Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP), utilizando Drosophila Tejido

Este procedimiento genera datos de inmunoprecipitación de cromatina a partir de tejido de mosca disecado para reflejar con precisión el estado de la cromatina en tejido de Drosophila in vivo. En este caso, se recolectan cientos de testículos mediante disección manual. Se realizan ensayos de inmunoprecipitación de cromatina utilizando un anticuerpo contra la proteína de interés.

Realice un ensayo de análisis cuantitativo de R-T-P-C-R de seguimiento para enriquecer la región genómica específica en el ADN inmunoprecipitado purificado. Alternativamente, la secuenciación de alto rendimiento de la muestra de chip genera un perfil a nivel del genoma. En última instancia, el análisis de chip de tejido diseccionado proporciona una representación del estado de la cromatina en células provenientes de sus condiciones fisiológicas.

Este protocolo está optimizado para el análisis de tejidos aislados directamente del organismo. Con el fin de obtener estados de cromatina e información epigenética bajo condiciones fisiológicas reales, demostraremos el uso de chip en Drosophila para observar el estado del cromatón. Este protocolo puede aplicarse a otros organismos como el ratón o el pez cebra.

La demostración visual de este protocolo es fundamental para obtener ADN de calidad y cantidades insuficientes para su uso en chips o para la generación de bibliotecas de secuenciación destinadas a secuenciación de alto rendimiento. Primero, diseccionar el tejido de interés, en este caso aproximadamente 200 pares de testículos de Drosophila, en PBS frío que contenga inhibidor de proteasas y PMSF a 100 microgramos por mililitro. Después de enjuagar el tejido dos veces, resuspender en 200 microlitros de la misma solución de PBS con inhibidores.

Luego, fijar la muestra con 5,5 microlitros de formaldehído al 37 % calentado. Incubar a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Vortexar cada cinco minutos y dejar que el tejido se sedimente en hielo.

Lave dos veces con 450 microlitros de PBS que contenga inhibidores. Almacene las muestras a menos 20 grados Celsius. Combine las muestras de testículos de 200 oph en un tubo einor de 1,75 mililitros.

Aspire el tampón y re suspenda las muestras en 200 microlitros de tampón de lisis. Disocie completamente el tejido con un homogenizador azul, asegurándose de que no queden agregados, e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Luego, fragmente la muestra con un microchip soat y déjela reposar en hielo durante 50 segundos. Repita cuatro a cinco veces para obtener el tamaño óptimo de fragmento para el objetivo del chip. A continuación, diluya con 1,8 mililitros de tampón ripper para obtener un stock de extracto de cromatina. Para un ensayo de chip exitoso, es fundamental determinar empíricamente el tamaño de los fragmentos de ADN.

Por lo tanto, necesitamos realizar electroforesis en gel para proceder al experimento con el chip. Para la muestra de control de entrada, retire 50 microlitros. Añada dos microlitros de cloruro de sodio 5 M e incube a 65 grados Celsius durante la noche.

Para revertir el entrecruzamiento, proceda a conjugar el anticuerpo con la proteína. Añada perlas en un tubo fendor de 1,5 mililitros. Agregue 40 microlitros de perlas de proteína A y 600 microlitros de PBS, agite a cuatro grados Celsius durante dos minutos.

Luego, coloque las perlas en el imán y deseche el sobrenadante. Ahora agregue 100 microlitros de PBS y también el anticuerpo de interés. Incube a temperatura ambiente durante una hora.

Después de recolectar las perlas mediante el imán, añada un mililitro de extracto de cromatina de tejido. Incube a cuatro grados celsius durante la noche con rotación. A continuación, coloque la muestra de chip sobre un imán y elimine el sobrenadante.

Proceda a lavar las perlas recolectadas con un mililitro de tampón durante 10 minutos cada lavado a cuatro grados SIU, luego re suspenda las perlas en 100 microlitros de tampón TE. Para revertir los enlaces cruzados de los complejos proteína-ADN, agregue tres microlitros de SDS al 10 % y cinco microlitros de proteinasa K a 20 miligramos por mililitro. Incube a 65 grados Celsius durante la noche.

Centrifugar las perlas en un imán. Transferir el sobrenadante que contiene ADN a un nuevo tubo. Lavar las perlas una vez y combinar los sobrenadantes que contienen ADN 2D.

A continuación, purifique el ADN mediante una extracción con fenol-cloroformo y transfiera la capa acuosa superior a un tubo nuevo. Precipite el ADN con 20 microgramos por mililitro de acrilamida lineal o glucógeno, 20 microlitros de acetato de sodio tres molar y 500 microlitros de etanol al 100%.

Mezcle bien e incube a menos 80 grados Celsius durante 10 minutos. Precipite el ADN mediante centrifugación. Deseche el sobrenadante y lave el precipitado una vez con 300 microlitros de etanol al 70% después de secarlo al aire.

Rehidrate los pellet de ADN en 50 microlitros de tampón TE. Almacene las muestras de ADN fragmentado a menos 20 grados Celsius. Prepare una dilución seriada de ADN genómico para la curva patrón.

En una placa de 96 pocillos, utilizando plantillas de ADN genómico diluido como control de entrada o ADN fragmentado, prepare 20 microlitros de QPCR por duplicado y gire la placa de 96 pocillos en el mini centrífugo para placas. Ejecute la placa de muestras en un sistema de PCR en tiempo real para validar los datos. Primero, verifique la presencia de un único pico en el gráfico de disociación térmica, indicativo de un único amplicón proveniente de la PCR.

A continuación, trace la curva patrón. Utilizando los datos de la serie de ADN genómico diluido, calcule la fórmula que determina la cantidad de ADN según el umbral de ciclos, Ct. También determine la fase lineal de la amplificación exponencial de la PCR para cada par de cebadores.

