Name: Técnicas analíticas para el ensayo de bioactividad del óxido nítrico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Aprende a detectar metabolitos de óxido nítrico en muestras biológicas mediante ensayos bioquímicos y anillos aórticos. Este método permite evaluar la función endotelial y comparar niveles entre grupos experimentales.

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Los autores desean agradecer a Hong Jiang, Ph.D. y Deepa Parathasarthy, MPH, BDS para la asistencia técnica.

1. Extracción de sangre total <ol><li> Recoger la sangre venosa de los seres humanos o de animales de experimentación con NEM / EDTA tubos que contienen. </li><li> Inmediatamente girar hacia abajo la sangre en una centrífuga de sobremesa a 14.300 RCF (fuerza centrífuga relativa) durante 7 minutos para preparar el plasma y los glóbulos rojos de pellets. </li><li> Preparar las muestras de plasma para la cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) y detección de quimioluminiscencia (CLD) el análisis. HPLC: Añadir 01:01 volumen de metanol frío a plasma, vórtice y se centrifuga a 13.200 rpm durante 10 minutos a precipitar las proteínas plasmáticas. Recoger sobrenadante para el análisis por HPLC. EPC: alícuota de una muestra y preincubar con sulfanilamida y cloruro de mercurio de nitrosotioles de ensayo en particular. </li><li> Preparar rojo sedimento celular para HPLC y el análisis de la EPC. HPLC: Añadir 1:04 rojo sedimento celular a una solución de lisis hipotónica que contiene 10 mM de NEM, 2,5 mM EDTA y 10 mM de ferricianuro. Mezclar bien y agregar 1:1 de metanol, vórtice y CentrifUGE a 13.200 rpm durante 10 minutos a la proteína de precipitado. Recoger sobrenadante para el análisis por HPLC. EPC. Añadir 1:04 rojo sedimento celular a una solución de lisis hipotónica que contiene 10 mM EDTA, 2,5 mM EDTA y 10 mM de ferricianuro. Las muestras alícuotas a tubos que contienen cloruro de sulfanilamida y mercúrico para la detección específica de nitrosotioles. </li></ol> 2. Extracción y Preparación de tejidos <ol><li> Para determinar los niveles tisulares de NO metabolitos, es primero necesario para cosechar tejido sangre libre para la preparación de muestras como se ha descrito anteriormente. Un intercambio de la sangre completa se llevará a cabo mediante la infusión de tampón fisiológico a través de la punta del ventrículo izquierdo. Una vez que todos se extrae la sangre, los tejidos de interés puede ser cosechado. </li><li> Homogeneizar las muestras de tejido y preparar muestras como se ha descrito anteriormente para HPLC y análisis EPC. </li></ol> 3. Anillos de aislamiento de la aorta para la función endotelial Tejido baño de órganos <ol><li> Los ratones se Anesthetized con éter dietílico hasta que ya no responden a los pies de apuro, y se someten a la dislocación cervical antes de la cirugía. La toracotomía se realiza para exponer la aorta torácica y abdominal. Una jeringa de calibre 25 se inserta en el vértice del ventrículo izquierdo y perfundidos libre de sangre oxigenada con tampón de Krebs Henseleit. </li><li> La aurícula derecha se corta para proporcionar una salida de sangre. Aorta abdominal se quitan y se limpian de la adventicia. </li><li> Anillos se corta en segmentos de 2 mm de largo y montado en un baño de tejido de cuatro canales de órganos (DMT 720MO, AD Instruments) bañado en una solución tampón fisiológico. </li><li> Los anillos de los buques se mantienen en baños de órganos de 10 ml con el tampón de Krebs oxigenada (95% O 2 y el 5% de CO 2) a 37 ° C. Una pretensión de gramos se coloca en cada anillo aórtico (la tensión de partida adecuado para la función vasomotora óptima según lo determinado en experimentos anteriores). Un niño de ocho canales octal puente (Powerlab) y de adquisición de datos de software (versión Gráfico 5.2.2) unavolver a utilizar para registrar todas las medidas de fuerza. </li><li> Los anillos se dejaron equilibrar durante 80 minutos con el tampón en cada baño de órganos cambiado cada 20 min. Después de equilibrar durante 80 min, 1 mM fenilefrina se añade a cada anillo de contracción submáxima. </li><li> Después de la estabilización, agonista endotelial tales como la acetilcolina se añadió para determinar la producción de NO y el grado de relajación del vaso. Después de la respuesta a la dosis de acetilcolina, baños se enjuagó y recontracted y se trató luego con