Name: Hibridación In situ De las glándulas salivales, los ovarios y embriones de los mosquitos vectores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Aprende hibridación in situ para analizar la expresión génica en tejidos de mosquitos vectores. Este método permite visualizar la localización de transcritos específicos en glándulas salivales, ovarios y embriones.

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Los autores desean agradecer a Marika Walters para el asesoramiento en el desarrollo de la hibridación in situ en los métodos de los tejidos blandos y Goltsev Yury para la discusión de los protocolos para la hibridación in situ de Anopheles gambiae embriones, que fueron adaptados y modificados posteriormente para desarrollar el protocolo descrito aquí para la hibridación en in situ de Aedes y Culex embriones. Reconocemos también recomendaciones útiles dados por Adam Paré y Kosman David. Damos las gracias a Osvaldo Marinotti para la discusión científica y la edición del texto del protocolo.

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</ol>

Los autores no tienen revelaciones.

La hibridación in situ y el protocolo de tinción colorimétrica que aquí se presenta para los tejidos de mosquitos todo el montaje y los embriones es una técnica útil para la localización de las transcripciones en órganos específicos y tipos de células. Estos procedimientos son una mejora con respecto a los métodos ya se ha informado, tanto en la racionalización de amplias medidas de lavado y de proporcionar más detalles técnicos y las fuentes de reactivos. En nuestra experiencia, la detección colorimétrica de las señales de hibridación es superior en sensibilidad y la claridad de la señal de hibridación en comparación con esquemas de detección basadas en fluorescencia. Por otra parte la detección colorimétrica elude las cuestiones relacionadas con la discriminación de la señal en los embriones, que son inherentemente auto-fluorescente. Las limitaciones en la detección de señales de hibridación ocurre, cuando baja abundancia transcripciones están dirigidos y tinción de fondo es evidente. El aumento de la temperatura de hibridación a 65 ° C se ha encontrado para reducir de nuevoseñales de hibridación de tierra, pero no es un sustituto sugerido para el diseño único objetivo sondas específicas de ARN. Este protocolo se ha utilizado para llevar a cabo la hibridación in situ de todo el montaje las glándulas salivales del mosquito Aedes aegypti y los ovarios y los embriones de Anopheles gambiae, el Anopheles stephensi, Ae. aegypti y Culex quinquefasciatus. Este método también es aplicable a los tejidos de mosquitos otros, y presumiblemente los de otros insectos. Además, se compiló para las pautas de la primera vez comparativas para la puesta en escena del desarrollo embrionario de cada tres mosquitos vectores, Ae. aegypti, Un. gambiae y Cx. fatigans. Las observaciones se han reportado para cepas específicas de estas tres especies, bajo condiciones de cría discretos. Es importante señalar que el curso de tiempo de desarrollo puede variar para diferentes cepas de especies de mosquitos y bajo condiciones de cría diferentes. Hibridaciones en el suplemento in situ los esfuerzos en curso a analisar los transcriptomes de mosquitos y otros artrópodos, y puede ofrecer una mejor imagen de la regulación de la expresión génica en estos organismos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> EDTA 0,5 M </td><td> Ambion </td><td> AM9261 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCl 1M </td><td> Ambion </td><td> AM9855G </td><td> pH 8,0 </td></tr><tr><td> PBS 10 veces </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> SSC 20X </td><td> Ambion </td><td> AM9763 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml tubos de microfuga </td><td> Ambion </td><td> AM12400 </td><td> Menos opaco que los tubos estándar, ayuda a visualizar las muestras </td></tr><tr><td> Formamida desionizada </td><td> Ambion </td><td> AM9342 </td><td> El almacenamiento a 4 ° C </td></tr><tr><td> DEPC agua </td><td> Ambion </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinasa K </td><td> Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> 5,25% de hipoclorito de sodio </td><td> Austin </td><td></td><td> A-1 Marca </td></tr><tr><td> T3 ARN