Evaluación de los cambios teratogénicos en un modelo de pez cebra de la exposición fetal al alcohol

El objetivo general de este procedimiento es estudiar los efectos de la exposición al etanol en el pez cebra en desarrollo. Esto se logra primero exponiendo al pez cebra a dosis de etanol en agua embrionaria normal durante las primeras etapas del desarrollo. A continuación, se elimina el etanol y se permite que los peces se desarrollen hasta el punto temporal deseado.

Luego, se analizan tanto los cambios físicos evidentes como las alteraciones en la expresión génica en embriones tratados en comparación con embriones de control. Finalmente, los embriones se manipulan con ARNm, morfolinos o fármacos para determinar si los defectos del desarrollo inducidos por etanol pueden modificarse. En última instancia, una combinación de PCR cuantitativa e hibridación in situ muestra que los efectos del etanol en embriones de pez cebra en desarrollo están relacionados con cambios en la expresión génica.

La manipulación posterior de los niveles de expresión génica podría mejorar o prevenir defectos del desarrollo inducidos por el etanol. Las técnicas que demostramos hoy amplían nuestro conocimiento sobre la naturaleza del síndrome alcohólico fetal, así como sobre los procesos del desarrollo conservados en los vertebrados. La demostración de hoy estará a cargo de Steph Erhardt, técnico en mi laboratorio, para tratar embriones con etanol.

Criarlos a partir de apareamientos de tipo silvestre hasta la etapa de cúpula a 28 grados Celsius en agua para embriones. Dividir los embriones de una puesta en el número deseado de placas con entre 10 y 50 embriones por placa. Añadir una solución de etanol entre 0,2 y 2,5 %v/v en agua para peces a los embriones y devolverlos al incubador durante hasta 24 horas después de la duración deseada de exposición.

Sustituya el etanol que contiene agua por agua para embriones fresca durante un período específico de desarrollo para recolectar ARNm para PCR cuantitativa. Coloque embriones emparejados en tubos einor. Retire el agua de los peces y agregue tampón de lisis con TCEP.

Utilizando un pulverizador motorizado, disocie físicamente los embriones y luego colóquelos en la centrífuga para un giro lento. Transfiera el soluto a una columna de pre-limpieza y luego centrifugue la columna para eliminar los fragmentos grandes disociados.

Utilice un kit de aislamiento de ARN para extraer el ARN. Luego, sintetice ADNc utilizando métodos estándar para análisis de QPCR o microarreglos para preparar embriones para hibridación en C y tinción con anticuerpos. Fije embriones de seis a 24 horas post-fecundación en paraformaldehído al 4% durante la noche a cuatro grados Celsius, tras tres lavados con PBS más tween al 0,1%.

Retire el corion usando dos pinzas finas bajo el microscopio. A continuación, transfiera los embriones al metanol mediante una serie de cambios de líquido con concentración creciente de metanol y concentración decreciente de PBT. Después de transferir los embriones al metanol al 100 %, almacénelos a menos 20 grados Celsius para teñir el cartílago.

Criar embriones hasta cinco o seis días posteriores a la fertilización. Fijarlos durante la noche en paraformaldehído al 4 % a cuatro grados Celsius. Luego lavarlos tres veces en PBT para determinar qué niveles de expresión génica han cambiado debido a la exposición al etanol.

Realice QPCR diseñando primero cebadores para validar los cebadores. Pruébelos en tres muestras biológicas. Estas muestras biológicas de control pueden ser de cualquier edad, siempre que el gen de interés se exprese en esa edad particular.

Una vez que se hayan verificado los cebadores, utilice el ADNc previamente preparado para realizar la PCR cuantitativa, ejecutando las muestras por triplicado e incluyendo una muestra control para un control de pez cebra; utilizamos los cebadores para gap dh. Normalice los resultados respecto a los niveles de gap DH. Luego, calcule el nivel relativo de expresión génica utilizando el método de umbral de ciclo (Ct).

Variación en el método delta delta CT dos veces, que muestra la diferencia experimental respecto al tipo silvestre. Para el constructo de hibridación en dos híbridos. Sondas de riboprobes marcadas dirigidas al gen de interés.

Luego, incubarlos con embriones de edad equivalente utilizando condiciones estándar y detectar el patrón de hibridación mediante fosfatasa alcalina; obtener imágenes de las muestras utilizando un microscopio estereoscópico para evaluar el desarrollo morfogénico, como por ejemplo la forma del embrión en vida para evaluar la distancia interocular y la longitud del cuerpo. Primero, fijar los embriones en paraformaldehído. Luego, recolectar imágenes para examinar los efectos del tratamiento con alcohol sobre las estructuras de cartílago en desarrollo en la larva teñida.

