Name: Amida de hidrógeno / deuterio intercambio y MALDI-TOF análisis de espectrometría de masas de Pak2 activación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Aprende a monitorizar el intercambio de hidrógeno/deuterio en la activación de la proteína quinasa Pak2 mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Este método revela la dinámica estructural y cambios conformacionales proteicos.

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Este trabajo es apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud Grant GM-26738 (a JAT).

1. Pak2 activación <ol><li> Añada la cantidad de pre-prueba de la caspasa 3 a 20 l de 12 mg / ml Pak2 en un buffer y (50 mM de TDT mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, y 2 a pH 7,5) se incuba a 34 ° C durante 30 minutos totalmente a romper, y Pak2 activar. </li><li> Analizar los productos de degradación por SDS-PAGE (10%) y la tinción Coommassie azul. </li><li> Agregue el Pak2 se pegaba a la activación de amortiguación B (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 15 mM MgCl 2, 10 mM ATP) a un pH de 7,5, en 20 l para una concentración final de 10 mg / ml Pak2, e incubar a 34 ° C durante 30 minutos para activar plenamente Pak2 por autofosforilación en 8 sitios. </li><li> Confirmar la ruptura completa de Pak2 por la migración de la p34 y p27 fragmentos según lo determinado por SDS-PAGE 10. Un adecuado control de las condiciones de la autofosforilación se hace a través de autorradiografía en un experimento separado con (32P) ATP o la espectrometría de masas para detectar fosfopéptidos. </li></ol> 2. Identificaciónde la pepsina-digeridos Pak2 Fragmentos <ol><li> Añadir 1 ml de 0,1% de ácido Trifluroacetic (TFA) a un pH de 2,5 a lavar las cuentas de agarosa dos veces antes de su uso. A continuación, centrifugar las muestras de 15 segundos a 2.000 xg para extraer las bolas. </li><li> Añadir Pak2 (20 mg en 2 l de 150 mM NaCl, 50 mM de TDT mM Tris-HCl y 2 a pH 7,5) a 100 l de TFA al 0,1%, e incubar la muestra durante 5 minutos con 30 l de pepsina conjugado bolas de agarosa . </li><li> Equilibrar una columna de HPLC en fase reversa C18 con un sistema solvente principal de 0,1% TFA a pH 2,5. El resumen de la pepsina (50 l) se eluye con un lineal de 100 min gradiente de 0 a 80% de acetonitrilo que contiene 0,1% de TFA en un caudal de 0,2 ml / min. Fracciones se recogen cada 2 minutos. </li><li> Seco de las fracciones HPLC con un Speed-Vac (3 h) y volver a suspender las muestras en una solución de acetonitrilo (5 l) y 0,1% de TFA (5 l) a pH 2,5. </li><li> Inicialmente, cada fracción se analiza para detectar péptidos utilizando el MALDI-TOF PerSeptive Biosystems Voyager STR DE (PE Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). </li><li> El 16 fracciones que contiene péptidos son sometidos a espectrometría de masas en tándem con un espectrómetro de masas Q-TOF y QSTAR XL oMALDI MS / MS para identificar los fragmentos. </li><li> La secuencia de cada péptido se verifica por los iones de producto generado por la espectrometría de masas en tándem con el teórico m / z de coeficientes basados ​​en la secuencia primaria de Pak2 utilizar el sitio de proteínas Prospector ( <a href="http://prospector.ucsf.edu/">http://prospector.ucsf.edu/</a> ) 11. </li></ol> 3. Medición de la Amida H / D intercambio <ol><li> Mantenga todas las soluciones y reactivos necesarios para H / D intercambio a 25 ° C en un baño de agua. ATP se disuelve en agua y el pH se ajustó a 7,0 antes de su uso. Los otros 4 mM de ATP en el buffer D 2 O es evitar ATP disociada de Pak2 después de la dilución. </li><li> Iniciar H / D intercambio mediante la adición de 18 l de tampón D 2 O (50 mM MOPS pH 6.98, 125 mM NaCl) a 2 l (20 mg) De Pak2 en un tampón que contiene 150 mM NaCl, 50 mM de TDT mM Tris-HCl (pH 7.5) y 2, resultando en un nivel Pak2 de 10 mg / ml y un pH de 7,0 a 0 ° C. </li><li> Incubar las muestras por triplicado en el intercambio H / D de 0, 0,5, 1, 3, 5 y 10 minutos, o 24 h. </li><li> Apagar el proceso de H / D intercambio