Name: Radioactivo In situ La hibridación para la detección de diversos patrones de expresión génica en el tejido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 38 s
Description: Aprende hibridación in situ radioactiva para detectar patrones de expresión génica en tejidos de vertebrados. Este método permite visualizar transcritos de baja abundancia y preservar la integridad tisular.

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Los autores desean agradecer a todos los miembros de Jarvis de laboratorio que mejoraron el protocolo a través de los años.

<ol><li>Clayton, D. F., Huecas, M. E., Sinclair-Thompson, E. Y., Nastiuk, K. L., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probes+for+rare+mRNAs+reveal+distributed+cell+subsets+in+canary+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain.</a> Neuron. 1, 249-261 (1988).</li>
<li>Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E. D., Hagiwara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+glutamate+receptors+in+avian+neural+pathways+for+learned+vocalization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization.</a> J. Comp. Neurol. 476, 44-64 (2004).</li>
<li>Haesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP2+expression+in+avian+vocal+learners+and+non-learners%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners.</a> J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).</li>
<li>Jarvis, E. D., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor-driven+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Motor-driven gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4097-4102 (1997).</li>
<li>Holzenberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+insulin-like+growth+factor+II+in+the+songbird+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain.</a> J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).</li>
<li>Mahmood, R., Mason, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+hybridization+of+radioactive+riboprobes+to+RNA+in+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections.</a> Methods Mol. Biol. 461, 675-686 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li>
<li>Acloque, H., Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+analysis+of+chick+embryos+in+whole-mount+and+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections.</a> Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).</li>
<li>Moorman, A. F., Houweling, A. C., de Boer, P. A., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+nonradioactive+detection+of+mRNA+in+tissue+sections%3A+novel+application+of+the+whole-mount+in+situ+hybridization+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol.</a> J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).</li>
<li>Horita, H., Wada, K., Rivas, M. V., Hara, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dusp1+immediate+early+gene+is+regulated+by+natural+stimuli+predominantly+in+sensory+input+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901 (2010).</li>
<li>Braissant, O., Wahli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+in+situ+hybridization+protocol+using+non-radioactively+labelled+probes+to+detect+abundant+and+rare+mRNAs+on+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemica%22%5BJournal%5D)">A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections.</a> Biochemica. 1, 10-16 (1998).</li>
<li>Kubikova, L., Wada, K., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+receptors+in+a+songbird+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dopamine receptors in a songbird brain.</a> J. Comp. Neurol. 518, 741-769 (2010).</li>
<li>Wada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+neuroethological+approach+for+identifying+and+characterizing+a+cascade+of+behaviorally+regulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).</li>
<li>Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+brains+and+a+new+understanding+of+vertebrate+brain+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).</li>
<li>Hoke, K. L., Ryan, M. J., Wilczynski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+cues+shift+functional+connectivity+in+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717 (2005).</li>
<li>Burmeister, S. S., Jarvis, E. D., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+behavioral+and+genomic+responses+to+social+opportunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity.</a> PLoS. Biol. 3, e363(2005).</li>
