Name: El CYP2D6 Animal Modelo: cómo inducir a la hepatitis autoinmune en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Aprende a generar un modelo murino de hepatitis autoinmune mediante infección con adenovirus que expresa CYP2D6. Este método permite estudiar la inflamación hepática crónica y las respuestas inmunes específicas en ratones.

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Este trabajo es apoyado por el Goethe Hospital Universitario de Frankfurt y una beca de la Fundación Alemana de Investigación de la Universidad de California

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<li>Djilali-Saiah, I., Lapierre, P., Vittozi, S., Alvarez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+vaccination+breaks+tolerance+for+a+neo-self+antigen+in+liver%3A+a+transgenic+murine+model+of+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">DNA vaccination breaks tolerance for a neo-self antigen in liver: a transgenic murine model of autoimmune hepatitis.</a> J. Immunol. 169, 4889-4896 (2002).</li>
<li>Christen, U., Hintermann, E., Holdener, M., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+triggers+for+autoimmunity%3A+is+the+%27glass+of+molecular+mimicry%27+half+full+or+half+empty%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Viral triggers for autoimmunity: is the 'glass of molecular mimicry' half full or half empty.</a> J. Autoimmun. 34, 38-44 (2010).</li>
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<li>Hintermann, E., Bayer, M., Pfeilschifter, J., Christen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+delivery+of+the+liver+autoantigen+cytochrome+P450+2D6+chronically+activates+hepatic+stellate+cells+and+induces+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Manuscript+Submitted%22%5BJournal%5D)">Adenoviral delivery of the liver autoantigen cytochrome P450 2D6 chronically activates hepatic stellate cells and induces fibrosis.</a> Manuscript Submitted. , (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En estudios anteriores, la hepatitis experimental, se informó a menudo para ser sólo los actuales modelos transitorios y muchos de la enfermedad autoinmune del hígado depende de un protocolo de inducción más complejos de enfermedades (para revisiones, véase 3,5). Por ejemplo, varios modelos de uso de ratones transgénicos que expresan antígenos específicos de destino y adoptively transferido objetivo de antígeno-específicos, en su mayoría TCR transgénicos, las células T 14,15. A menudo una infección adicional con el virus de livertropic, bacterias o parásitos es necesario para inducir la enfermedad 16-18. Alternativamente, el ADN-la vacunación con plásmidos que codifican para antígenos diana, incluyendo CYP2D6 19, se utiliza para inducir la hepatitis. Sin embargo, una vacunación adicional con plásmidos que codifican para citoquinas pro-inflamatorias, como la IL-12, se requiere 20. Por desgracia, con pocas excepciones 15,20 hepatitis es sólo transitoria. El modelo del CYP2D6 6,21 utiliza un t método sencilloo inducir a la hepatitis autoinmune, simplemente infectar a los ratones con un adenovirus que expresa hCYP2D6, el autoantígeno mayor en la HAI-2 7,8. Entrega de CYP2D6 por un constructo de adenovirus garantiza tanto una focalización directa del hígado así como una inflamación local que promueve el desglose de la tolerancia. Es importante señalar sin embargo que tanto el título del virus, así como la vía de administración es crucial para este modelo. Por un lado, Ad-2D6 es un virus de replicación deficiente, por lo tanto, un título suficiente alta de virus se requiere para generar una cantidad crítica de antígeno dentro del hígado. Por otro lado, demasiado alto un título podría resultar en una insuficiencia hepática aguda fatal. Además, se ha demostrado previamente que la infección de ratones por títulos altos de adenovirus conduce a un agotamiento funcional de la respuesta inmune 22. En nuestro modelo, hemos utilizado una combinación de infección por vía intravenosa e intraperitoneal con el fin de obtener tanto la infiltración crónica celular, así como extLa fibrosis ensive. Hemos observado que la infección por vía intravenosa sola todavía provoca la infiltración celular masiva, pero no la fibrosis de la región subcapsular, lo que indica que la inflamación peritoneal, debido a la inyección intraperitoneal podrían estar involucrados en la continua acumulación subcapsular de colágeno (Hintermann y Christen, manuscrito en preparación). Sin embargo, es importante señalar que la fibrosis hepática observada es antígeno-específica, ya que no detectó la activación de las células estrelladas hepáticas y la deposición de colágeno después de la infección con la igualdad de virus títulos de Ad-GFP o Ad-Control de 23. El modelo de CYP2D6 refleja muchos aspectos de la humana 1,2 HAI, como la hepatitis crónica caracterizada por la infiltración celular y la persistencia de la fibrosis hepática 6. Además, la presencia de títulos elevados de anti-CYP2D6 