Si el valor de CT de las muestras de ADN de la cromatina y del control de entrada se encuentra dentro del rango lineal del valor de CT, entonces calcule el enriquecimiento del ADN de la cromatina en comparación con la entrada tomada en consideración. El factor de dilución repara los extremos de 0,1 a cinco microgramos de ADN de la cromatina en reacciones de 50 microlitros que contienen ADN polimerasa T4 y polinucleótido cinasa T4. Incube durante 45 minutos a temperatura ambiente según las instrucciones del fabricante.

Luego, purifique el ADN utilizando un kit de limpieza de reacción MinLu. Continúe agregando extremos salientes al extremo tres prima con una fragmento grande de ADN polimerasa uno CLA NOW y DATP; incube durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Nuevamente, pase la reacción por una columna giratoria para purificar y concentrar el ADN.

Proceda a la ligación con el oligonucleótido adaptador. Mezcle a partir de Illumina utilizando T four DNA Ligase e incube durante una hora a temperatura ambiente. Luego, pase la muestra a través del kit de purificación de reacción MinElute.

Eluir el ADN en 20 microlitros. A continuación, separar la muestra de ADN mediante electroforesis utilizando el aparato egel. Aislar la banda de 200 a 400 pares de bases en el gel y purificarla utilizando el kit de extracción de gel KYOGEN.

Ahora amplifique una biblioteca utilizando cebadores de extremo emparejado, enzimas de fusión HF y pH del programa Illumina durante 20 ciclos de PCR. Luego, en un gel estándar de AOSE al 2%, aísle fragmentos de ADN de 200 a 400 pares de bases para secuenciación de alto rendimiento en el software de Ellen. Alinee todas las lecturas con el genoma de Drosophila, permitiendo hasta dos discrepancias con la secuencia de referencia.

Mantenga las lecturas únicamente mapeadas para el análisis posterior en múltiples lecturas idénticas. Mantenga hasta tres copias para reducir la posibilidad de sesgos derivados de la amplificación por PCR. A continuación, utilice un script de Python para convertir la salida de la tubería de GA en archivos de datos extensibles para navegadores.

Establezca un tamaño de ventana de cuatro pares de bases y un tamaño de fragmento de ADN de 160 pares de bases. Clasifique los genes de drosófila en genes silenciosos y genes expresados mediante RPKM. Número digital, designe los genes con RPKM igual a cero.

Como un grupo silente, clasifique los genes con RPKM mayor a uno en un grupo expresado con tres subgrupos de niveles bajos, moderados y altos de expresión. Finalmente, compare los niveles de modificación de histonas y de expresión génica utilizando un script de Python descrito previamente en basal 2007, el bag of marbles. Los testículos mutantes presentan una falla en la transición de espermatogonias proliferativas a espermatocitos diferenciados.

Este experimento de qPCR utiliza testículos BAM como fuente de células germinales no diferenciadas para analizar el estado de la cromatina de genes clave necesarios para la diferenciación espermática, así como el enriquecimiento de modificaciones histónicas, como la trimetilación de la lisina 27 de la histona H3 o la trimetilación de la lisina 4 de la histona H3. La expresión de los genes de diferenciación se determina mediante normalización respecto a un gen de referencia expresado constitutivamente. Los genes de diferenciación, como el factor de transcripción específico masculino 87 Don Juan y fuzzy onion, que no se expresan en los testículos BAM, están altamente enriquecidos con la modificación represiva de trimetilación de la lisina 27 de la histona H3.

Además, carecen de la histona activa. Tres, lisina cuatro metil tres, una modificación histónica. Una firma de cromatina que denominamos monovalente, en contraste con la valencia que presenta tanto el lisina tres metil tres de la histona tres como la histona tres.

Lisina 27 metil tres enriquecida en genes de diferenciación en células madre embrionarias. Datos de secuenciación de ChIP utilizando el mismo conjunto de anticuerpos. Confirman el resultado de qPCR de ChIP mostrado en la figura 1A: las regiones genómicas de los tres genes de diferenciación terminal analizados están altamente enriquecidas con lisina tres, 27 metil tres, pero no con histona tres, lisina cuatro metil tres.

En contraste, la ciclina del envejecimiento expresada constitutivamente presenta una alta metilación de lisina tres en la histona cuatro, pero baja metilación de lisina 27 en la histona tres cerca de su sitio de inicio de la transcripción. Esta figura muestra datos de ChIP-seq de dos modificaciones histónicas cerca de los sitios de inicio de la transcripción de cuatro clases de genes expresados diferencialmente. La metilación de lisina 27 en la histona tres está enriquecida aguas abajo de los sitios de inicio de la transcripción, lo cual se encuentra inversamente correlacionado con el nivel de expresión génica.

Los genes silenciosos presentan el nivel más alto de metilación tres de la lisina 27 de la histona tres; los genes altamente expresados no muestran unión de metilación tres de la lisina 27 de la histona tres, lo cual es consistente con el papel represor de la metilación tres de la lisina 27 de la histona tres en la expresión génica. Por el contrario, el enriquecimiento de la modificación metilación tres de la lisina cuatro de la histona tres alrededor de los sitios de inicio de la transcripción mostró una correlación opuesta con el nivel de expresión génica, lo cual es consistente con el papel activo de esta marca histónica —la metilación tres de la lisina cuatro de la histona tres— en la expresión génica.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse correctamente en dos o tres días. No olvide utilizar precauciones de seguridad al usar fenol, cloroformo y formaldehído. Esperamos que este protocolo le haya proporcionado una comprensión suficiente sobre el uso de la inmunoprecipitación de cromatina para analizar el paisaje de cromatina en tejido in vivo.