Un pulido y reforzado Diluido cráneo-Ventana para a largo plazo de imágenes del cerebro de ratón
7 de marzo de 2012
Se presenta un método para formar una ventana de imagen en el cráneo del ratón que se extiende milímetros y es estable durante meses sin inflamación del cerebro. Este método es muy adecuado para estudios longitudinales de flujo de sangre, la dinámica celular, y células / estructura vascular utilizando microscopía de dos fotones.
El objetivo general de este procedimiento es generar una ventana estable en el cráneo delgado sobre la corteza del ratón para permitir imágenes repetidas sin alterar el entorno intracraneal. Esto se logra primero fijando un soporte para la cabeza que permitirá mantenerla estable bajo el aparato de imagen. A continuación, se adelgaza cuidadosamente el cráneo en una región sobre la superficie dorsal del cerebro y se pulimenta la superficie con una lija fina.
Luego, cubra la ventana con una pequeña gota de pegamento de cianoacrilato y un cubreobjetos para reforzar la ventana. El paso final consiste en preparar al animal para la obtención de imágenes mediante el microscopio de dos fotones. En última instancia, la microscopía de dos fotones in vivo se utiliza para mostrar estructuras finas como arterias, venas capilares y dendritas neuronales, que pueden visualizarse hasta 250 micrómetros de profundidad en la corteza durante semanas.
La principal ventaja de esta técnica de ventana craneal es que el cráneo que recubre la corteza no se altera. Primero, adelgazamos el cráneo para obtener claridad óptica y luego reforzamos el cráneo con pegamento de cianoacrilato y la laminilla de cubreobjetos. Este método resultará útil para estudiar una diversidad de ratones transgénicos fluorescentes en estado anestesiado o en estados de OIC.
Para comenzar este procedimiento, autoclave las herramientas quirúrgicas necesarias, anestesie un ratón de aproximadamente tres a seis semanas de edad según los métodos descritos en el manuscrito adjunto. Verifique el reflejo mediante la compresión de los dedos del pie para asegurarse de que el ratón se encuentre en el plano quirúrgico de anestesia. A continuación, sujete firmemente al ratón en un estereotáxico.
Mantenga la temperatura corporal del ratón a 37 grados Celsius. Utilice una sonda rectal con regulación de retroalimentación y una almohadilla térmica. Aplique una pomada oftálmica a sus ojos para mantener la humedad.
Luego, afeite el cuero cabelludo con la cuchilla eléctrica pequeña. Después, limpie el cuero cabelludo con Betadine, seguido de la aplicación con hisopo de alcohol isopropílico al 70%. Luego, caliente una alícuota de líquido cefalorraquídeo artificial estéril a 37 grados Celsius bajo un microscopio.
Retire el cuero cabelludo de toda la superficie dorsal del cráneo con un par de tijeras quirúrgicas. Recorte la piel lateralmente hasta los bordes de los músculos temporales en ambos lados del cráneo y posteriormente a los músculos del cuello. A continuación, use una hoja de bisturí para eliminar el delgado periostio de la superficie del cráneo.
Luego seque y limpie el cráneo. A continuación, aplique una capa delgada de pegamento de cianoacrilato sobre la superficie del cráneo. Deje que el pegamento se seque completamente.
Esta capa de pegamento es necesaria para la correcta adherencia del cemento dental. En pasos posteriores, para la preparación de imágenes en animales despiertos, perforar orificios e introducir dos tornillos autorroscantes número 0 0 0 en la superficie del cráneo contralateral.
Luego, fije un conector rígido hecho a medida con dos puntos de fijación al cráneo. Esto reduce considerablemente los grados de libertad y simplifica la relocación del mismo campo de imagen en estudios longitudinales. Una barra transversal ancha también proporciona suficiente espacio para la colocación de electrodos y la estimulación de vibraciones.
A continuación, cubra toda la superficie del cráneo, excluyendo la ubicación de la ventana, con una capa de cemento dental; asegúrese de que todos los bordes expuestos de la piel queden cubiertos por el cemento. Antes de adelgazar el cráneo, verifique que las fresas del taladro estén afiladas y evite reutilizarlas. Utilice un taladro dental a baja velocidad para adelgazar una región de dos milímetros por dos milímetros sobre la corteza somatosensorial con una fresa de medio milímetro.
Luego, afine la superficie ósea seca solo durante unos pocos segundos a la vez con el cráneo, utilizando LCR periódicamente para evitar el calentamiento. A continuación, afine más el hueso. Cambie después la fresa a una velocidad más lenta y lima la superficie del cráneo con toques muy ligeros.