anticuerpos con especificidad epítopo similar y extendiendo 13 a LKM-1 anticuerpos encontrados en la HAI-2 pacientes indica la presencia de un sistema común de reactividad autoinmune crónica. CYP2D6 es el principal antígeno en la HAI-2, pero no es reconocida por pacientes diagnosticados con el tipo más frecuente de una hepatitis autoinmune. Además, los pacientes que sufren de otras enfermedades del hígado de etiología autoinmune, como la cirrosis biliar primaria (CBP) o colangitis esclerosante primaria (PSC), generación de autoanticuerpos sello con la especificidad de distintos autoantígenos del hígado y el hígado muestran diferentes características patológicas de centrado en las pequeñas (PBC ) o grande (PSC), los conductos biliares. Sin embargo, los modelos de CYP2D6 ofrece la oportunidad de analizar mecanismos inmunopatológicos implicados en los procesos inflamatorios crónicos hepáticos, como ocurre en las enfermedades autoinmunes del hígado, para identificar a los actores clave que impulsan la destrucción autoinmune de los hepatocitos y evaluar posibles intervenciones terapéuticas para curar la enfermedad.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Aguja de 23G </td><td> BD Biosciences </td><td> 300800 </td><td></td></tr><tr><td> 27 ½ G aguja </td><td> VWR </td><td> 612-0151 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ½ aguja de calibre </td><td> BD Biosciences </td><td> 304000 </td><td></td></tr><tr><td> Alanina aminotransferasa tiras reactivas (GPT / ALT) </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 745 138 202 </td><td></td></tr><tr><td> Aspartato aminotransferasa tiras reactivas (GOT / AST) </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 745 120 202 </td><td></td></tr><tr><td> Anestesia Unidad Univentor 400 </td><td> <a href="http://www.agnthos.se" target="_blank" >AgnTho de</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Moldes de base, 37x24x10 mm desechables </td><td> VWR </td><td> 720-0208 </td><td></td></tr><tr><td> Celular filtro de 70mm </td><td> VWR </td><td> 734-0003 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Leica </td><td> CM1850 UV </td><td></td></tr><tr><td> Tubos capilares heparinizados </td><td> Pescador </td><td> 3123987 </td><td></td></tr><tr><td> Portaobjetos Superfrost Plus </td><td> Menzel Gläser </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Microtainer SST tubos </td><td> BD Biosciences </td><td> 365951 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de microtitulación, fondo en V </td><td> VWR </td><td> 391-1924 </td><td></td></tr><tr><td> Reflotron </td><td> Roche Diagnostics </td><td></td><td> Determiniation de AST / ALT </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Nombre of el reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> De conejo anti-ratón anti-colágeno tipo I IgG, </td><td> Chemicon </td><td> AB765P </td><td></td></tr><tr><td> Biotinilado de cabra anti-IgG de conejo </td><td> Vector (AXXORA) </td><td> VC-BA-1000-MC15 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-conjugado de anticuerpos de ratón anti CD8a </td><td> Southern Biotech </td><td> 1550-1502 </td><td></td></tr><tr><td> PE-ratón conjugado con anticuerpos anti IFN </td><td> BD Biosciences </td><td> 554412 </td><td></td></tr><tr><td> PE-conjugado anti-ratón CD16/CD32 anticuerpos (FcR bloque) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553141 </td><td></td></tr><tr><td> Aquatex </td><td> VWR </td><td> 1.08562.0050 </td><td></td></tr><tr><td> Avidina / biotina kit de bloqueo </td><td&gt; Vectores (AXXORA) </td><td> VC-SP-2001-KI01 </td><td></td></tr><tr><td> Un Brefeldin </td><td> Sigma </td><td> B6542 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenasa IV </td><td> Sigma </td><td> C5138-100MG </td><td></td></tr><tr><td> DAB sustrato kit 3&#39;3&#39;diaminobenzidine </td><td> Vector (AXXORA) </td><td> VC-SK-4100-KI01 </td><td></td></tr><tr><td> DNasa </td><td> Sigma </td><td> DN-25 </td><td></td></tr><tr><td> Elite ABC reactivo </td><td> Vector (AXXORA) </td><td> VC-PK-7100-L050 </td><td></td></tr><tr><td> Eosina G / Y la solución </td><td> Roth </td><td> X883.1 </td><td></td></tr><tr><td> De suero fetal de ternero (FCS) </td><td> Biochrom AG </td><td> S 0115 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Forene </td><td> B506 </td><td></td></tr><tr><td> Solución de hematoxilina de Meyer </td><td> Applichem </td><td> A4840, 1000 </td><td></td></tr><tr><td> Compuesto octubre </td><td> Sakura Finetek Europa </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> PBS-formaldehído tamponado al 10% </td><td> Roth </td><td> A146.3 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Amersham </td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> Roti-Histokit </td><td> Roth </td><td> 6638.1 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 61870 </td><td></td></tr><tr><td> La saponina de la corteza de quillay </td><td> Sigma </td><td> S7900 </td><td></td></tr></tbody></table>