<li>Jarvis, E. D., Schwabl, H., Ribeiro, S., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+gene+regulation+by+territorial+singing+behavior+in+freely+ranging+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds.</a> Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).</li>
<li>Jarvis, E. D., Scharff, C., Grossman, M. R., Ramos, J. A., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+whom+the+bird+sings%3A+context-dependent+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">For whom the bird sings: context-dependent gene expression.</a> Neuron. 21, 775-788 (1998).</li>
<li>Feenders, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mapping+of+movement-associated+areas+in+the+avian+brain%3A+a+motor+theory+for+vocal+learning+origin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin.</a> PLoS One. 3, e1768(2008).</li>
<li>Chen, C. C., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributions+of+two+gonadotropin-releasing+hormone+receptor+types+in+a+cichlid+fish+suggest+functional+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization.</a> J. Comp. Neurol. 495, 314-323 (2006).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

Radiactivos hibridación in situ de la expresión del ARNm es ampliamente utilizado para múltiples propósitos, incluyendo para el estudio de la organización del tejido regional, tipos de células, y la actividad funcional del cerebro 2-5,10,12-14. El uso posterior está en los genes cuya expresión de ARNm en el cerebro depende de una mayor actividad neuronal, a menudo llamados los genes dependientes de la actividad o de genes tempranos inmediatos. Con esta finalidad, nuestro método ha sido aplicado a través de múltiples especies, en particular en las aves, los mamíferos (humanos), los peces y los anfibios; en varios tejidos, incluyendo cerebro, piel y músculo, y de edades múltiples, incluyendo los neonatos o recién nacidos, menores de edad , los adultos, y aquí, en secciones de embriones enteros 2,3,5,15-17. Las características especiales de nuestro protocolo incluyen: (1) Se produce un equilibrio entre la especificidad anatómica y la especificidad cuantitativa. Para cuantificar la expresión génica en la película de rayos X, tomamos fotografías digitales de las imágenes (por ejemplo:. Fig. 1A y 1B), utilice el Photoshop (Adobe) la función de histograma para medir la densidad de píxeles en las regiones de interés y restar los niveles de fondo de la película fuera de los tejidos, pero todavía en el portaobjetos de vidrio 2,4. Para cuantificar la expresión a nivel celular, tomamos las imágenes de los granos de plata sobre las células con gran aumento (40-100X, Fig. 4). A continuación, utilizamos el umbral y las funciones de medida de la J de la imagen de Wayne Rasband en los NIH para contar el número de granos de plata en la imagen, se resta el recuento de fondo en un área similar sin células de la lámina de vidrio, se divide por el número de células, para obtener valores de expresión por célula. 4,18 (2) Se puede medirse el flujo relativamente alta, permitiendo el procesamiento de 100-200 diapositivas simultáneamente, debido a la junta de cubreobjetos apretado creado por el baño de aceite mineral. Standard in situ los métodos de hibridación tomar más tiempo para sellar los portaobjetos con parafina, esmalte de uñas, y otros medios, donde las diapositivas ocupan mucho espacio, (3) Es muysensible para transcripciones de baja abundancia debido a sulfato de dextrano y solución de Denhardt en el tampón de hibridación 2,13; (4) El enfoque de imágenes en campo oscuro produce imágenes de alto contraste, debido a la toma de fotografías bajo iluminación en campo oscuro en un microscopio de disección 4,5. Además, permite la detección sensible de los pequeños cambios en la expresión génica, tales como en la expresión génica dependiente de la actividad para identificar regiones específicas del cerebro activadas durante la percepción y la producción de comportamientos específicos 19. Las limitaciones relativas a no radiactivos protocolos son que los últimos son más clara en la resolución celular y la localización del ARNm dentro de la célula, y trabajando con emulsión es muy sensible a la manipulación y la luz. Es posible combinar nuestro método con otros métodos, tales como no radiactivos en hibridación in situ para etiquetar la expresión del ARNm de más de un gen en el mismo tejido 10,17,20. Se puede combinar con inmunocitoquímicapara etiquetar ambos ARN y la expresión de proteínas en la misma muestra con el fin de co-localizar el ARNm con