Análisis de la migración de la cresta neural y la diferenciación de las especies cruzadas Trasplante

El objetivo general de este procedimiento consiste en injertar un explante del tubo neural dorsal de un embrión de codorniz en un embrión de pollo de etapa coincidente, con el fin de rastrear la migración y el destino de las células de la cresta neural. Esto se logra primero rasgando un pequeño orificio en la membrana IGN del embrión de pollo huésped para acceder al tubo neural. Luego, se extrae el embrión donante de codorniz de su huevo para prepararlo para la escisión del injerto.

En el siguiente paso, se extrae la región de interés del tubo neural del embrión huésped. A continuación, se extrae una región similar del tubo neural del donante para el injerto. Luego, se trasplanta el tubo neural del donante al tubo neural del huésped.

Finalmente, el embrión quimérico se incuba hasta la etapa deseada para la detección de células llegadas de la cresta neural en el órgano de elección. En última instancia, la migración y diferenciación de las células de la cresta neural derivadas del donante hacia diversas ubicaciones en el embrión huésped puede visualizarse mediante microscopía de inmunofluorescencia. La demostración visual de este método es fundamental porque los pasos de microdisección y trasplante requieren habilidades motoras muy finas, lo que dificulta su aprendizaje.

Comience por lavar cualquier residuo de los huevos de pollo con agua tibia. Coloque los huevos horizontalmente sobre una bandeja y marque con un lápiz los lados superiores para indicar la región donde se localizará el embrión. Para la preparación X ovo de embriones donantes, incube las patas de codorniz con el lado romo hacia arriba.

A continuación, coloque los huevos en una incubadora húmeda a 38 grados Celsius y active la función de balanceo. Una vez finalizada la incubación, esterilice las superficies superiores rociándolas con etanol al 70 % y luego límpielas rápidamente con una toallita Kim. Para evitar cualquier absorción a través del cascarón, coloque cada huevo esterilizado sobre un soporte individual para huevo, similar al platillo de Petri forrado con toallitas Kim dobladas que se muestra aquí. Luego, utilizando pinzas AA esterilizadas, haga un pequeño orificio en la superficie superior del cascarón, en el extremo puntiagudo del huevo.

Equipe una jeringa de cinco mililitros con una aguja hipodérmica de calibre 18 y medio. Luego, con el bisel orientado hacia el extremo puntiagudo del huevo, inserte la aguja verticalmente en el orificio de la cáscara del huevo. Para evitar dañar accidentalmente la yema por succión, limpie el orificio con etanol al 70 % como antes y selle el orificio con cinta adhesiva transparente.

Luego, con la pinza de doble A, haga un orificio más en la superficie superior marcada de la pata horizontal, no exactamente en el ápice. A continuación, inserte un lado de la pinza de iris curva en el orificio, paralelo al huevo. Luego, presione hacia abajo sobre la cáscara y trabaje en movimiento circular.

Rompa una ventana de dos centímetros de diámetro en el huevo de gallina, deseche la cáscara de huevo removida. El embrión debe aparecer como un disco opaco encima de la yema. Deseche cualquier huevo no fertilizado identificado por un pequeño punto blanco en la superficie de la yema o por la ausencia del blástulo dérmico.

Ahora, mientras usa protección ocular adecuada, doble una aguja hipodérmica de calibre 26 y medio en un ángulo de 45 grados, comenzando desde la base de la aguja. Después de colocar la aguja doblada con el bisel hacia arriba en una jeringa de un mililitro, llene la aguja con tinta de la India diluida. Perfore la membrana del vitelo fuera del perímetro del blaster y deslice la punta de la aguja debajo del embrión, cerca de la superficie del vitelo, pero sin penetrar las capas embrionarias.

Luego, inyecte solo la cantidad de tinta necesaria para delinear el embrión y evite inyectar burbujas. Retire cuidadosamente la aguja. Ahora, utilizando un microscopio estereoscópico y una fuente de luz con carga térmica limitada, como la lámpara flexible de fibra óptica que se muestra aquí.