polimerasa-Plus </td><td> Ambion </td><td> AM2733 </td><td> El almacenamiento a -20 ° C </td></tr><tr><td> T7 ARN polimerasa </td><td> Ambion </td><td> AM2082 </td><td> El almacenamiento a -20 ° C </td></tr><tr><td> 95% de etanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC61511-0040 </td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand pipetas desechables de polietileno de transferencia </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-7M </td><td></td></tr><tr><td> 37% de formaldehído </td><td> Fisher Scientific </td><td> F79-500 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC-grado de metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452-1 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de magnesio </td><td> Fisher Scientific </td><td> M87-500 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio cubierta de vidrio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542A </td><td> 18 x 18 mm </td></tr><tr><td> N-heptano </td><td> Fisher Scientific </td><td> H350-1 </td><td></td></tr><tr><td> P-xileno </td><td> Fisher Scientific </td><td> O5082-500 </td><td></td></tr><tr><td> Pyrex de 9 y Punto Plate </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-748B </td><td> 100x85 mm </td></tr><tr><td> Cloruro de sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC32730-0025 </td><td></td></tr><tr><td> Hidróxido de sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> SS255-1 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost / Plus portaobjetos </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td><td> 25x75x1.0 mm </td></tr><tr><td> Davlyn Red Clear-liner Toupee cinta </td><td> Cabello directo </td><td> RED-75R12 </td><td> Poli / material de la piel base de 0,75 cm x 12 m rollo de cinta </td></tr><tr><td> Kit de Clonación de TOPOTA Sequening con un disparo Top10 químicamente competente E. E. </td><td> Invitrogen </td><td> K457501 K457540 </td><td> 20 reacciones 40 reacciones </td></tr><tr><td> De salmón sonicado ADN de los espermatozoides </td><td> Invitrogen </td><td> 15632-011 </td><td> El almacenamiento a -20 ° C </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenina-AP Fab </td><td> Roche Ciencias Aplicadas </td><td> 1093274 </td><td> El almacenamiento a 4 ° C </td></tr><tr><td> DIG RNA etiquetado mezcla </td><td> Roche Ciencias Aplicadas </td><td> 1277073 </td><td> El almacenamiento a -20 ° C </td></tr><tr><td> NBT / BCIP de la solución madre </td><td> Roche Ciencias Aplicadas </td><td> 1681451 </td><td> El almacenamiento a 4 ° C </td></tr><tr><td> Reactivo de bloqueo occidental </td><td> Roche Ciencias Aplicadas </td><td> 11921673001 </td><td> El almacenamiento a 4 ° C </td></tr><tr><td> Saatilene Hitech malla de poliéster (330.130) </td><td> Saati Imprimir </td><td> 330,34 UO PW </td><td> 330 hilos por pulgada, de 34 micras de diámetro de la rosca, color naranja </td></tr><tr><td> Glicerol </td><td> Sigma </td><td> G6279-1 </td><td> 70% en PBT </td></tr><tr><td> Sal de sodio de heparina </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P1379-500 </td><td></td></tr><tr><td> 37% de formaldehído </td><td> Ted Pella </td><td> 18508 </td><td> Alícuotas de 10 ml en ampollas ámbar </td></tr><tr><td> 16 oz Recipientes con tapas de papel solitario </td><td> El Paper Company </td><td> SOLOKH16AJ8000 </td><td></td></tr><tr><td> Vidrio borosilicato scintillatión vial con tapón de rosca sin ataduras </td><td> VWR International </td><td> 66022-128 </td><td> 20 ml caso de 500 </td></tr><tr><td> Sealed Air Bubble Wrap o via un material de relleno </td><td> VWR International </td><td> 500018-081 </td><td> De 10 pies / rollo 0.188 pulgadas de espesor </td></tr><tr><td> Suero de pollo </td><td></td><td></td><td> Toda la sangre se recoge ya sea desde la vena del ala, o por punción cardiaca de un pollo de menores. La sangre se incubó a 37 ° C durante 1 h hasta coagulada y luego se coloca en hielo durante 30 min. El suero se recogió y se centrifugó a 3000 xg durante 10 min. El sobrenadante resultante (aclarado suero) se recogió y se almacenó a -20 ° C hasta su uso. </td></tr></tbody></table> Tabla 4. Tabla de los reactivos específicos y equipos para la hibridación in situ.

hibridación<em&gt; in situ</em&gt; de las glándulas salivales, los ovarios y embriones de los mosquitos vectores