el cyp2d6 animal modelo: cómo inducir a la hepatitis autoinmune en ratones

The CYP2D6 Animal Model: How to Induce Autoimmune Hepatitis in Mice

La hepatitis autoinmune es una enfermedad autoinmune poco frecuente, pero que amenaza la vida del hígado de etiología desconocida 1,2. En los muchos intentos pasados ​​se han hecho para generar un modelo animal que refleja las características de la enfermedad humana 3-5. Sin embargo, en varios modelos de la inducción de la enfermedad era bastante compleja y con frecuencia la hepatitis era sólo transitoria 3-5. Por lo tanto, hemos desarrollado un modelo de ratón sencillo que utiliza el autoantígeno humano importante en tipo 2 hepatitis autoinmune (HAI-2), a saber hCYP2D6, como un gatillo 6. Tipo 1 de hígado-riñón anticuerpos microsomales (LKM-1) anticuerpos que reconocen hCYP2D6 son el sello distintivo de la HAI-2 7,8. La entrega de hCYP2D6 en wildtype FVB o ratones C57BL / 6 fue por una construcción de adenovirus (Ad-2D6) que asegura una entrega directa del antígeno desencadenante para el hígado. Por lo tanto, la inflamación subsiguiente local genera un campo fértil 9 para el posterior desarrollo de la autoinmunidad. A combination de la inyección por vía intravenosa e intraperitoneal de Ad-2D6 es la vía más eficaz para inducir un daño autoinmune de larga duración en el hígado (sección 1). A continuación presentamos un protocolo detallado de cómo la enfermedad hepática autoinmune es inducida en el modelo de CYP2D6 y cómo los diferentes aspectos de daño hepático puede ser evaluada. En primer lugar, los niveles séricos de marcadores que indican destrucción de hepatocitos, tales como las aminotransferasas, así como los títulos de hCYP2D6 anticuerpos se determinó mediante el muestreo de sangre retroorbitaly (sección 2). En segundo lugar, la respuesta hCYP2D6-específica de células T se caracteriza por recoger los linfocitos desde el bazo y el hígado. A fin de obtener linfocitos puros hígado, los hígados se perfundieron por PBS a través de la vena porta (sección 3), digerido en el colágeno y purifica sobre un gradiente de Percoll (sección 4). La frecuencia de las células T específicas de hCYP2D6 es analizada por la estimulación con péptidos hCYP2D6 y la identificación de las células productoras de IFN por citometría de flujo (sección 5). En tercer lugar,infiltración celular y la fibrosis se determina mediante técnicas de inmunohistoquímica de secciones de hígado (sección 6). Régimen de tipo de análisis tiene que ser llevado a cabo en varias ocasiones después de la iniciación de la enfermedad con el fin de probar la naturaleza crónica de la modelo. La magnitud de la respuesta inmune caracterizada por la frecuencia y la actividad de hCYP2D6-específicas T y / o células B y el grado de la lesión hepática y fibrosis tienen que ser evaluados para una posterior evaluación de posibles tratamientos para prevenir, retrasar o abrogar el autodestructiva proceso del hígado.