Clasifique los embriones según Hamburger y Hamilton. Registre la etapa en las cáscaras de los huevos. Luego, aplique dos o tres gotas de solución de Ringer estéril tibia sobre la superficie de los embriones para prevenir la deshidratación y la contaminación.

Luego, estire una película de parafina sobre la superficie de los huevos para sellar temporalmente las ventanas. A continuación, prepare los huevos de codorniz para el trasplante. Antes de retirar los huevos del incubador, llene una placa de Petri con solución de Ringer.

Luego, abra los huevos por el lado romo con pinzas curvas para revelar el embrión. Utilizando tijeras de disección, realice cuatro cortes en forma de cuadrado a través de la membrana de vellosidades y la capa externa del blastodermo, fuera del embrión, asegurándose de que todos los cortes se unan. A continuación, usando pinzas curvas de iris, sostenga suavemente un extremo cortado y levante el embrión del huevo, transfiriéndolo al recipiente de Petri preparado.

Finalmente, retire suavemente la membrana vitelina con pinzas número cinco y luego determine la etapa de los embriones bajo un microscopio estereoscópico. Retire la película de parafina del embrión de pollo huésped. A continuación, utilizando una aguja de tungsteno afilada, haga un pequeño orificio en la membrana VII en la región deseada del tubo neural.

Agregue una gota de solución de Ringer al embrión. A continuación, para injertos unilaterales, como el que se realiza en este video, utilice una aguja de vidrio vertida para realizar cuidadosamente incisiones transversales rostrales y caudales en la región del mesencéfalo del tubo neural, sin extenderse más allá de la luz. Luego, corte bilateralmente entre el tubo neural dorsal y el mesodermo parietal.

Finalmente, separe cuidadosamente el ex explante extirpado del tubo neural y luego retírelo del embrión aspirándolo hacia una micropipeta de vidrio. Primero, utilice un embrión de codorniz con coincidencia de estadio. Luego, extirpe una región del tubo neural de tamaño similar a la mostrada anteriormente y aspire el explante donante X hacia una micropipeta de vidrio que contenga solución de Ringer.

Transfiera el explante X adyacente a la región extirpada del hospedador de pollo. Luego, utilizando una aguja de vidrio estirada, oriente el explante guiándolo suavemente hacia la región ablada. Añada cuidadosamente unas gotas de solución de Ringer al embrión para prevenir la deshidratación.

Finalmente, selle la ventana con cinta adhesiva, asegurándose de que la cinta cierre completamente toda la región de la ventana en el huevo, y devuelva el huevo al incubador hasta alcanzar la etapa deseada. Mantenga desactivada la función de balanceo durante la incubación del kyira; el X puede girarse suavemente a mano dos veces al día para aumentar su viabilidad. Si se buscan etapas posteriores del desarrollo, esta imagen representativa de la región injertada del tubo neural tras seis horas de reincubación hasta la etapa HH 11 muestra la incorporación esperada del tejido donante de codorniz injertado en el tubo neural del embrión de pollo. Esta sección transversal a través de la región injertada en la etapa HH 11 muestra células de la cresta neural marcadas con hnk, una de ellas migrando lateralmente desde el tubo neural.

Las células de codorniz que contribuyen al torrente migratorio de las células de la cresta neural y al tubo neural están claramente marcadas con QCPN. En etapas posteriores, se puede rastrear el destino final de las células derivadas de la cresta neural de codorniz hasta su tejido objetivo. Como puede observarse en esta figura, las células marcadas con QCPN están intercaladas dentro del mesénquima del embrión de pollo en el proceso maxilar. En el estadio E5, el anticuerpo QCPN puede combinarse fácilmente con otros anticuerpos para examinar la diferenciación de las células de la cresta neural derivadas de codorniz.

En el entorno del huésped. Como se observa aquí, las neuronas sensoriales trigeminales derivadas de células de la cresta neural de codorniz están marcadas por los anticuerpos QCPN y T UJ uno. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como inmunohistoquímica e hibridación in situ para responder preguntas adicionales, como qué tejidos originan las células de la cresta neural y qué genes expresan las células de la cresta neural mientras se diferencian en diversos tejidos.