ciertos tipos de células 10. Las modificaciones de protocolo necesarios para tales experimentos de marcaje doble se describen en las referencias citadas. En resumen, nuestro enfoque facilita la comprensión del momento y la localización celular de la expresión génica con el fin de entender la organización la región, la actividad del tejido funcional, y la función del gen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> El anhídrido acético </td><td> VWR </td><td> MK242002 </td><td></td></tr><tr><td> Cloroformo </td><td> VWR </td><td> BDH1109 </td><td></td></tr><tr><td> Acetato de violeta de cresilo </td><td> Sigma </td><td> C5042 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Thermo Scientific </td><td> Microm HM550 </td><td></td></tr><tr><td> Formamida desionizada </td><td> Sigma </td><td> F9037 </td><td></td></tr><tr><td> TDT </td><td> Promega </td><td> P1171 </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> ED </td><td></td></tr><tr><td> Incrustación de molde </td><td> VWR </td><td> 15160-215 </td><td></td></tr><tr><td> Fisher marca Superfrost Plus diapositivas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-034-979 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Formaldehído </td><td> VWR </td><td> BDH0506-4LP </td><td></td></tr><tr><td> Formamida </td><td> Sigma </td><td> F7508 </td><td></td></tr><tr><td> GENECLEAN kit </td><td> Q-Bio gen </td><td> 1001-200 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak Biomax MR película </td><td> Sigma </td><td> Z350370 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak NTB Emulsión </td><td> Carestream Health </td><td> 8895666 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak Professional Developer D19 </td><td> Kodak </td><td> 1462593 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak Professional Fixer </td><td> Kodak </td><td> 1971746 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Calbiochem </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Aceite mineral </td><td> VWR </td><td> IC15169491 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> VWR </td><td> SX0600-1 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> Sigma </td><td> 76240 </td><td></td></tr><tr><td> Poli A </td><td> Invitrogen </td><td> POLYA.GF </td><td></td></tr><tr><td> rATP </td><td> Promega </td><td> P1132 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> rCTP </td><td> Promega </td><td> P1142 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> rGTP </td><td> Promega </td><td> P1152 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> RNasin </td><td> Promega </td><td> N2111 </td><td> 40Units/μl </td></tr><tr><td> S 35 UTP </td><td> PerkinElmer </td><td> NEG039C001MC </td><td></td></tr><tr><td> Seguridad-Solve solución </td><td> Resolver Investigación de Productos de Seguridad Internacional </td><td> 111177 </td><td></td></tr><tr><td> Acetato de sodio </td><td> Sigma </td><td> S7899 </td><td> 3M </td></tr><tr><td> Fosfato sódico dibásico </td><td> Sigma </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato sódico monobásico </td><td> Sigma </td><td> S3139 </td><td></td></tr><tr><td> SP6ARN polimerasa </td><td> Promega </td><td> P1085 </td><td></td></tr><tr><td> La tinción parrilla de metal </td><td> Microscopía Electrónica de Ciencias </td><td> 70312-54 </td><td></td></tr><tr><td> T7 ARN polimerasa </td><td> Promega </td><td> P2075 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek octubre </td><td> Sakura </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Transcripción tampón 5x </td><td> Promega </td><td> P1181 </td><td></td></tr><tr><td> Trietanolamina </td><td> VWR </td><td> IC15216391 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCl (1 M, pH 8,0) </td><td> VWR </td><td> 101449-446 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> Roche </td><td> 10109509001 </td><td></td></tr></tbody></table> Soluciones: <ol><li> Reactivos para la fabricación de riboprobes: 1,5 l de ADN plantilla (0,2-0,3 g / l), 2 l de tampón 5x transcripción optimizado, 1 l de DTT 100 mM (viene con la polimerasa de Promega, la mezcla depocillo a temperatura ambiente), 0,3 l de RNasin (40 unidades / l), 1,5 l de solución de AGC mezcla ribonucleótido, 3,5 l de S 35 UTP, y 1 l ARN polimerasa. Lleve hasta 10 ml con agua libre de nucleasa. </li><li> Ribonucleótido AGC mezcla de solución: mezclar cantidades iguales de 10 mM de ATP, GTP y CTP juntos. </li><li> Solución de acetato de sodio para EtOH precipitación para eliminar 35 S