La infección de ratones con un adenovirus que expresan el autoantígeno humano importante del citocromo P450 2D6 (hCYP2D6) reconocidos por los sueros de los pacientes con tipo 2, los resultados de hepatitis autoinmune en una forma persistente de la enfermedad hepática autoinmune mediada por la hepatitis se caracteriza por una amplia fibrosis, y la generación de un CYP2D6 la respuesta inmune específica.

El CYP2D6 Animal Modelo: cómo inducir a la hepatitis autoinmune en ratones

La hepatitis autoinmune es una enfermedad autoinmune del hígado poco frecuente pero potencialmente mortal y de etiología desconocida1,2. En el pasado, se han realizado muchos intentos para...

El objetivo general de los siguientes experimentos es generar y verificar un modelo murino para la hepatitis autoinmune, una enfermedad hepática autoinmune humana que se caracteriza por una inflamación crónica de la interfase hepática, hepatitis, hiper gammaglobulinemia y la producción de autoanticuerpos característicos. Primero, los animales se infectan con un constructo de adenovirus que expresa el autoantígeno causante de la enfermedad, CYP2D6, para inducir inflamación local dentro del hígado. A continuación, los linfocitos hepáticos se aíslan mediante perfusión hepática y centrifugación de densidad diferencial. Finalmente, el daño hepático y la identificación de linfocitos T específicos para el autoantígeno pueden evaluarse mediante inmunohistoquímica y tinción intracelular de citocinas, respectivamente.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que nuestro modelo de hepatitis autoinmune se caracteriza por una inflamación crónica del hígado y una respuesta inmunitaria específica frente al autoantígeno que es casi idéntica a la observada en individuos humanos que padecen hepatitis autoinmune tipo dos. Nuestro modelo puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades hepáticas autoinmunes, como por ejemplo cómo se produce la destrucción progresiva del hígado en pacientes con hepatitis autoinmune. En general, con el método en viales, tenemos dificultades para realizar infecciones intravenosas y la recogida de sangre a través del seno venoso oftálmico, así como para la perfusión del hígado, tareas que requieren mucha práctica por parte del operador.Tras anestesiar, sostenga al ratón por la parte posterior del cuello y tense la piel suelta de la cabeza con el pulgar y el dedo medio. Observe cómo, en esta posición, el ojo sobresale ligeramente debido a la tracción de la piel adyacente al ojo. Ahora coloque la aguja en el ángulo interno del ojo, en la unión de uno de los párpados más cercano a la nariz del animal, e inyecte lentamente 100 microlitros de la solución del virus 80 2D seis.Luego, retire ligeramente la aguja y cierre los párpados. Comience llenando una jeringa de cinco mililitros con PBS frío y colocando una aguja de calibre 27 en la jeringa. Luego, tras sacrificar al ratón, haga una incisión con tijeras a aproximadamente un centímetro de las patas traseras del animal, a través de las capas de piel y músculo, cortando ambos lados del animal con tijeras hasta llegar al diafragma.Y cuando se alcance el diafragma, tire hacia atrás de la piel y corte el diafragma separándolo de las costillas con tijeras y diseque la vena cava. En este punto de la disección, mueva el estómago y los intestinos hacia un lado, exponiendo la vena porta. Perfundir el hígado es la parte más complicada del procedimiento, especialmente cuando el hígado está crónicamente inflamado o incluso fibrotizado. El ratón es bastante pequeño, por lo que se necesita una mano firme para punzar con precisión la vena porta.Además, es importante que el PBS se aplique lentamente, ya que de lo contrario el tejido puede dañarse. Introduzca la aguja previamente preparada en la vena porta y luego aplique suavemente presión sobre el émbolo de la jeringa para permitir que el PBS lave lentamente la sangre del hígado. Una vez completada la perfusión, retire el hígado sujetando el diafragma con un par de pinzas y use las tijeras para cortar el diafragma del cuerpo.Finalmente, transfiera el órgano a una placa de Petri y retire el diafragma, la vesícula biliar y cualquier otro tejido aún conectado