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Los mosquitos son vectores de un conjunto diverso de agentes patógenos como los arbovirus, parásitos protozoarios y nematodos. Investigación de las transcripciones y los reguladores de genes que se expresan en tejidos en los que el anfitrión de mosquitos e interactuar patógeno, y en los órganos implicados en la reproducción son de gran interés para las estrategias para reducir la transmitida por el mosquito transmisión de la enfermedad e interrumpir el desarrollo del óvulo. Un número de herramientas se han empleado para estudiar y validar la regulación temporal y tejidos específicos de la expresión génica. A continuación, describimos los protocolos que han sido desarrollados para obtener la información espacial, lo que aumenta nuestra comprensión de los genes específicos en donde se expresan y acumulan sus productos. El protocolo descrito se ha utilizado para validar la expresión y de determinar los patrones de acumulación de expedientes en los tejidos relacionados con la transmitida por el mosquito transmisión de patógenos, tales como las mujeres las glándulas salivales, así como los compartimentos subcelulares de los ovarios y los embriones, que vuelva atarde para la reproducción de mosquitos y el desarrollo. Los procedimientos siguientes representan una metodología optimizada que mejora la eficiencia de varios pasos en el protocolo sin pérdida de las señales de hibridación específicos diana. Directrices para la preparación de la sonda de ARN, la disección de los tejidos blandos y el procedimiento general para la fijación y la hibridación se describen en la Parte A, mientras que los pasos específicos para la recogida, grabación, pre-hibridación y la hibridación de embriones de mosquitos se detallan en la Parte B.

Análisis de genes temporales y espaciales de expresión tiene un papel crucial en la genómica funcional. Todo el montaje hibridación<em&gt; In situ</em&gt; Es útil para determinar la localización de las transcripciones dentro de los tejidos y los compartimentos subcelulares. Aquí describimos una hibridación<em&gt; In situ</em&gt; Protocolo con las modificaciones de los tejidos diana específicos en los mosquitos.

Hibridación<em&gt; In situ</em&gt; De las glándulas salivales, los ovarios y embriones de los mosquitos vectores