libre UTP: 40 l RNasa y DNasa agua libre, 5 l de acetato sódico 3M, y 125 l de EtOH al 100%. </li><li> Hibridación tampón (10 ml stock): 5 ml de 100% de formamida desionizada, 600 l de NaCl 5M, 1M Tris-HCl (pH = 8,0), 240 l de EDTA 0,5 M (pH = 8,0), 100 l de solución de Denhart 100x, 100 l de 1M TDT, 250 l de 20mg/ml ARNt, 125 l de 20 mg / ml de poli A, y 1 g de sodio sulfato de dextrano. Añadir agua tratada con DEPC para llevar el volumen total a 10 ml. Agitar vigorosamente y luego se incuba a 55 ° C hasta que todo el sulfato de dextrano sódico se disuelve. Almacenar el tampón de hibridación en el-20 ° C, lo que es bueno para ~ 6 meses. </li><li> 4% tamponada solución de paraformaldehído: Añadir 40 g de paraformaldehido en 760 ml de agua destilada en un matraz designado para paraformaldehído, el calor a 50 ° C sobre una placa caliente mientras se agita. Añadir 320 l de NaOH 10N para ayudar a disolver el paraformaldehido. Después de la disolución (~ 10 minutos), añadir 100 ml de PBS 10x, y llevar el volumen con agua destilada hasta 1 litro. Agitar y calentar la solución hasta que se disuelve paraformaldehído. El pH debe ser 7,4. </li><li> La acetilación tampón: 13,6 ml de trietanolamina además 2,52 ml de anhídrido acético en 1 litro de agua destilada. </li><li> 20x SSPE solución: 3M NaCl, 200 mM NaH 2 PO 4-H 2 O, y 200 mM EDTA en agua destilada. Ajuste solución a pH 7,4 con NaOH 10N. </li><li> 10x tampón PBS: 80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, y 2,4 g de KH 2 PO 4 en agua destilada. Ajuste solución a pH 7,0 y llevar el volumen total a 1 Liter. </li><li> Segunda solución de lavado: 0,1% β-mercaptoetanol y 50% de formamida en 2x SSPE </li><li> Violeta de cresilo solución de acetato: 3% de acetato de violeta de cresilo en agua del grifo (agua destilada evita buena tinción), se disolvió durante la noche con agitación en un matraz a temperatura ambiente. Filtrar por succión de vacío a través de un papel de filtro Whatman 1 mm y un embudo de Buchner. </li></ol>

radioactivo in situ la hibridación para la detección de diversos patrones de expresión génica en el tejido

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Conociendo el tiempo, nivel, localización celular, y el tipo de células que un gen se expresa en contribuye a la comprensión de la función del gen. Cada una de estas características se puede lograr con la hibridación in situ a ARNm en las células. Aquí les presentamos una radiactivo en el método de hibridación in situ modificado a partir de Clayton et al. (1988) 1, que ha estado trabajando con éxito en nuestro laboratorio desde hace muchos años, especialmente para los adultos cerebro de un vertebrado 2-5. Los largos ARN complementario (cRNA) sondas a la secuencia diana permite la detección de las transcripciones de baja abundancia 6,7. La incorporación de nucleótidos radiactivos en las sondas cRNA permite la sensibilidad de detección adicional de las transcripciones de baja abundancia y análisis cuantitativos, ya sea por la luz sensible película de rayos X o emulsión revestido sobre el tejido. Estos métodos de detección de proporcionar un registro a largo plazo de un gen determinado. En comparación con los no radiactivo de la sonda de metanfetaminamétodos, como DIG-etiquetado, el método de sonda de hibridación radiactiva no requiere de varios pasos de amplificación utilizando HRP-anticuerpos y / o kit de la TSA para detectar la transcripción de baja abundancia. Por lo tanto, este método proporciona una relación lineal entre la intensidad de señal y las cantidades específicas de mRNA para el análisis cuantitativo. Se permite el tratamiento 100-200 diapositivas simultáneamente. Funciona bien para diferentes etapas de desarrollo de los embriones. Mayoría de los estudios de desarrollo de la expresión génica utilizar embriones enteros y los enfoques no radiactivos 8,9, en parte porque el tejido embrionario es más frágil que el tejido adulto, con una menor cohesión entre las células, lo que hace difícil ver los límites entre las poblaciones de células con las secciones de tejido. En contraste, el enfoque radiactivos, debido a la mayor gama de sensibilidad, es capaz de obtener un mayor contraste en la resolución de la expresión génica entre las regiones de tejido, por lo que es más fácil de ver los límites entre las poblaciones. El uso de este método, los investigadores podrían revelar laposible significado de un gen recién identificado, y además predecir la función del gen de interés.