La perforación debe acercarse a la superficie en un ángulo de aproximadamente 30 grados con respecto a la vertical. Continúe adelgazando el hueso más allá de la capa vascular, hasta la segunda capa ósea, por encima de la superficie del cerebro.
Sostenga el taladro con movimientos pequeños y controlados, aplicando fuerza únicamente en dirección lateral. Cuando el hueso tenga aproximadamente 50 micrones de grosor, los vasos desprendidos deben ser claramente visibles a través del hueso húmedo. A esta profundidad, pequeñas manchas blancas dentro del hueso serán visibles durante unos segundos.
Inmediatamente después de humedecer la superficie ósea seca, el grosor óseo final debe ser de aproximadamente 10 a 15 micrones. Cuando el hueso sea suficientemente delgado, las pequeñas manchas blancas en el hueso ya no serán visibles al humedecer la superficie ósea seca. Ahora, pule la ventana con polvo de óxido de estaño.
Utilice una pequeña cantidad de polvo aproximadamente un cuarto del tamaño de la ventana, agite una suspensión del polvo con un LCR utilizando una broca previamente fabricada con una punta de silicona. Pule la superficie durante 10 minutos, elimine completamente el polvo de óxido de estaño de la ventana y seque el hueso. Este proceso debería ayudar a reducir cualquier borde irregular dejado por la broca durante el procedimiento de adelgazamiento.
A continuación, corte varios cuadrados pequeños de cubreobjetos número cero con un tamaño ligeramente menor que el de la ventana. Utilice un punzón para marcar suavemente líneas horizontales y verticales separadas en el cubreobjetos. Deslice con una regla recta sin romper el vidrio.
Luego coloque el cubreobjetos en una placa de Petri. Separe los fragmentos de vidrio golpeando la placa contra el borde de una mesa. Posteriormente, aplique una pequeña cantidad de pegamento Sano ACRL sobre la ventana utilizando la punta de madera de un aplicador de algodón roto.
Coloque rápidamente un trozo de vidrio cubreobjetos previamente cortado sobre el pegamento. Evite crear burbujas debajo del cubreobjetos después de permitir que el pegamento se seque completamente durante 15 minutos. Retire el exceso de pegamento de cianocrilato de la superficie superior del cubreobjetos con una hoja de bisturí.
Selle los bordes de la ventana con cemento dental. Luego forme un pozo ligeramente elevado para contener agua para el objetivo de inmersión al final. Coloque al animal en una jaula cálida hasta que se recupere completamente de la anestesia.
En este paso, estabilice el animal sobre una plataforma óptica para la obtención de imágenes y utilice el marco como soporte para la cabeza. Nuestra placa independiente puede transportar al animal y todos los dispositivos de monitoreo fisiológico ensamblados como una unidad entre los sitios quirúrgico y de obtención de imágenes mediante fotones dobles. Si se desea obtener imágenes del flujo sanguíneo, inyecte 0,05 mililitros de colorante de dextrano fluorescente al 5 % a través de la vena infraorbitaria para marcar el suero sanguíneo.
Esto debe realizarse bajo anestesia general y el colorante generalmente permanece en la circulación durante varias horas. Inyecte solución de Ringer con lactato por vía intraperitoneal en un volumen de tres microlitros por gramo cada dos horas para mantener los líquidos corporales y los requerimientos energéticos. Despierte al ratón interrumpiendo el flujo de isoflurano.
Una hora después de despertar, el ratón está listo para la obtención de imágenes. Cierre la jaula sobre el microscopio para evitar la contaminación por luz. Se muestra aquí un ejemplo de la vasculatura cortical de un muslo, un ratón YFP marcado mediante inyección intravenosa de dextrano conjugado con Texas Red; los vasos durales suelen ser visibles ligeramente por encima de la superficie cortical en la duramadre.
Las arterias grandes y las es se encuentran en la superficie cortical. Los vasos penetrantes se ramifican a partir de esta red superficial y se adentran en la corteza, donde se ramifican en una densa red capilar que alimenta el tejido cortical. Esta película muestra la vasculatura en la superficie de la corteza en un ratón despierto.
Se pueden observar oscilaciones espontáneas en el diámetro arterial cuando el animal se encuentra en un estado de reposo tranquilo. Este método debería ser útil para estudiar una amplia variedad de animales transgénicos fluorescentes en estado anestesiado o despierto.
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Descripción general
Este artículo presenta un método para crear una ventana de imagen estable en el cráneo de ratón, que permite la obtención de imágenes a largo plazo sin inflamación cerebral. La técnica es particularmente útil para estudios longitudinales que implican el flujo sanguíneo y la dinámica celular.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Técnicas de Imagen
- Dinámica Celular
Antecedentes
- Las ventanas de imagen estables son cruciales para estudios in vivo.