mediante la adición de 180 l de helado de TFA 0,1% a un pH de 2,2, lo que eleva el pH a 2,5 en un volumen final de 200 microlitros. Para las muestras que contienen ATP, 180 l de TFA helada 0,11% a un pH de 2,2 se utiliza para mantener el pH a 2,5 en la condición de temple. </li><li> Añadir un volumen (100 l) de cada muestra apagado a 30 l de la pepsina activa conjugado bolas de agarosa. La digestión de la pepsina se le permite continuar en el hielo durante cinco minutos y las muestras se agitaron cada 30 segundos. </li><li> Terminar la digestión por centrifugación de la muestra durante 15 segundos a 5000 xg a 4 º C para eliminar la pepsina. </li><li> Rápidamente congelar las muestras en N2 líquido y se almacena a -80 ° C durante no más de 2días antes de MALDI-TOF análisis. </li><li> La matriz de MALDI es de 5 mg / ml de α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA) disuelto en una solución (1:1:1) de acetonitrilo, etanol y 0,1% de TFA a pH 2,5 y se mantiene a 0 º C. </li><li> Parcialmente descongelar cada muestra de forma rápida y mezclar 1 l de cada muestra con una l de la matriz y el lugar en un 4 º C MALDI placa objetivo. </li><li> Aplicar un vacío moderado a secar la placa en los puntos 30 segundos antes de MALDI-TOF análisis. El tiempo entre la descongelación de la muestra y la recuperación de espectro es de unos 3 min. </li><li> Adquirir MALDI-TOF espectros de masas con un PerSeptive STR Biosystems Voyager DE. La adquisición de datos a una velocidad de muestreo de 2 GHz a 100.000 canales de datos, con una tensión de 20.000 V la aceleración, y una tensión de red 65% mediante la extracción de retraso con un retraso de pulso de 180 ns. Un centenar de las exploraciones se hacen un promedio de 2 min. El instrumento MALDI-TOF no se limita a cualquier marca o cualquier otro software en particular. </li><li> Use el Explorador de datos del programa informático de 4,0 a calculse comió la deuteración de cada fragmento. </li><li> Calcule el cambio de nuevo sobre la base de la relación entre el número real de deuterón incorporado a las 24 horas de H / D intercambio dividido por todos los sitios posibles canjeables, que son las amidas de columna vertebral, excepto la amida N-terminal (Figura 1). </li></ol> 4. Los resultados representativos: La escisión de la caspasa y la autofosforilación son verificados por SDS-PAGE tinción Commassie. Pak2 inactiva es una sola banda de 58 kDa. División de la caspasa Pak2 es completa, y produce dos fragmentos, p27 y p34 que migran por separado. La migración de p27 y p34 autophosphorylated muestra una superposición en el gel debido a la migración retardada de la completamente fosforilados p27 fragmento (Figura 2). H / D intercambio experimentos se llevan a cabo varias veces entre 0 y 10 min (Figura 3). A modo de ejemplo, el curso temporal de la incorporación de deuterio en el m / zpEAK 1697.85 de Pak2 inactiva está compuesta de múltiples picos isotópicos como lo muestra el desplazamiento de la masa sobre el paso del tiempo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig1.jpg" /> Figura 1. La ecuación para el cálculo de la deuteración. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig2.jpg" /> Figura 2. Autofosforilación y la escisión de la caspasa Pak2. Caspasa-escindida Pak2 (carril izquierdo), Pak2 intacta inactivo (carril central) y la caspasa-escindida autophosphorylated Pak2 (carril derecho) fueron analizados por SDS-PAGE y tinción Coommassie azul. Adaptado de Hsu, YH et al 2. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig3.jpg" /> Figura 3. Espectro de masas de un curso de tiempo de la incorporación de deuterio, para Pak2 inactivo. Pak2 inactiva fue sometido a H / D exchaESN de 00 a 10 min y se analizaron por MALDI-TOF. Un ejemplo de la amplia distribución isotópica de MALDI-TOF de pico m / z 1697.85 durante el curso temporal de H / D intercambio se muestra. La línea roja punteada indica el promedio de la envolvente de la masa y el desplazamiento de la masa sobre la muestra deuteración de un péptido.