Este protocolo se utiliza con éxito para detectar cuantitativamente los niveles y los patrones espaciales de la expresión del ARNm de múltiples tipos de tejidos a través de las especies de vertebrados. El método puede detectar transcripciones baja abundancia y permite el tratamiento de cientos de diapositivas simultáneamente. Se presenta el protocolo de uso de perfiles de expresión de la formación del cerebro del embrión aviar como ejemplo.

Radioactivo In situ La hibridación para la detección de diversos patrones de expresión génica en el tejido

Conocer el momento, el nivel, la localización celular y el tipo de célula en los que se expresa un gen contribuye a nuestra comprensión de la función de dicho gen. ...

El objetivo general del siguiente experimento es identificar regiones con expresión génica particular y caracterizar el momento y los niveles de expresión génica para contribuir al entendimiento de la función génica. Esto se logra recolectando y preparando rápidamente el tejido que se utilizará en el procedimiento, a fin de preservar la integridad del tejido. Como segundo paso, el tejido se trata para reducir la unión de fondo de las sondas ribonucleicas.A continuación, los sondas ribo se hibridan con el tejido y se visualiza la unión de la sonda RIBA. Mediante el uso de película de rayos X o emulsión sensible a la luz, se obtienen resultados que muestran la ubicación y el nivel de expresión génica basados en imágenes de rayos X o en microscopía de campo oscuro y campo claro, junto con su análisis. Utilizando el software Image J, existen varios pasos críticos que deben realizarse correctamente y en los que muchas personas cometen errores, siendo uno de ellos la prevención del fondo.Por lo tanto, hay varios pasos que pueden generar fondo, como una fijación deficiente o hibridar a una temperatura inadecuada. Otra causa es la contaminación con RNAsa, que degradará su sonda de ARN. Por ello, debe tener cuidado de mantener todo libre de RNAsas.Y el tercero es que, cuando se sumergen los portaobjetos en la emulsión, debe asegurarse de que no haya fugas de luz en su cuarto oscuro ni exposición de la emulsión durante todas las etapas de ese proceso, el cual puede durar hasta tres semanas. Para demostrar esta técnica, contaremos con Hun Chen, quien es postdoctorado en mi laboratorio. Después de extraer un cerebro fresco y enjuagarlo en PBS 1×, incruste el cerebro en medio OCT Tissue-Tek® sumergiendo el cerebro en un molde que contiene el medio a temperatura ambiente.Asegúrese de que el cerebro esté orientado según sea necesario para el corte. Luego, después de rociar el hielo seco con etanol, congele el tejido colocando el bloque en la mezcla de etanol y hielo seco. Teniendo cuidado de no introducir etanol dentro del bloque, corte el tejido congelado en secciones de 10 a 12 micrones de grosor utilizando un criostato y monte las secciones sobre portaobjetos super plus para tejido cerebral y embrionario.La mejor temperatura de corte se encuentra entre menos 18 grados Celsius y menos 20 grados Celsius. Almacene las secciones en una caja para portaobjetos a menos 80 grados Celsius. Transfiera los portaobjetos desde el almacenamiento a menos 80 grados Celsius hacia una rejilla metálica sobre hielo seco.Luego, mientras trabaja en una campana extractora certificada, coloque la gradilla en una solución de paraformaldehído al 4 % que se haya precalentado a entre tres y cinco grados Celsius por encima de la temperatura ambiente. Incube durante cinco minutos a temperatura ambiente; tras la incubación, retire la gradilla del paraformaldehído y lave las laminillas sumergiendo la gradilla en PBS 15 veces. Repita este paso de lavado dos veces, utilizando cada vez solución fresca de PBS.A continuación, sumerja los portaobjetos en tampón de acetilación recién preparado durante 10 minutos para reducir la unión no específica de la sonda RIBA. Luego, lave los portaobjetos como antes, pero esta vez