una fuente exógena de óxido nítrico, nitroprusiato de sodio para determinar la capacidad de respuesta del músculo liso y para obtener un valor de 100% de relajación. </li><li> NO eliminadores se pueden añadir al baño para ilustrar claramente la liberación de NO y la inhibición de la relajación del vaso. </li></ol> 4. Los resultados representativos El uso de la ENO-20 HPLC dedicada proporciona un fácil utilizar el método de alto rendimiento para la detección específica y sensible de nitritos y nitratos enmatrices biológicas. El principio de detección y un cromatograma original se muestra en la Figura 1. Este método puede ser utilizado para cualquier muestra biológica para la determinación de nitrito y nitrato. Detección basada en la EPC de metabolitos NO requiere un paso derivatización química para determinar el origen molecular del NO. El montaje experimental para denitrosation simultánea oxidativo y denitrosation reductora para el detector de quimioluminiscencia se muestra en la Figura 2. El recipiente de reacción de la derecha se llena con ferricianuro 800mm en PBS pH 7,4 y el recipiente de reacción de la izquierda se llena con yoduro de potasio / yodo mezcla en ácido acético para denitrosation reducción (Figura 2A). La configuración completa se muestra en la Figura 2B. La Figura 3 muestra los ensayos de grupos específicos denitrosation que pueden detectar y cuantificar los nitritos, nitrosotioles, nitrosaminas, así como productos nitrosilo hemo. Este método ha sido previamente descricama y validado 4,5. Estos análisis bioquímicos importantes pueden estar correlacionados con los estudios funcionales sobre los anillos aórticos aislados para determinar la producción de NO endotelial en animales de experimentación. Este experimento farmacológico clásico puede con facilidad y evaluar con precisión la función endotelial y la producción. Medición de la reactividad buque a los agonistas endoteliales tales como la acetilcolina puede determinar directamente la producción de NO endotelial que puede ser correlacionado con biomarcadores bioquímicos detectados en la sangre y los tejidos de los animales experimentales. Una representación típica de una respuesta a la dosis de acetilcolina se muestra en la Figura 4. Ratones sanos de control con función endotelial normal responden a la acetilcolina mediante la relajación. Los ratones con disfunción endotelial (ratones hipercolesterolémicos) muestran la relajación reducida debido a la reducción de la producción de NO a los mismos estímulos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3722/3722fig1.jpg" /> HigoUre 1. Principio de la detección de nitrito y nitrato de Eno-20 y el cromatograma de la muestra. (Arriba) Esquema de ENO-20 método de detección de nitrito y nitrato. (Inferior) chromotogram estándar de 10 pmol nitrito y nitrato inyecta en ENO-20 (100 l de solución de 100 nM de nitrito y nitrato). Sensibilidad de 1 nM para cada anión con 100 l de volumen de inyección. No interfiere con la proteína o de una especie de color. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3722/3722fig2.jpg" /> Figura 2. EPC experimental de configuración mediante el uso tanto denitrosation oxidativo por denitrosation ferricianuro y reductora usando yoduro / yodo ensayo con detección de fase gaseosa de gas purgado de óxido nítrico. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3722/3722fig3.jpg" /> Figura 3. (Grupo A) de detección de quimioluminiscencia de nitrito, RSNO, RNNO ensayo denitrosation reductiva de la preincubación de la muestra con el grupo específico isquémicaAl reactivos. La sustracción de áreas de los picos permitir la detección de nitrito y RSNOs. (Grupo B) de detección quimioluminiscente de especies hemo nitrosilo que utilizan la solución de ferricianuro denitrosation oxidativo. Este método es específico para los productos NO-hemo sin reactividad cruzada con RSNOs (GSNO o albúmina SNO-), o RNNO (NO-pirrolidina y N-nitroso albúmina-). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3722/3722fig4.jpg" /> Figura 4. Ex vivo baño de órganos en los anillos aórticos aislados proporciona una medida directa de la producción de NO endotelial que luego puede ser correlacionada con biomarcadores bioquímicos detectados por HPLC y la EPC. Esta figura ilustra la relajación reduce en ratones con disfunción endotelial, debido a la disminución de la producción de NO.