<ol><li>Anand, G. S., Hughes, C. A., Jones, J. M., Taylor, S. S., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amide+H%2F2H+exchange+reveals+communication+between+the+cAMP+and+catalytic+subunit-binding+sites+in+the+R%28I%29alpha+subunit+of+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22A.+J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase.</a> A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).</li>
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<li>Hsu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+binding+rigidifies+the+C2+domain+and+the+intradomain+interaction+of+GIVA+phospholipase+A2+as+revealed+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Calcium binding rigidifies the C2 domain and the intradomain interaction of GIVA phospholipase A2 as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 283, 9820-9827 (2008).</li>
<li>Lee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hPAK65+by+caspase+cleavage+induces+some+of+the+morphological+and+biochemical+changes+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Activation of hPAK65 by caspase cleavage induces some of the morphological and biochemical changes of apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13642-13647 (1997).</li>
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<li>Walter, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+and+activation+of+p21-activated+protein+kinase+gamma-PAK+by+CPP32+%28caspase+3%29.+Effects+of+autophosphorylation+on+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cleavage and activation of p21-activated protein kinase gamma-PAK by CPP32 (caspase 3). Effects of autophosphorylation on activity.</a> J. Biol. Chem. 273, 28733-28739 (1998).</li>
<li>Clauser, K. R., Baker, P., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+accurate+mass+measurement+%28%2B%2F-+10+ppm%29+in+protein+identification+strategies+employing+MS+or+MS%2FMS+and+database+searching%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching.</a> Anal. Chem. 71, 2871-2882 (1999).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Identificación de los fragmentos digeridos con pepsina es un paso crítico de la experiencia de H / D intercambio. Una incorrecta identificación de los péptidos puede llevar a una conclusión equivocada. Pak2 pepsina digerida se eluye a través de una columna HPLC en fase reversa C18 para obtener un fondo limpio. En nuestros experimentos, un total de 40 fracciones fueron recogidos y sometidos a MALDI-TOF. Múltiples péptidos podrían ser identificados en cada una de las fracciones. Los péptidos fueron sometidos a espectrometría de masas tándem (Q-TOF MS / MS y oMALDI MS / MS) para identificar sus secuencias. Los espectros MS / MS de un péptido debe tener al menos tres iones producto para confirmar la identificación de los péptidos. El Explorador de Datos programa de ordenador 4.0 (Applied Biosystems) realiza la corrección de línea de base inicial y filtración de ruido. Cada espectro deberá ser calibrado a partir de dos picos en secuencia. Calibramos nuestro espectro de la masa teórica de la undeuterated m / z que son 923,45 y 1.697,84. Tél precisión la masa después de la calibración puede llegar a 10 ppm. Al deuteración, el mono-isótopo puede cambiar a una masa mayor. Aumenta unitaria paso a estas relaciones m / z dado a las masas asociadas a una mayor deuteración. El pico de intensidad de la envoltura de masa no afectará el nivel de deuteración. Sin embargo, las intensidades de los picos isotópicos en un sobre de masas en particular son esenciales para el cálculo de la masa media. El primer paso para el cálculo del deuterón incorporado es restar la masa de péptidos de la muestra no deuterado de la muestra deuterado. Hay otros tres factores, el D 2 O de dilución, los deuterones residual en las cadenas laterales y el intercambio de nuevo, tendrá que ser consideradas en el cálculo (Figura 1). La dilución D 2 O es el factor de dilución de D 2 O después de mezclar la muestra y D 2 O de amortiguación para iniciar el intercambio H / D. El deuterón residual (4,5%) en las cadenas laterales de la pepsina de digerirpéptidos ed tiene que restarse. La parte posterior de intercambio es la inevitable pérdida de deuteración en todos los péptidos deuterado y la pepsina digerida en el proceso de medición de la masa. El péptido más accesible disolvente (m / z = 1105,60) después de 24 horas de H / D intercambio representa una región deuteración completo. El número deuterón incorporados para cada uno de los péptidos es la diferencia entre el centro de gravedad de los péptidos péptica deuterados y no deuterados-Pak2. Los más deuterado péptido m / z 1105 fue seleccionado para representar deuteración completa cuando Pak2 fue a las 24 horas de H / D intercambio. La Ecuación de Canje Volver fue calculado por el número real de deuterio incorporado a las 24 horas de H / D intercambio dividido por todos los sitios posibles canjeables en péptido m / z 1105.