utilizando SSPE dos veces como solución de lavado. Deshidrate el tejido mediante una serie de etanol al 70 %, 95 % y 100 %, durante dos minutos en cada solución.Luego, seque las laminillas en la campana extractora durante al menos 10 a 15 minutos. Después de sintetizar la sonda RIBA, según las instrucciones del protocolo escrito, calcule el volumen requerido de la sonda RIBA y de la solución de hibridación necesario para todas las laminillas. Precaliente la mezcla de hibridación con la sonda Ribo a 65 grados Celsius durante cinco minutos.Para desnaturalizar la sonda Ribo, pipetee 100 microlitros de la solución de hibridación de la sonda Ribo y alinéela sobre el cubreobjetos. Luego, utilice un segundo cubreobjetos de vidrio para distribuir la solución uniformemente sobre el tejido y el cubreobjetos. Coloque el portaobjetos en posición horizontal y orientado hacia arriba en un bastidor metálico y, cuando todos los portaobjetos estén listos, sumerja lentamente el bastidor en un baño de aceite a 65 grados Celsius durante un mínimo de cuatro horas y un máximo de 16 horas.El aceite crea un sello hermético alrededor de las laminillas después de la incubación. Retire cualquier exceso de aceite del soporte metálico que contiene las laminillas. Luego coloque el soporte en una bandeja de vidrio o metal que contenga cloroformo, dentro de una campana extractora. Repita el lavado con una segunda bandeja que contenga cloroformo fresco.A continuación, sumerja el portaobjetos en una solución de 0,1 % beta me cap en etanol más SSPE al doble de concentración para aflojar las laminillas y disolver el exceso de solución de hibridación. Luego, transfiera los portaobjetos a una segunda solución fresca de 0,1 % beta me cap en etanol más SSPE al doble de concentración. Transfiera los portaobjetos descubiertos a un portaobjetos fresco en una bandeja que contenga 0,1 % beta macca en etanol TER en SSPE al doble de concentración, incubando esta solución durante una hora a temperatura ambiente para eliminar el exceso de sonda de ARN no unido.Luego, transfiera el portaobjetos al baño precalentado de SSPE 2 veces más solución principal al 50% a 65 grados Celsius que contiene beta-ME (mercaptoetanol) hasta una concentración final del 0,1% e incube a 65 grados Celsius durante una hora. Tras la incubación, deseche esta y todas las soluciones acuosas de lavado anteriores, así como los cubreobjetos, como residuo radiactivo. A continuación, lave los portaobjetos dos veces en SSPE 0,1 veces precalentado a 65 grados Celsius durante 30 minutos cada vez.Luego deshidrate el tejido mediante una serie de etanol al 70 %, 95 % y 100 % durante dos minutos en cada solución. Finalmente, seque las laminillas en una campana extractora durante al menos 30 minutos. Primero, determine si hay una señal radiactiva presente en el tejido.Coloque las laminillas secas en una cubeta para películas, trabajando en una habitación oscura y utilizando una luz segura, coloque una película de rayos X sobre las laminillas. Asegúrese de que las laminillas estén en contacto con el lado de la emulsión de la película y luego cierre la cubeta. Exponga las laminillas a la película durante uno a siete días, dependiendo de la abundancia esperada de los transcritos.Una vez finalizada la exposición, revele la película de rayos X en revelador y fijador estándar. La señal de hibridación aparecerá como áreas negras en la película, resultado de los granos de plata expuestos en la emulsión, próximos a determinar la resolución celular y a observar la señal en el tejido mismo. Los portaobjetos se sumergen en emulsión fotográfica y luego se tiñen con tinción de contraste.Si las láminas deben teñirse con contracolorante de violeta de cresilo, entonces las secciones deben desparafinarse según las instrucciones del protocolo escrito. En este momento, trabajando en la oscuridad, vierta agua destilada en un tubo. Tome con una espátula emulsión uc NTB y diluya la emulsión con agua