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Los métodos descritos aquí para la cuantificación de los metabolitos de NO relevantes en múltiples compartimentos biológicos permitirá a las huellas dactilares del NO de la biología en la salud y la enfermedad que se puede correlacionar con las medidas funcionales de NO por el endotelio. Estos métodos requieren la preparación de muestras sencilla con un potencial de adaptación para un alto rendimiento. La cantidad relativa de estas moléculas pueden ayudar a comprender la producción de NO y su destino metabólico en un nú...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> N-etilmaleimida </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23030 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7889 </td></tr><tr><td> Ferricianuro potásico </td><td> Fluka </td><td> 60299 </td></tr><tr><td> HPLC </td><td> Eicom Corp </td><td> ENO-20 </td></tr><tr><td> Automuestreador </td><td> Alcott </td><td></td></tr><tr><td> DMT miografía </td><td> AD Instruments </td><td></td></tr><tr><td> PowerLab </td><td> AD Instruments </td><td></td></tr><tr><td> Quimioluminiscente </td><td> EcoPhysics </td><td> EPC 88Y </td></tr><tr><td> Centrifugar </td><td> Eppendorf </td><td> 5415D </td></tr><tr><td> La acetilcolina </td><td> Sigma-Aldrich</td><td> A6625 </td></tr><tr><td> R-(-) de fenilefrina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6126 </td></tr></tbody></table>