<table border="1"></table><table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> Aldrich </td><td> 7789-20-0 </td><td></td></tr><tr><td> α-ciano-4-hidroxicinámico </td><td> Sigma </td><td> 28166-41-8 </td><td></td></tr><tr><td> MALDI-TOF </td><td> PE Biosystems </td><td> Voyager DE STR </td><td></td></tr><tr><td> Q-TOF espectrómetro de masas </td><td> Q-TOF Ultima-Global </td><td></td><td></td></tr><tr><td> QSTAR XL oMALDI MS / MS </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Data Explorer 4.0 programa de ordenador </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td></td></tr&gt; </tbody></table>

amida de hidrógeno / deuterio intercambio y maldi-tof análisis de espectrometría de masas de pak2 activación

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amida de hidrógeno / deuterio intercambio (H / D intercambio) acoplada a espectrometría de masas ha sido ampliamente utilizado para analizar la interfaz de las interacciones proteína-proteína, los cambios conformacionales de proteínas, dinámica de las proteínas y las interacciones ligando-proteína. H / D intercambio de las posiciones de columna vertebral amida se ha utilizado para medir las tasas de deuteración de las micro-regiones de una proteína por espectrometría de masas 1,2,3. La resolución de este método depende de la digestión con pepsina de la proteína de interés deuterado en péptidos que normalmente rango 3-20 residuos. Aunque la resolución de H / D intercambio medido por espectrometría de masa es menor que la resolución solo residuo medido por el heteronuclear único coherencia cuántica (HSQC) el método de RMN, espectrometría de masas de la medición de H / D intercambio no estará limitado por el tamaño de la proteínas 4. H / D intercambio se lleva a cabo en una solución acuosa que mantiene la conformación de proteínas. Ofrecemos un método que utilriza el MALDI-TOF para la detección de dos, en lugar de un sistema HPLC / ESI (ionización electrospray)-MS 5,6. El MALDI-TOF ofrece datos precisos sobre la intensidad de la masa de los péptidos de la proteína digerida, en este caso quinasa Pak2 proteína (también llamada γ-Pak). La proteólisis de Pak 2 se lleva a cabo en una digestión de la pepsina en línea. Este método alternativo, cuando el usuario no tiene acceso a una columna de HPLC y la pepsina conectado a la espectrometría de masas, o cuando la columna de la pepsina en HPLC no se traduce en un mapa de una digestión óptima, por ejemplo, la muy unidas por puentes disulfuro secreta fosfolipasa A 2 (sPLA2). Utilizando este método, hemos logrado controlar los cambios en el nivel deuteración durante la activación de la caspasa 3 Pak2 por división y la autofosforilación 7,8,9.

MALDI-TOF espectrometría de masas fue utilizada con éxito para controlar la amida hidrógeno / deuterio cambio en la activación de proteína quinasa Pak2.

Amida de hidrógeno / deuterio intercambio y MALDI-TOF análisis de espectrometría de masas de Pak2 activación

El intercambio de hidrógeno/deuterio de amidas (intercambio H/D) acoplado a la espectrometría de masas se ha utilizado ampliamente para analizar la interfaz de las interacciones proteína-proteína...