destilada en una proporción uno a uno.Después de fundir la emulsión en un baño de agua a 42 grados Celsius durante 20 a 30 minutos, transfiérala a un recipiente de vidrio para inmersión en un baño de agua a 42 grados Celsius durante 20 a 30 minutos. El nivel de la emulsión diluida ahora debe cubrir todas las secciones de un portaobjetos cuando se sumerge en ella. Si hay muchos portaobjetos, puede ser necesario emulsión adicional.Ahora sumerja los portaobjetos en la emulsión diluida en un baño de agua a 42 grados Celsius, y luego seque los portaobjetos sumergidos en un recipiente cerrado hermético, protegido de la luz, durante la noche en la oscuridad o en un horno a 37 grados Celsius durante dos o tres horas con las luces apagadas. Después del secado, transfiera los portaobjetos a una caja para portaobjetos. Selle los bordes con cinta aislante negra y luego cúbralos con papel de aluminio.Guarde las cajas a cuatro grados Celsius durante varios días o semanas hasta que estén listas para revelar; caliente las láminas a temperatura ambiente. Luego, trabajando en la oscuridad, retire el portaportaobjetos que contiene las láminas de las cajas y revélelas en el revelador codec D 19 a 16 grados Celsius durante tres a cinco minutos. A continuación, lave las láminas reveladas con agua del grifo a temperatura ambiente durante un minuto.Luego, incubar las laminillas dos veces en la solución fijadora a 19 grados Celsius durante seis minutos cada vez; las luces del cuarto pueden encenderse durante la segunda incubación en el fijador. Ahora, lavar las laminillas con agua corriente a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. A continuación, utilizando una cuchilla de afeitar, raspar la emulsión de la parte posterior de la laminilla mientras aún esté húmeda.Finalmente, contratiñir con violeta de cresilo al 0,3 %, luego deshidratar y montar las laminillas según las instrucciones del protocolo escrito, si es necesario. Retirar además cualquier exceso de emulsión en la parte posterior de las laminillas humedeciéndolas con agua y raspando con una hoja de bisturí. Enjuagar las laminillas en solución de etanol al 80 % y limpiar suavemente una o dos veces para eliminar residuos y polvo.Tome imágenes bajo iluminación de campo oscuro o campo claro. Puede ser necesario repetir los pasos de raspado y limpieza dos o tres veces para obtener imágenes de buena calidad sin partículas de polvo, que son fácilmente visibles en campo oscuro bajo un microscopio estereoscópico. Las siguientes imágenes son ejemplos de autorradiografías de hibridación in situ provenientes de películas de rayos X.Esta imagen de película de rayos X muestra una sección sagital completa de la cabeza del pájaro cantor de cebra en el día embrionario 10, hibridizada con una sonda ribo antisentido para Fox P1. Los granos negros expuestos en la película muestran la expresión de ARN mensajero, como se puede observar dentro de los cuatro cerebros. El ARN mensajero de Fox P1 está enriquecido en el mesoalioestriado y el tálamo dorsal aquí. La imagen de la película de rayos X muestra una sección del mismo pájaro cantor de cebra que ha sido hibridizada con la sonda RIBA de 90 centavos para Cuper.TF dos Co.TF dos está enriquecido en la región del palam alium y del tálamo más ventral. Las siguientes imágenes son ejemplos de auto radiografía de hibridación in situ obtenidas mediante diapositivas sumergidas en emulsión. Esta imagen de campo oscuro, tomada bajo un microscopio de disección, muestra una sección sagital de toda la cabeza de un pinzón cebra en el sexto día posterior a la eclosión, que ha sido hibridada con una sonda de ARN antisentido para Fox P uno.Los granos de plata blancos expuestos en la emulsión por encima del tejido muestran la expresión del ARN mensajero. El color rojo representa la tinción con violeta de kreosol. La barra de escala representa un milímetro.Aquí la imagen muestra una sección del mismo pájaro cantor, el pinzón