Repita rápidamente para cada colonia. Luego incube la placa a 37 grados centígrados para la desprendimiento celular. Verifique la apariencia redonda bajo un microscopio.

Añada 10 microlitros de tripsina sobre cada colonia, pipetee para desprender completamente las células de la placa. Luego, transfiera cada colonia de células a un pozo individual de una placa de cultivo de 24 pozos para amplificar colonias estables. A continuación, evalúe la expresión proteica de las colonias mediante western blot estándar e inmunofluorescencia.

Amplíe la modificación de la superficie de las líneas celulares seleccionadas en el vidrio. El fondo del platillo permite una unión óptima del colágeno. Pipetee 300 microlitros de solución de silanización sobre la porción de vidrio de cada platillo P 35 con una abertura de 10 milímetros.

Incubar durante una hora a temperatura ambiente. Aspirar la solución y lavar con agua filtrada tres veces durante 10 minutos cada vez. Eliminar el agua y colocar las placas en una placa calefactora a 50 grados centígrados durante 1,5 horas.

Coloque las tapas de las placas ligeramente separadas para permitir el secado. Una vez que las placas estén secas y se hayan enfriado, agregue por pipeta 300 microlitros de solución de glutaraldehído al 2 % sobre la parte de vidrio de cada placa. Incube durante una hora, luego lave con PBS tres veces durante 10 minutos cada vez.

Proceda a esterilizar los recipientes mediante exposición a luz UV durante una hora. Primero, haga un pellet de 100 microlitros de partículas trazadoras fluorescentes mediante centrifugación. Deseche el líquido y resuspenda las partículas en 500 microlitros de medio.

Realice cinco lavados, luego resuspenda las partículas en 30 microlitros de medio. A continuación, recolecte las células que expresan GFP utilizando tripsina y prepare una suspensión de 2 millones de células por mililitro en un tubo einor. Pipetee 240 microlitros de medio de crecimiento. Añada 12,6 microlitros de hepes uno molar, 20 microlitros de agua filtrada, 50 microlitros de la solución celular y 10 microlitros de las partículas fluorescentes.

Por último, agregue 167 microlitros de colágeno de dermis bovina y mezcle bien la solución. A continuación, transfiera 80 microlitros a la porción de vidrio del platillo silanizado preparado. Incube a 37 grados centígrados durante 50 minutos para que el gel polimerice.

Luego, agregue cuidadosamente dos mililitros de medio de crecimiento. Equilibre la cámara del microscopio a una temperatura constante de 37 grados centígrados y reponga el medio celular. Para mantener un pH neutro durante la imagenología de contraste de interferencia diferencial (DIC), cambie la tapa del recipiente por una tapa de vidrio con una tira delgada de paraformaldehído.

Cubra el lateral del platillo para evitar la evaporación al usar un objetivo con inmersión en aceite. Coloque una gota de líquido de inmersión en la posición del objetivo. Coloque el gel de colágeno que contiene el platillo sobre la platina del microscopio de manera que el platillo haga contacto con el líquido de inmersión.

Enfoque la muestra y busque las células de interés para su imagen para minimizar la deriva del portaobjetos. Deje que el recipiente se asiente durante aproximadamente 45 minutos. Antes de iniciar una captura prolongada, especifique los parámetros de adquisición de imágenes para experimentos con adición de inhibidores.

Prepare el medio suplementado con el fármaco a una concentración de trabajo deseada. Renueve el medio celular para mantener un pH neutro, pero no selle con perfil. Transfiera la muestra al microscopio y continúe con la adquisición de imágenes en el momento del tratamiento con el fármaco.

Pausar la imagen, capturar y retirar cuidadosamente la tapa del recipiente sin perturbar el recipiente. Aspirar el medio y pipetear el medio que contiene el fármaco dentro del recipiente. Luego, reemplazar cuidadosamente el recipiente.

La configuración superior de frap varía entre los sistemas. Por lo tanto, consulte las instrucciones del fabricante. Primero establezca los parámetros para la imagenología de células vivas.

Para el fotoblanqueo. Pruebe estos parámetros en células de práctica para obtener una potencia láser suficiente que permita fotoblanquear la señal fluorescente sin dañar la célula. A continuación, inicie la captura de imágenes en la muestra adquiriendo al menos cinco cuadros.

Luego, realice el fotoblanqueo de la región de interés. Continúe capturando imágenes durante el tiempo de recuperación. Mida la intensidad fluorescente promedio del área fotoblanqueada antes y después del fotoblanqueo a lo largo del tiempo, utilizando un software de análisis estadístico.

Ajuste la curva de recuperación a la ecuación exponencial. Obtenga los parámetros del tiempo medio y de la intensidad final a partir de la curva de ajuste exponencial. Luego, calcule la fracción móvil tomando la relación entre las intensidades de fluorescencia final e inicial.

Estas imágenes de células vivas en 3D muestran células epiteliales sanas que expresan actina GFP. Después de cuatro días de cultivo, estas células formaron un quiste en una matriz tridimensional de colágeno. Algunas células migraron a lo largo de la superficie del quiste, mientras que otras migraron dentro del interior del quiste.

La deformación de la matriz como resultado de las fuerzas de tracción ejercidas por células migratorias se analiza mediante el desplazamiento de partículas trazadoras incrustadas en la matriz circundante. Aquí se muestra el efecto de la inhibición de la quinasa RO sobre la fuerza de tracción. Los movimientos de las partículas trazadoras se muestran como una imagen de proyección máxima de diferentes puntos temporales, y cada punto temporal se colorea con pseudocolores.

Alternativamente, las imágenes de una partícula trazadora individual se muestran como un mosaico para mostrar el movimiento de la partícula trazadora. Con el tiempo, esta partícula trazadora se movió hacia y lejos del borde posterior de la célula migratoria antes y después de la adición de Y 2 7 6 3 2, respectivamente. El análisis de frap sigue a células que expresan actina GFP mientras migran en una matriz tridimensional, indicando una recuperación típica de la fluorescencia. Tras un experimento de fotoablación en condiciones óptimas de láser, la intensidad de fluorescencia de la región de interés se reduce visiblemente en comparación con el nivel de fondo, manteniendo al mismo tiempo células sanas y no dañadas.

Este gráfico muestra el ajuste de la curva de recuperación con una función exponencial. Una vez dominado, sembrar las células en la matriz puede llevar una hora. No olvide que trabajar con tres amino propil trimetil puede ser extremadamente peligroso.

Por lo tanto, tome precauciones como trabajar en la campana química. También recuerde mantener condiciones estériles al trabajar con células en una matriz tridimensional.