Técnicas analíticas para el ensayo de bioactividad del óxido nítrico

El objetivo general del siguiente experimento es demostrar cómo detectar de manera precisa y específica los metabolitos de óxido nítrico en muestras biológicas. Esto se logra procesando primero las muestras de sangre inmediatamente después de la recolección para evitar la pérdida de metabolitos o la formación de artefactos. Al mismo tiempo, se realiza una recolección rápida y eficiente de tejidos para minimizar los efectos de un ambiente hipóxico sobre los metabolitos de óxido nítrico.

Los anillos aórticos se recogen y se cuelgan en un baño de órganos para evaluar su función endotelial. Además, se utilizan ensayos bioquímicos para cuantificar los niveles de nitrato, los niveles de nitritos y los niveles relativos de nitrotioles y otros productos nitrosaciados en el tejido. Con el uso de estos ensayos, una comparación adecuada de animales de experimentación y control puede generar información valiosa sobre la producción y el metabolismo del óxido nítrico.

La principal ventaja de utilizar este enfoque multisistémico en lugar de métodos o ensayos individuales es que esto permitiría una imagen más amplia de la bioquímica del óxido nítrico en múltiples sistemas de órganos. Entonces podemos empezar a entender cuáles de estos metabolitos pueden tener utilidad pronóstica o diagnóstica, y cómo el repertorio de metabolitos de óxido nítrico refleja la formación y disponibilidad endotelial de óxido nítrico. La demostración visual de este método es fundamental, ya que cada paso del proceso es fundamental para mantener la integridad de la muestra.

Algunos de estos pasos no son evidentes en la sección de métodos de lectura en una revista típica debido a los detalles finos de la recolección de muestras y la extracción de tejidos. El Dr. Hong Jing demostrará este procedimiento. Un científico investigador senior en mi laboratorio para este protocolo tiene a su disposición una persona o animal de experimentación para una recolección de sangre para animales de experimentación cuyos tejidos también serán examinados.

Primero, recoja sangre completa insertando una aguja de calibre 25 en la vena cava inferior. Una vez que se hayan recolectado de 500 a 1000 microlitros, se perfunde al animal sin la sangre restante mediante la infusión de tampón fisiológico a través del ápice del ventrículo izquierdo y se permite el reemplazo completo de la sangre a medida que la sangre y el tampón salen a través de la vena CVA inferior. La sangre venosa debe recogerse en tubos centrífugos de 1,5 mililitros que contengan NEM y EDTA inmediatamente después de la recolección.

Haga girar la sangre a 14, 300 RCF durante siete minutos después de la centrifugación. Aspire el plasma del gránulo de RBC con una pipeta y transfiéralo a un tubo separado. Prepare las muestras de plasma aisladas para HPLC añadiendo primero un volumen uno a uno de metanol frío a 50 microlitros de la colección de plasma.

Vórtice, la mezcla vigorosamente durante tres a cinco segundos hasta que esté turbia. A continuación, centrifugar la mezcla a 14.300 RCF durante siete minutos. Para precipitar las proteínas plasmáticas, recoja el supernat en un tubo separado de 1,5 mililitros y guárdelo a cuatro grados centígrados hasta que pueda ser analizado.

Para preparar el plasma para el análisis de quimioluminiscencia, tome el volumen de plasma restante, que debe ser de alrededor de 200 a 400 microlitros, y divídalo en dos volúmenes. Prepare la mitad del plasma añadiendo un 10% de volumen de sulfuro acidificado al 5% y espere 10 minutos. Esta muestra ya está lista para el análisis de CLD.

Prepare la otra mitad del plasma añadiendo un 10% de volumen de cloruro de mercurio al 2% después de cinco minutos. A temperatura ambiente, añadir un 10% de volumen de sulfonamida acidificada. Espere otros 10 minutos e inyecte esta muestra en el CLD como si fuera el plasma.

El pellet RBC se puede preparar para HPLC y CLD para cualquiera de los análisis. Comience mezclando una parte de pellet de celda con cuatro partes de solución de lisis hipotónica. Agite la mezcla a fondo para el análisis de CLD.

La preparación de las células es la misma que se realiza para el plasma. Comience agregando un volumen igual de metanol. A continuación, agite la mezcla vigorosamente durante tres a cinco segundos, seguido de su centrifugado durante siete minutos a 14.300 RCF.

Ahora pipetea el sobrenadante y guárdalo a cuatro grados centígrados hasta que pueda ser analizado por HPLC para determinar los niveles tisulares de metabolitos de óxido nítrico. En los tejidos de interés de animales de experimentación, primero se debe recolectar y preparar la sangre como se describe en la sección anterior, la recolección de los tejidos debe realizarse como de costumbre con especial atención a la velocidad y eficiencia para que los tejidos no se vuelvan hipóxicos. Una vez recolectadas, homogeneizadas las muestras de tejido en una proporción de uno a cinco de N-E-M-E-D-T-A que contienen PBS.