cebra, que ha sido hibridado con una sonda de ARN antisentido para el factor de transcripción coop TF dos. Las siguientes imágenes comparan la marcación con sondas antisentido y sentido, que muestran patrones diferentes en la auto radiografía sobre películas de rayos X de cortes de cabeza de pinzón cebra obtenidos en el día embrionario 12. La línea discontinua indica el contorno de todo el cerebro y la C marca el cerebelo.Puede observarse que la hebra antisentido de PAC seis se expresa en el cerebro, especialmente en la zona ventricular. Esta sección adyacente hibridada con la hebra sentido de PAC seis no revela expresión de fondo en toda la cabeza del embrión, pero sí una expresión aparente en la capa de pigmento de la retina, al igual que la hebra antisentido. Las siguientes imágenes muestran en C dos señales de expresión génica y portaobjetos recubiertos con emulsión tomados del cerebro de pinzón cebra durante etapas embrionarias tardías, observados en vistas de campo claro y campo oscuro.Esta imagen de campo claro muestra la expresión de D one B en el día embrionario 10. Tras una exposición normal a la emulsión, la marca que aparece negra apenas puede verse a este aumento. Esta imagen muestra una sección e aumento idénticos a los observados en la imagen anterior, pero cambiada a la vista de campo oscuro, mostrando la marcación en blanco en el estriado y el tálamo.Esta imagen de campo claro muestra la expresión de slit tres en el día embrionario 12. Tras una sobrexposición a la emulsión, la etiqueta negra puede verse fácilmente. SC marca la posición de la médula espinal y CB marca la posición del cerebelo.La orientación rostral está hacia la izquierda. La imagen mostrada aquí corresponde a la misma sección y la magnificación es idéntica, pero se ha cambiado a la vista de campo oscuro, mostrando la marcación en blanco en la médula espinal que coincide con la imagen de campo claro. Las siguientes imágenes muestran la resolución de granos de plata a nivel celular.Se muestra aquí la etiqueta del mensajero de Fox P uno, ARN, en el prosencéfalo del pinzón cebra; los granos de plata aparecen como puntos negros sobre las células teñidas con violeta cristal. Esta imagen muestra una expresión de alta abundancia sobre células individuales en el mesoalio del pinzón cebra adulto. Esta imagen muestra una expresión de baja abundancia sobre células individuales en el alio adyacente de la misma sección aquí.Hola Fox. La expresión de un mensajero de ARN sobre las células se observa en el mesoalio del día embrionario 12.Las células embrionarias que se observan aquí son más pequeñas y están más estrechamente empaquetadas en comparación con las células adultas vistas en las dos imágenes anteriores. Finalmente, esta imagen muestra una expresión de baja abundancia sobre las células en el alium adyacente de la misma sección. Tras seguir este procedimiento, se puede realizar otro método como la inmunoquímica para responder preguntas adicionales, como en qué tipo celular se expresa el gen diana.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la hibridación en el instituto. No olvide que trabajar con reactivos radiactivos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de protecciones personales, durante este procedimiento.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Hibridación in situ para la localización precisa de las transcripciones de las plantas

Este video describe una estrategia de hibridación secuencial que implica la hibridación de sondas de ARNm con ARNm objetivo específico. Después de la hibridación de la sonda, se realiza una amplificación de la señal para mejorar la resolución a través de la reducción de la relación señal-ruido durante el ARN-CISH de las muestras histológicas.

Hibridación de sonda y amplificación de señal en ARN Hibridación in situ: una técnica para detectar secuencias específicas de ARN en secciones de tejido

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