técnicas analíticas para el ensayo de bioactividad del óxido nítrico

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

El óxido nítrico (NO) es un radical libre diatómico que es muy corta duración en los sistemas biológicos (menos de 1 segundo en la sangre circulante) 1. NO puede ser considerada como una de las moléculas de señalización más importantes se producen en nuestro cuerpo, regulación de las funciones esenciales, incluyendo pero no limitado a la regulación de la presión arterial, la respuesta inmune y de la comunicación neuronal. Por lo tanto su detección y cuantificación precisa en matrices biológicas es fundamental para comprender el papel del NO en la salud y la enfermedad. Con una vida media corta fisiológica de NO, estrategias alternativas para la detección de productos de reacción de NO bioquímica se han desarrollado. La cuantificación de los metabolitos de NO relevantes en múltiples compartimentos biológicos proporciona una valiosa información con respecto a la producción de NO in vivo, la biodisponibilidad y el metabolismo. Basta con un solo compartimiento de muestreo, tales como sangre o plasma no siempre puede proporcionar una evaluación precisa de toda body No hay ningún estado, particularmente en los tejidos. La capacidad de comparar la sangre con los tejidos seleccionados en animales de experimentación ayudará a cerrar la brecha entre la ciencia básica y la medicina clínica en cuanto a la utilidad diagnóstica y pronóstica de NO biomarcadores en la salud y la enfermedad. Por lo tanto, la extrapolación de NO estado de plasma o sangre a los tejidos específicos de interés ya no es un enfoque válido. Como resultado, los métodos siguen siendo desarrollado y validado, que permiten la detección y cuantificación de los productos NO y NO relacionadas o metabolitos en los compartimentos múltiples de animales de experimentación in vivo. El paradigma establecido de la bioquímica de la producción de NO por el NO sintasa a la activación de la guanilato ciclasa soluble (GCs) a la oxidación final a nitrito (NO 2 -) y nitrato (NO 3 -) sólo puede representar parte de ninguna de los efectos in vivo. La interacción de los metabolitos de NO y NO-derivado con tioles de proteínas, aminas secundarias, y los metales para formar S-nitrosothioles (RSNOs), N-nitrosaminas (RNNOs), y nitrosilo hemo-representan respectivamente cGMP independientes efectos de NO y son probablemente tan importante como fisiológicamente activación de GCs por NO. Una verdadera comprensión de NO en la fisiología se deriva de los experimentos in vivo de muestreo compartimentos múltiples simultáneamente. El óxido nítrico (NO), la metodología es una ciencia compleja ya menudo confusa y el foco de muchos debates y discusión sobre la bioquímica NO. La elucidación de nuevos mecanismos y vías de señalización que involucran NO depende de nuestra capacidad de concreto, de forma selectiva y sensible detección y cuantificación de NO y NO todos los productos relevantes y sus metabolitos en matrices biológicas complejas. A continuación, presentamos un método para el análisis rápido y sensible de nitritos y nitratos por HPLC, así como la detección de NO libre en muestras biológicas de quimioluminiscencia basado en la capa de ozono in vitro con derivitazation química para determinar el origen molecular de NO, así como ex vivo conórgano miografía baño.

La producción endógena de óxido nítrico (NO) regula una amplia variedad de funciones biológicas. Cada vez es más claro que la interrupción o la desregulación de la señalización de NO basado en está involucrado en muchas enfermedades humanas. Los métodos para cuantificar los metabolitos relevantes no pueden proporcionar nuevos biomarcadores de diagnóstico o pronóstico de la enfermedad humana.

Técnicas analíticas para el ensayo de bioactividad del óxido nítrico

El óxido nítrico (NO) es un radical libre diatómico que tiene una vida extremadamente corta en los sistemas biológicos (menos de 1 segundo en la sangre circulante)1. El NO puede ser ...

El objetivo general del siguiente experimento es demostrar cómo detectar con precisión y especificidad los metabolitos del óxido nítrico en muestras biológicas. Esto se logra procesando primero las muestras de sangre inmediatamente después de su recolección para evitar la pérdida de metabolitos o la formación de artefactos. Al mismo tiempo, se realiza una extracción rápida y eficiente de tejidos para minimizar los efectos de un entorno hipóxico sobre los metabolitos del óxido nítrico.Se recolectan anillos aórticos y se suspenden en un baño de órganos para evaluar su función endotelial. Además, se utilizan ensayos bioquímicos para cuantificar los niveles de nitrato, niveles de nitrito y los niveles relativos de nitro tiololes y otros productos nitrosados en el tejido. Mediante estos ensayos, una comparación adecuada entre animales experimentales y controles puede generar información valiosa sobre la producción y el metabolismo del óxido nítrico.La principal ventaja de utilizar este enfoque multisistémico frente a métodos o ensayos individuales es que permitiría obtener una visión más amplia de la bioquímica del óxido nítrico en múltiples sistemas orgánicos. Así, podemos comenzar a c

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Los niveles de óxido nítrico (NO), molécula de señalización celular inflamatoria, se analizan comúnmente utilizando el reactivo de Griess. En este protocolo, hemos creado un ensayo de Griess modificado que utiliza tejido cerebral vivo de Drosophila para detectar la secreción de NO en un método simple, cuantificable y altamente repetible.