Este experimento demuestra cómo utilizar la espectrometría de masas para monitorear el intercambio de hidrógeno por deuterio asociado con proteínas. Los cambios estructurales que conducen a estados de activación primero escinden la proteína quinasa PAC2 mediante caspasa-3 y luego activan PAC2 mediante autofosforilación utilizando TP como sustrato; en un segundo paso, se digiere PAC2 con pepsina y se analizan los fragmentos proteolíticos de PAC2 mediante espectrometría de masas en tándem. A continuación, se analizan los patrones de intercambio de hidrógeno por deuterio de PAC2 mediante la técnica de molde apagado (mold off), monitoreando el nivel de deuteración de cada fragmento de PAC2. El nivel preciso de intercambio de hidrógeno por deuterio, determinado mediante análisis por molde, proporciona información importante sobre la escisión por caspasa-3 y la autofosforilación de PAC2.Este método puede ayudar a responder preguntas sobre la dinámica de proteínas, como los cambios conformacionales de las proteínas, las interacciones entre proteínas y ligandos, y las interacciones proteína-proteína. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la espectrometría de masas LCQ con intercambio de HD es instrumental. Este procedimiento no requiere un espectrómetro de masas acoplado a HPLC para analizar los resultados del intercambio de HD, y el procedimiento es fácil de operar para escindir 0,6 microgramos de PAC dos.Añada caspasa tres e incube la reacción a 34 grados Celsius durante 30 minutos. Verifique PAC dos y la escisión completa de PAC dos mediante el análisis de los productos por electroforesis en gel de SDS. Para la reacción de activación, añada el PAC dos escindido a 20 microlitros de tampón de activación B e incube a 34 grados Celsius durante 30 minutos.Utilice SDS-PAGE para confirmar la autofosforilación mediante la migración de los fragmentos P34 y P27. En primer lugar, lave dos veces las perlas de aro conjugadas con purina con un mililitro de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%. Diluya dos microlitros de 10 miligramos por mililitro. Prepare dos en 100 microlitros de TFA al 0,1%, añada 30 microlitros de las perlas de agro conjugadas con Pepsi lavadas y incube durante cinco minutos.Proceda a equilibrar una columna de fase reversa H-P-L-C-C 18 con TFA al 0,1 % a pH 2,5. A continuación, cargue el digesto de Pepin y diluya utilizando un gradiente lineal de 100 minutos. Recolecte fracciones cada dos minutos tras secar las fracciones de HPLC con un evaporador rotatorio.Suspenda las muestras en cinco microlitros de acetonitrilo y TFA al 0,1 % a pH 2,5. Como una cribado inicial, analice cada fracción en busca de péptidos mediante moldy para todas las fracciones que contengan péptidos.Identifique los fragmentos mediante espectrometría de masas en tándem. Utilice la función de producto MS en Protein Prospector para hacer coincidir los iones hijos y las relaciones teóricas de MZ basadas en la secuencia primaria de PAC dos. Primero equilibre todas las soluciones y reactivos para el intercambio de hidrógeno por deuterio.Inicie el intercambio de hidrógeno por deuterio añadiendo 18 microlitros de tampón D₂O a 2 microlitros de 10 miligramos por mililitro. Preparar dos, realizar las reacciones por triplicado a lo largo de un curso temporal. Detenga la reacción de intercambio de hidrógeno por deuterio con 180 microlitros de TFA al 0,1 % helado a pH 2,2.Ahora distribuya alícuotas de 100 microlitros de hidrógeno deuterado. Agregue dos alícuotas por cada 30 microlitros de perlas de agregado conjugado con pepina activadas. Incube la digestión con pepina en hielo durante cinco minutos.Agite mediante vórtex cada 30 segundos para finalizar eficazmente las reacciones de digestión mediante centrifugación, con el fin de eliminar rápidamente la pepsina. Congele las muestras en nitrógeno líquido antes de analizarlas. Prepare la matriz y almacénela a cero grados Celsius, descongele parcialmente cada muestra rápidamente.Mezcle un microlitro de muestra con un microlitro de matriz, luego aplique en una placa objetivo con moho a cuatro grados Celsius durante 30 segundos antes del análisis. Aplique un vacío moderado sobre la placa para secar. Los puntos continúan adquiriendo espectros de masas promediando 100 escaneos en dos minutos.Proceda a utilizar el programa informático Data Explorer 4.0 para calcular la duración de cada fragmento. Luego, calcule el intercambio inverso basado en la relación entre el intercambio incorporado realmente debido a un número a las 24 horas de intercambio de hidrógeno deuterio dividido por todos los sitios intercambiables posibles, que son las amidas del armazón, excepto la amida terminal final. En este ejemplo, la escisión y la autofosforilación de CASP Bay se verifican mediante tinción de SDS page Kumasi.El PAC2 inactivo no fosforilado es una sola banda de 58 kilodaltons CASP bay's. La escisión del PAC2 es completa y produce dos fragmentos, P27, el dominio regulador, y P34, el dominio catalítico, tras la autofosforilación. La migración de P27 y P34 autofosforilados muestra una superposición en el gel de proteínas debido a la migración retardada del fragmento P27 completamente fosforilado en comparación con el PAC2 no fosforilado.Este espectro de masas muestra un curso temporal de incorporación de deuterio para el PAC dos inactivo. El pico MZ 1697.85 está compuesto por múltiples picos isotópicos, como lo indica el desplazamiento del envolvente de masas. Con el tiempo, la línea roja punteada indica el promedio del envolvente de masas, y el desplazamiento del envolvente muestra la duración de un péptido una vez dominado.Esta técnica puede completarse en dos días si se realiza correctamente. No olvide que trabajar con nitrógeno líquido puede ser extremadamente peligroso, por lo que debe tomar precauciones, como hacer un agujero en la tapa del tubo EOL de 1,5 ml antes de colocarlo en nitrógeno líquido.