Fije los embriones de pez cebra utilizando lc y azul durante varias horas hasta toda la noche para retener y aclarar los embriones antes de la obtención de imágenes. Analice la muerte celular en embriones vivos incubándolos en cinco miligramos por mililitro de naranja de acridina en PBS durante una hora. Lave los embriones tres veces en PBS, luego monte los embriones en portaobjetos, obtenga imágenes de las muestras utilizando un microscopio confocal y utilice series Z para crear imágenes compuestas.

Después de identificar los genes cuya expresión ha disminuido debido a la exposición al etanol, inyecte de 25 a 200 picogramos por nanolitro de ARNm con caperuza para un gen de interés en embriones de una a dos células. Permita que los embriones se recuperen en un incubador calentado a 28 grados Celsius hasta que alcancen la etapa de cúpula y luego trátelos con etanol como antes. Para los genes cuya expresión aumentó como resultado de la exposición al etanol, suprima su expresión mediante la inyección de cantidades de picogramos a nanogramos de morfolinos antisentido en embriones de una a dos células.

Este protocolo es similar al utilizado para el ARNm con caperuza. Si se inyecta un ARNm, splicing morpholino, mida la eficiencia mediante R-T-P-C-R para comparar las cantidades de transcritos empalmados y no empalmados, con el fin de analizar la actividad génica dependiente de la dosis. Titule el morpholino inyectado y permita que los embriones se desarrollen hasta la etapa deseada antes de tratarlos con etanol. La exposición de embriones de pez cebra al etanol provoca una serie de defectos genéticos y del desarrollo relacionados con los fenotipos encontrados en otros vertebrados.

El desarrollo anormal de los tejidos axiales, incluyendo Noor, conduce a un noord acortado y en ocasiones interrumpido, lo que en parte provoca las anomalías posteriores en los somitas, como se muestra aquí. Mientras que los controles no tratados presentan una forma de flecha bien definida, los somitas tratados con etanol adquieren una apariencia en forma de U, característica de una señalización reducida de sonic hedgehog. Como se observa aquí.

Otra consecuencia de la exposición al etanol, posiblemente posterior al retraso del desarrollo temprano y a los defectos Noor subsiguientes, es la reducción de la longitud del embrión. Este hallazgo es similar a la persistencia de la estatura baja prepuberal observada en niños expuestos al etanol durante el desarrollo, lo que sugiere que el modelo de pez cebra es relevante para comprender este defecto congénito humano. Se ha demostrado en modelos animales que una exposición severa al etanol conduce a fenotipos pronunciados del síndrome alcohólico fetal, incluyendo sinquia y opia.

En el pez cebra, la distancia intraocular o IOD disminuye de manera dependiente de la dosis de etanol, lo cual es consistente con la naturaleza del defecto congénito humano. La opia solo se observa con dosis muy altas, pero dosis más bajas producen una reducción significativa en la IOD, lo que sugiere que este modelo animal presenta un defecto similar en el desarrollo facial medio. En esta figura, se comparan los niveles de expresión génica temprana de six tres B y glee uno en embriones no tratados y tratados con etanol.

Ambos genes mostraron niveles reducidos de expresión en las muestras tratadas con etanol. Mediante hibridación NC dos, se analizaron los patrones de expresión de seis tres B y gooID, como se observa. Aquí, ambos genes mostraron una disminución en la expresión espacial en embriones tratados con etanol en comparación con los controles no tratados.

Dado que ambos genes se expresan en tejidos destinados a convertirse en tejidos medios craneofaciales, su reducción a las ocho horas post fertilización es coherente con la disminución del DIO en etapas posteriores del desarrollo. Una vez identificados los genes afectados por el etanol, existen mecanismos mediante los cuales su expresión puede aumentarse o disminuirse. En este ejemplo, se inyectó ARNm para hedgehog sónico, un ligando que incrementa los niveles de glee one, y esto permitió recuperar los defectos evidentes causados por la reducción de glee one y en embriones tratados con etanol.

La inyección de seis tres B, sin embargo, no logró revertir el fenotipo expuesto al etanol. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo explorar los defectos genéticos y del desarrollo producidos por el etanol en un embrión de pez cebra en desarrollo. Las técnicas utilizadas aquí también pueden aplicarse a quienes deseen estudiar la toxicidad de otros compuestos solubles en agua en el embrión vertebrado en desarrollo.