Nuevo ensayo cuantitativo de tejido completo de los niveles de óxido nítrico en la respuesta neuroinflamatoria de Drosophila

En este artículo se describe un método relativamente fácil adaptarse usando el colorante fluorescente diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) y dihydroethidium (DHE) para la detección simultánea en face y visualización de óxido nítrico intracelular (NO) y el anión superóxido (O 2 .- ), respectivamente, en las aortas recién aisladas intactos de un modelo de obesidad ratón.

En Detección de la cara del óxido nítrico y superóxido en la capa endotelial de las arterias intactas

&lt; clase p = 'jove_content'&gt;El óxido nítrico (NO) es una molécula de señalización importante en la homeostasis vascular. La producción de NO in vivo es demasiado baja para la medición directa. La quimioluminiscencia proporciona información útil sobre el ciclo del NO a través de la medición de sus precursores y productos de oxidación, nitrito y nitrato. Se explica la determinación de nitrito/nitrato en tejidos y fluidos corporales.

La medición de nitritos y nitratos, los metabolitos en el Oxido Nítrico, en Materiales Biológicos utilizando el método de quimioluminiscencia

Trabajos previos sugieren que la composición isotópica de nitrógeno de los óxidos de nitrógeno atmosférico podría distinguir la influencia de diferentes fuentes en el medio ambiente. Informamos sobre un método automatizado, móvil y basado en el campo para la alta eficiencia de recolección de NOatmosférico x para el análisis isotópico de N con una resolución horaria.

Automatizado, de alta resolución Sistema de Recolección móvil para el análisis isotópico de nitrógeno NO<sub&gt; x</sub

Este papel describe el óxido nítrico (NO) protocolos de fumigación para el control de plagas de postcosecha. Cámaras de fumigación se vuelcan con el nitrógeno (N2) establecer condiciones de oxígeno ultralow antes NO se inyecta. Al final, cámaras se vuelcan con N2 para diluir NO antes de exponer los productos al aire ambiente para evitar la exposición a2.

Procedimientos de laboratorio fumigación Control de plagas con Gas de óxido nítrico

Aquí, presentamos un protocolo para abordar el uso potencial de las plaquetas como un sensor altamente sensible de óxido nítrico en la sangre. Describe la preparación de plaquetas inicial y el uso de nitrito y desoxigenadas glóbulos rojos como generadores de óxido nítrico.

Detección basada en plaquetas de óxido nítrico en sangre mediante la medición de VASP fosforilación

Presentamos protocolos para tres métodos diferentes para la homogeneización de cuatro grupos musculares diferentes de tejido muscular esquelético de rata para medir y comparar los niveles de nitrato y nitrito. Además, comparamos diferentes pesos de muestra para investigar si el tamaño de la muestra de tejido afecta los resultados de la homogeneización.

Preparación de homogeneizados del músculo esquelético de rata para mediciones de nitratos y nitritos

Aquí, presentamos protocolos para detectar el óxido nítrico y sus derivados biológicamente relevantes utilizando ensayos basados en quimioluminiscencia con alta sensibilidad.

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Este protocolo describe un método para cuantificar la producción de óxido nítrico (NO) en cultivos epiteliales de las vías respiratorias diferenciados en la interfaz aire-líquido (ALI) midiendo nitrito en secreciones apicales mediante un ensayo de quimioluminiscencia basado en triioduros.

Medición de la producción de óxido nítrico en cultivos celulares epiteliales traqueales de ratón diferenciados en la interfaz aire-líquido

Un método de dos etapas para establecer la enfermedad renal crónica (ERC) en ratas Lewis mediante la extirpación quirúrgica 5/6th de masa renal se describe. Combinación de la intervención quirúrgica, NOS-inhibición y una dieta alta en sal conduce a un modelo parecido a ERC humana, permitiendo el estudio de los mecanismos causales y el desarrollo de nuevas intervenciones terapéuticas.

5/6th nefrectomía en combinación con dieta alta en sal y el óxido nítrico sintasa inhibición para inducir la enfermedad renal crónica en la rata Lewis

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