Los mosquitos son vectores de un conjunto diverso de patógenos que incluyen arbovirus, parásitos protozoarios y nematodos. La investigación de los transcritos y genes...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en realizar hibridación in situ en C dos para determinar los patrones de localización y acumulación de transcritos específicos dentro de tejidos y embriones de mosquito. Esto se logra primero fijando los tejidos o embriones de mosquito para que la ultraestructura del tejido y los ARNm diana se conserven y estén disponibles para hibridarse con sondas de ARN antisentido. A continuación, las sondas de ARN antisentido se hibridan con los transcritos diana dentro de los tejidos o embriones fijados.Luego se realizan métodos de tinción con anticuerpos colimétricos para detectar los patrones de localización y acumulación del ARNm diana. Se obtienen resultados que muestran patrones espaciales de acumulación de ARN basados en hibridación en C dos y métodos de detección colimétrica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genómica funcional, como determinar cuándo y dónde se acumulan los productos génicos en el mosquito.Este procedimiento también nos permite obtener información sobre la localización espacial para comprender mejor cómo se regula la expresión génica en procesos biológicos como el desarrollo reproductivo y las interacciones entre el mosquito y los patógenos. Para prepararse para la hibridación de sondas de ARN marcadas con digoxigenina a tejidos de mosquito, comience por diseccionar los ovarios y las glándulas salivales. Luego fije el tejido y trátelo con proteinasa K si es necesario.Después de que los tejidos hayan sido postfijados, equilíbrelos en un mililitro de una mezcla uno a uno de solución de hibridación PBT o HIB PBT durante 30 minutos con agitación, espere a que el tejido se asiente y luego deseche por decantación la mayor cantidad posible de HIB PBT. A continuación, añada un mililitro de HIB a cada tubo de muestra. Envuelva el tubo de muestra en un embalaje protector hermético contra el aire, como papel de burbujas, y colóquelo dentro de un frasco de hibridación.Cierre el frasco con una tapa de frasco de hibridación e incube a 55 grados Celsius durante 30 minutos con rotación. Después de retirar el frasco del incubador y permitir que el tejido se asiente, deseche cuidadosamente el tampón de prehibridación dejando 50 microlitros de solución en el tubo para evitar la pérdida de la muestra. A continuación, agregue 50 microlitros de tampón alto precalentado a la misma muestra y colóquela en un bloque térmico ajustado a 55 grados Celsius; desnature la sonda de ARN previamente preparada a 85 grados Celsius durante cinco minutos.Luego, colóquelo inmediatamente en hielo durante cinco minutos. A continuación, aspire con pipeta la sonda de ARN y colóquela en el tubo de muestra. La sonda de ARN flotará hacia la superficie de la solución HI.Mezcle agitando ligeramente el tubo. Incube suavemente las muestras en un portatubos fijo dentro de una estufa de hibridación a 55 grados Celsius durante 16 a 24 horas. Tras el tratamiento con ARNs y la tinción con anticuerpos según se describe en el protocolo escrito.Monte las muestras de tejido utilizando primero una punta de pipeta de 200 microlitros para transferirlas a pozos individuales de fondo redondo en una placa de cultivo Pyrex. Elimine la mayor cantidad posible de PBT y cubra la muestra con glicerol al 70% en agua. Deje que el glicerol penetre la muestra a cuatro grados Celsius durante la noche.Para preparar las laminillas para microscopio, comience por limpiar la superficie de la laminilla con toallitas Kim. A continuación, coloque dos trozos de cinta adhesiva invisible paralelos entre sí de manera que formen un canal estrecho utilizando un pincel de artista. Tome las muestras una por una y colóquelas a lo largo del canal, posicionando cada muestra con la misma orientación respecto a las alineaciones anterior, posterior y dorsal-ventral.Después de colocar cada muestra, utilice un hisopo de torunda Kim para absorber la solución excesiva de glicerol que rodea los tejidos. Es importante eliminar el exceso de glicerol para prevenir la formación de burbujas al sellar las muestras montadas sobre el portaobjetos bajo un cubreobjetos; coloque cuidadosamente un cubreobjetos sobre el canal que contiene las muestras alineadas. Mediante esmalte de uñas transparente, fije el cubreobjetos de forma semipermanente al portaobjetos aplicándolo ligeramente en las esquinas. Utilizando una pipeta de 200 microlitros, dispense lentamente 70%glicerol en uno de los extremos del canal para llenar completamente el canal y la zona bajo el cubreobjetos.Selle las muestras montadas aplicando esmalte de uñas a lo largo de los cuatro lados del cubreobjetos. Deje secar suficientemente el esmalte de uñas antes de obtener imágenes de las muestras. Después de recolectar embriones de una jaula con 300 hembras adultas de mosquitos apareadas y permitir que se desarrollen hasta las etapas deseadas, transfiéralos desde su recipiente de recolección a un tubo colector con malla de tylene para embriones de ocho días.Coloque el tubo recolector en un vaso de precipitados que esté lleno con suficiente agua destilada para que el volumen del tubo recolector quede hasta la mitad. Utilice un pincel de artista para desprender los embriones de la malla de tylene y transfiéralos al tubo recolector con agua. Para que los embriones se desprendan fácilmente, retire la malla de tylene del recipiente de recolección y doble cuidadosamente la malla para