A continuación, prepare los tejidos homogeneizados para el análisis de HPLC y CLD como se describe en las secciones anteriores para los glóbulos rojos. Después de anestesiar a un ratón adulto con éter datilo y confirmar que no responde a un pellizco en el dedo del pie, realice una toracotomía. Se realiza una incisión en la línea media desde el esternón hasta la región del pubis para exponer las cavidades torácica y abdominal.

A continuación, perfunda al animal con tampón Krebs Alite oxigenado. Use una jeringa de calibre 25 para inyectar el tampón en el ápice del ventrículo izquierdo. Con la aurícula derecha se corta para proporcionar una salida para la sangre.

Después de la perfusión, aísle la aorta abdominal cortando y extirpando el hígado, los pulmones y otros tejidos que puedan cubrir la aorta. A continuación, sostenga el corazón con un par de pinzas y corte la aorta de la pared posterior del animal de manera suave. Coloque el corazón y la aorta en una placa de Petri llena de hielo.

Tampón Krebs frío en el plato. Corta y limpia con cuidado la grasa y la adventicia de la aorta. Evite dañar el endotelio dentro del vaso mientras limpia.

Mantenga el metabolismo de las aortas lento para prevenir la hipoxia transfiriéndolo a un tampón oxigenado fresco y helado cada cinco minutos. Ahora use un bisturí para cortar la aorta en segmentos en forma de anillo de tres milímetros de largo. Transfiera los segmentos a un baño de órganos de tejido de cuatro canales y 10 mililitros cargado con tampón Krebs oxigenado.

Con la perilla del transductor, aplique 1,5 gramos de pretensión a cada anillo aórtico. De acuerdo con los hallazgos empíricos. 1,5 gramos es la tensión de arranque adecuada para una función vasomotora óptima.

En el monitor del ratón y registre la medición de la fuerza utilizando un puente octal de ocho canales y un software de adquisición de datos, permita que los anillos se equilibren durante 80 minutos, cambiando el búfer cada 20 minutos, y luego proceda con la experimentación. Una vez que la tensión del tejido se haya equilibrado, agregue 100 nanomolares de hinojo a cada anillo para una contracción submáxima. Una vez que la tensión del anillo se haya estabilizado y haya un nivel constante de tono, realice un análisis de dosis-respuesta a un agonista endotelial como la acetilcolina.

Esto determinará la producción de óxido nítrico y el grado de relajación de los vasos. Después de la respuesta de dosis a la acetilcolina, enjuague los baños con tampón Krebs y agregue 100 nanomolares de hinojo a cada baño de órganos para contraer los vasos. Nuevamente, determine la capacidad de respuesta de los anillos de músculo liso a una fuente exógena de óxido nítrico, como el lado del nitropress de sodio con y sin ODQ, un inhibidor de la ciclasa de guila soluble.

Este tipo de enfoque determinará un valor de relajación del 100% para los vasos y también demuestra la naturaleza esencial de la ciclasa de guila soluble en la mediación de la respuesta del óxido nítrico a la relajación vascular. Dado que ODQ evitará la relajación a nitro IDE de sodio en respuesta a la acetilcolina, los anillos aórticos de un control sano, los ratones se relajaron, mientras que los anillos aórticos de ratones con disfunción endotelial mostraron una relajación reducida debido a una reducción en la producción de óxido nítrico. También se llevaron a cabo ensayos de nitro sación específicos de grupo en los animales control de quimioluminiscencia del nitrito.

RSNO y RNNO se detectaron mediante un ensayo reductor de nitros. Al restar las áreas de pico, se midieron los niveles de nitrito y r sno. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del óxido nítrico y la biología vascular, como por ejemplo, ¿cómo reflejan los niveles circulantes de estos metabolitos de óxido nítrico los niveles tisulares y cómo cambian los metabolitos de la enfermedad en diferentes condiciones de enfermedad?

La determinación de las concentraciones en estado estacionario y la vida media de estos metabolitos relevantes del óxido nítrico en múltiples sistemas de órganos y a lo largo de la circulación de un solo animal permitirá la identificación de firmas moleculares específicas de los procesos de enfermedad y nos ayudará a definir nuevas modalidades de tratamiento basadas en el óxido nítrico, lo que permitirá al clínico disponer de mejores biomarcadores para la gravedad o progresión de la enfermedad. En general, las personas nuevas en el campo del ácido nítrico tendrán dificultades porque muchos minimizan la sensibilidad suficiente para detectar y cuantificar estos bajos niveles de metabolización de ácido tricial que se encuentran en las muestras biológicas. En primer lugar, una persona que no sea hábil en el arte probablemente creará artefactos durante el procesamiento de la muestra que deben ser datos erróneos y una mala interpretación de los datos.