- Los métodos tradicionales pueden alterar el entorno intracraneal.
- La microscopía de dos fotones permite la obtención de imágenes profundas de estructuras cerebrales.
- Los estudios longitudinales requieren condiciones estables a lo largo del tiempo.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para la obtención de imágenes estables de la corteza del ratón.
- Facilitar la realización repetida de imágenes sin provocar inflamación.
- Mejorar el estudio del flujo sanguíneo y de las estructuras celulares.
Métodos Utilizados
- Fijar un soporte craneal estable para la obtención de imágenes.
- Afinar el cráneo sobre la superficie dorsal del cerebro.
- Pulir la superficie del cráneo para mejorar la claridad.
- Reforzar la ventana con pegamento de cianoacrilato y un cubreobjetos.
Resultados Principales
- Creación exitosa de una ventana de imagen estable.
- Capacidad para obtener imágenes de estructuras hasta 250 micrómetros de profundidad.
- Estabilidad a largo plazo observada durante semanas.
- Visualización eficaz de estructuras arteriales y capilares.
Conclusiones
- El método permite la obtención de imágenes no disruptivas de la corteza del ratón.
- Permite estudios detallados de la dinámica celular y del flujo sanguíneo.
- Esta técnica puede avanzar la investigación en neurociencia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La obtención de imágenes longitudinales in vivo de la función cortical requiere un acceso óptico estable sin alterar el entorno intracraneal, una necesidad fundamental para la validación de dianas en neurociencia preclínica. La ventana de cráneo delgado pulido y reforzado (PoRTS) permite sesiones repetidas de imagen durante meses con mínima inflamación, apoyando la reducción mecanicista de riesgos en hipótesis terapéuticas en sistemas relevantes para la enfermedad. Este enfoque mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al proporcionar lecturas cuantitativas y reproducibles de la dinámica celular y vascular en preparaciones anestesiadas y despiertas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la comprobación de hipótesis terapéuticas mediante imágenes longitudinales de la vasculatura cortical y estructuras neuronales sin romper el cráneo.
- Valor operativo: Reduce la variabilidad biológica al mantener la integridad del entorno intracraneal durante sesiones repetidas.
- Valor predictivo: Aumenta la confianza en el objetivo al permitir la visualización de los efectos del fármaco sobre el flujo sanguíneo y la función celular durante períodos prolongados.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para la estandarización de ensayos posteriores al proporcionar una plataforma de imagen estable.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante una preparación consistente de la ventana y una claridad óptica mantenida durante semanas.
- Escalabilidad: Facilita la reutilización de la plataforma en diferentes modelos transgénicos fluorescentes para la evaluación de compuestos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la relevancia para la enfermedad al permitir la obtención de imágenes de la función cortical tanto en estados anestesiados como despiertos.
- Valor operativo: Facilita la alineación de biomarcadores traslacionales mediante el seguimiento longitudinal de las respuestas vasculares y celulares.
- Reducción de riesgos: Informa decisiones de avance ajustadas al riesgo al reducir variables de confusión derivadas de la perturbación quirúrgica.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
La ventana PoRTS se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del objetivo hasta la investigación preclínica, permitiendo la monitorización continua de las respuestas biológicas sin interrupción del entorno.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante imágenes repetidas de estructuras corticales a lo largo del tiempo.
- Selección: Permite la preparación de ensayos mediante la preparación estandarizada y reproducible de ventanas con una penetración en profundidad cuantitativa de hasta 250 μm.
- Análisis: Proporciona resultados medibles, como oscilaciones del diámetro vascular y dinámicas de la red capilar, para el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con la continuidad preclínica al permitir la obtención de imágenes en estados de vigilia que reflejan mejor las respuestas fisiológicas.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad reutilizable en diversos estudios, reduciendo la necesidad de preparaciones quirúrgicas repetidas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante la reducción de la ambigüedad mecanicista y la obtención de imágenes longitudinales estables.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad entre laboratorios y sistemas modelo.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance o interrupción del proyecto mediante la reducción del riesgo biológico en fases tardías derivado de la alteración intracraneal.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo basada en lecturas funcionales longitudinales en lugar de puntos finales terminales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de microcirugía y preparación de ventanas craneales.
- Necesita instrumentación de precisión, incluyendo fresas dentales, agentes pulidores y sistemas de microscopía de dos fotones.
- Exige estandarización entre equipos para protocolos consistentes de adelgazamiento y refuerzo del cráneo.
- Implica consideraciones de adaptación entre cepas de ratones y modelos transgénicos para lograr una claridad óptica óptima.
- Está limitado por la necesidad de mantenimiento periódico para prevenir la deslaminación del cubreobjetos o la degradación del adhesivo en estudios a largo plazo.