formar un embudo, sosteniendo este embudo con una mano.Utilice la otra mano para rociar agua a lo largo de los lados del embudo y lavar los embriones hacia el tubo recolector. Este método puede aplicarse a embriones con anomalías porque carecen de la sustancia adhesiva presente en la superficie de los embriones de ocho días, que permite a los huevos adherirse a sustratos en posiciones superiores. Prepare 40 mililitros de solución de decoración y vierta la solución en una placa de Petri de 100 milímetros.Agregue 50 mililitros de agua destilada a un vaso de precipitados de 100 mililitros y déjelo aparte. A continuación, coloque los embriones en la placa de Petri con la solución de decapado. Utilice una pipeta desechable de polietileno para lavar los embriones mientras gira el tubo recolector, de modo que los embriones permanezcan sumergidos y agitados en la solución de decapado.La descorionización es uno de los pasos más sensibles del protocolo, y una prolongación excesiva del tratamiento con hipoclorito de sodio en embriones de ocho días impedirá una adecuada exposición del corion interno. Se requiere un tiempo máximo de 35 segundos para descorionizar embriones de ocho días, mientras que 75 segundos son suficientes para embriones QX. Bajo un microscopio estereoscópico con aumento bajo, verifique la descorionización. Los embriones de ocho días carecerán del corion externo con aspecto de malla y solo presentarán la superficie lisa y pulida del corion interno oscuro; en los embriones anómalos ocurre lo propio.Las estructuras flotantes y las crestas exocoriónicas estarán ausentes una vez que los embriones estén recubiertos. Continúe con la fijación y la interrupción del endocorión según el procedimiento descrito en el protocolo escrito. Para retirar el endocorión interrumpido, coloque un trozo de cinta adhesiva doble cara para pelucas en el centro de una placa de Petri de tres centímetros utilizando una punta de pipeta de 200 microlitros de gran orificio.Transfiera los embriones desde el metanol hacia la cinta adhesiva de doble cara. Deje que los embriones se asienten y adhieran a la superficie de la cinta durante uno o dos minutos, deseche el metanol en exceso y permita que la superficie se seque ligeramente durante uno o dos minutos. A continuación, agregue etanol al 95 % en la placa de Petri para inmovilizar aún más los embriones sobre la cinta; pipetee 600 microlitros de agua destilada en el etanol y agite suavemente para mezclar.A continuación, utilice una aguja de 27,5 unida a un cilindro de jeringa de un mililitro para desprender el corion endodérmico agrietado. Después de liberar el embrión blanco de los restos del corion endodérmico oscuro usando un pincel de punta fina, transfiera inmediatamente los embriones desde la cinta al reservorio de etanol del recipiente de Petri. Luego, utilizando una punta de pipeta de tres milímetros, transfiera los embriones a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros que contenga 500 microlitros de etanol al 100%. Finalmente, lave los embriones dos o tres veces en etanol al 100% y almacénelos en etanol absolutamente puro a menos 20 grados Celsius.En esta figura, la hibridación in situ de glándulas salivales enteras de hembras de Aedes aegypti con sondas de ARNm que dirigen amilasa 1D, 7S2 y 7L2 muestra la acumulación de estos transcritos en los lóbulos lateral proximal, lateral distal y medial lateral distal, respectivamente. En este experimento, se hibridaron montajes completos de células de tres especies de mosquitos con sondas de ARNm que específicamente dirigen los transcritos autólogos respectivos de Oscar. Aquí, en C2, se realizó la hibridación in situ de embriones enteros de Anopheles gambiae, Aedes aegypti y Culex quinquefasciatus utilizando sondas de ARN antisentido dirigidas a los transcritos autólogos de Oscar de cada mosquito.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un experimento de hibridación in situ en C dos para determinar la localización y acumulación de transcritos en tejidos específicos de mosquitos o embriones.

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Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Hibridación Reacción en cadena ARN Fluorescencia de montaje completo Hibridación in situ de genes quimiosensoriales en apéndices olfativos de mosquitos

Las comunidades microbianas de los mosquitos son muy prometedoras para las estrategias de biocontrol de vectores. La mayoría de los simbiontes son incultivables, lo que requiere análisis metagenómicos. Describimos un método para diseccionar mosquitos hembra y separar los ovarios, el intestino medio y las glándulas salivales evitando la contaminación cruzada, facilitando los estudios del microbioma a nivel de órgano y mejorando la comprensión de las funciones de los microorganismos en la...

Disección de ovarios, intestino medio y glándulas salivales de mosquitos para análisis del microbioma a nivel de órganos

Este protocolo describe un simple adhesivo cinta enfoque basado en el muestreo de tomate y otras superficies de los productos frescos, seguido por la rápida detección de células enteras...

Combinación de adhesivo basado en cinta de muestreo y de fluorescencia In situ La hibridación para la detección rápida de Salmonella En los productos frescos

Aprende hibridación in situ para analizar la expresión génica en tejidos de mosquitos vectores. Este método permite visualizar la localización de transcritos específicos en glándulas salivales, ovarios y embriones.

Hibridación

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