al hígado. Tenga en cuenta que el hígado del animal con hepatitis autoinmune es fibrotico y los lóbulos individuales están fusionados. Comience llenando una placa de Petri con 10 mililitros de PPS fresco y colóquela sobre hielo.Transfiera el hígado perfundido al recipiente y, con tijeras, corte el tejido en trozos pequeños. A continuación, vierta el tejido y el PBS en un filtro celular de 70 micrómetros y, utilizando un pistilo de vidrio, presione los trozos de hígado a través del filtro. Ahora vierta cuidadosamente 10 mililitros de tampón de colagenasa frío sobre los trozos de tejido, continuando con el uso del pistilo según sea necesario.Centrifugar las células a 30 × g durante tres minutos a cuatro grados Celsius. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo, dejando cinco milímetros de líquido por encima del precipitado. Centrifugar a 650 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Desechar todo el sobrenadante excepto los últimos tres milímetros.Re suspenda el precipitado en 20 mililitros de tampón por célula, y luego, tras centrifugar las células a 600 × g durante 20 minutos a 4 °C, deseche el sobrenadante y re suspenda el precipitado agitando el tubo en el modelo de hepatitis autoinmune persistente que se desarrolla tras la infección por adenovirus 2D6 en ratones de tipo salvaje del modelo CYP 2D6. El hígado exhibe una morfología aparentemente alterada, como se observa aquí en la figura de la derecha. En particular, los lóbulos hepáticos están fusionados, como indican las puntas de flecha negras, y aparecen nódulos hiperfágicos indicados por flechas negras dispersos por todo el hígado, además de una fibrosis capsular masiva visible tras la infección con un control.El adenovirus que no expresa la CYP 2D6 humana no tiene efecto sobre la morfología hepática, como se observa en la figura de la izquierda. Además, se presentan infiltraciones celulares extensas y persistentes en las regiones periportales y parenquimatosas del hígado de los ratones infectados con el adenovirus 2D6, pero no en los ratones infectados con el control de adenovirus. Observe las infiltraciones significativas de células mononucleares presentes únicamente en los ratones infectados con el adenovirus 2D6, indicadas por las flechas negras simples. Aquí.Las flechas triples indican infiltraciones celulares más extensas en el parénquima hepático que conectan tractos portales adyacentes. En esta figura, puede observarse cómo la fibrosis se desarrolla predominantemente en la región subcapsular, con algunos haces de colágeno que sobresalen hacia el parénquima. Obsérvense las múltiples capas de depósito de colágeno bajo la cápsula hepática, indicadas por las flechas negras triples, con algunos haces que penetran en el parénquima, señalados por las flechas simples, así como la presencia de grandes agrupaciones de células infiltrantes, indicadas por las puntas de flecha negras.Una tercera característica de la hepatitis autoinmune persistente en ratones infectados con adenovirus humano CYP 2D6 es la generación predominante de linfocitos T CD4 y CD8 específicos para CYP 2D6 humano con tropismo hepático, como se observa en estos gráficos de dispersión representativos de tinción intracelular de citocinas. La estimulación durante la noche de linfocitos hepáticos con el péptido inmunodominante de CD4 o CD8 de CYP 2D6 humano induce respectivamente la expresión de interferón gamma específica en células T positivas para CD4 o positivas para CD8. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que la perfusión óptima del hígado es un paso crítico para evitar la contaminación de los linfocitos hepáticos por monocitos de sangre periférica. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el aislamiento de células estrelladas hepáticas primarias, con el fin de estudiar el estado de activación y el potencial migratorio de las células T tras su desarrollo.Este modelo animal debería allanar el camino para que los investigadores en el campo de las enfermedades hepáticas autoinmunes exploren los factores clave que impulsan la inflamación crónica del hígado, y evalúen posibles tratamientos para los pacientes.

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