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Biología

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Ensayo de la actividad de proteína quinasa con ATP radiomarcado

Este flujo de trabajo describe el rendimiento del enriquecimiento eficiente en tiempo y costo de múltiples modificaciones post-traduccionales de proteínas (PTF) simultáneamente para el análisis proteómico global cuantitativo. El protocolo utiliza el enriquecimiento de PTM a nivel de péptido con múltiples anticuerpos conjugados, seguido de un análisis de espectrometría de masas de adquisición independiente de datos para obtener información biológica sobre la conversación cruzada PTM.

Enriquecimiento de afinidad simultánea de dos modificaciones post-traduccionales para la cuantificación y la localización del sitio

Las síntesis de lanthipeptide catalizan las reacciones multipaso durante la biosíntesis de productos naturales péptidos. Aquí, describimos un flujo de trabajo continuo, ascendente, de intercambio de hidrógeno-deuterio de espectrometría de masas (HDX-MS) que se puede emplear para estudiar la dinámica de conformación de las sintesis de lanthipeptide, así como otras enzimas similares implicadas en la biosíntesis de productos naturales péptidos.

Una plataforma de espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX-MS) para investigar enzimas biosintéticas péptidos

El etiquetado isotópico de precursor combinado y el etiquetado isobárico (cPILOT) es una estrategia mejorada de multiplexación de muestras que es capaz de aumentar el número de muestras que se pueden analizar simultáneamente con las etiquetas isobáricas disponibles. La incorporación de una plataforma robótica ha aumentado considerablemente el rendimiento experimental, la reproducibilidad y la precisión cuantitativa.

Multiplexación automática de muestras mediante el etiquetado isotópico de precursor combinado y el etiquetado isobárico (cPILOT)

La capacidad de evaluar la participación objetivo de los inhibidores candidatos en las células intactas es crucial para el descubrimiento de fármacos. Este protocolo describe un ensayo de cambio térmico celular de formato de 384 pozos que detecta de forma fiable el compromiso de destino celular de inhibidores dirigidos a SHP2 de tipo salvaje o sus variantes oncogénicas.

Evaluación del compromiso de objetivos celulares por inhibidores de la fosfatasa SHP2 (PTPN11)

Aquí, presentamos un protocolo para el enriquecimiento de fosfoproteínas fosfatasas endógenas y sus proteínas que interactúan a partir de células y tejidos y su identificación y cuantificación mediante proteómica basada en espectrometría de masas.

Un enfoque basado en la espectrometría de masas para identificar fosfoproteínas fosfatasas y sus interactores

Aprende a monitorizar el intercambio de hidrógeno/deuterio en la activación de la proteína quinasa Pak2 mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Este método revela la dinámica estructural y cambios conformacionales proteicos.

Amida de hidrógeno / deuterio intercambio y MALDI-TOF análisis de espectrometría de masas de Pak2 activación

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