Radioactivo In situ La hibridación para la detección de diversos patrones de expresión génica en el tejido

El objetivo general del siguiente experimento es identificar regiones con expresión génica particular y caracterizar el momento y los niveles de expresión génica para contribuir a la comprensión de la función génica. Esto se logra recolectando y preparando rápidamente el tejido que se utilizará en el procedimiento, a fin de preservar la integridad del tejido. Como segundo paso, el tejido se trata para reducir la unión de fondo de las sondas de ARN.

A continuación, los sondas de ARN se hibridan con el tejido y se visualiza la unión de la sonda RIBA. Mediante el uso de película de rayos X o emulsión sensible a la luz, se obtienen resultados que muestran la localización y el nivel de expresión génica basados en imágenes de rayos X o en microscopía de campo oscuro y claro y su análisis. Utilizando el software Image J, existen varios pasos críticos que deben realizarse correctamente y en los que muchas personas cometen errores, siendo uno de ellos la prevención del fondo.

Por lo tanto, hay varios pasos que pueden generar fondo, como una fijación deficiente o no hibridar a la temperatura adecuada. Otra causa es la contaminación con ARN, que degradará su sonda de ARN. Por ello, debe tener cuidado en mantener todo libre de ARNas.

Y el tercero es que, cuando las láminas se sumergen en la emulsión, debe asegurarse de que no haya fugas de luz en su cuarto oscuro ni exposición de la emulsión durante todas las etapas de ese proceso, el cual puede durar hasta tres semanas. Para demostrar esta técnica, estará presente Hun Chen, quien es un investigador posdoctoral en mi laboratorio. Después de extraer un cerebro fresco y enjuagarlo una vez con PBS, incruste el cerebro en medio OCT Tissue-Tek sumergiendo el cerebro en un molde que contenga el medio a temperatura ambiente.

Asegúrese de que el cerebro esté orientado según sea necesario para el corte. Luego, después de rociar el hielo seco con etanol, congele el tejido colocando el bloque en la mezcla de etanol y hielo seco. Tenga cuidado de no introducir etanol dentro del bloque; corte el tejido congelado en secciones de 10 a 12 micrones de espesor utilizando un microtomo criostato y monte las secciones sobre portaobjetos super plus para tejido cerebral y embrionario.

La mejor temperatura de corte se encuentra entre menos 18 grados Celsius y menos 20 grados Celsius. Almacene las secciones en una caja de portaobjetos a menos 80 grados Celsius. Transfiera los portaobjetos desde el almacenamiento a menos 80 grados Celsius hasta un soporte metálico sobre hielo seco.

Luego, mientras trabaja en una campana extractora certificada, coloque el portaobjetos en una solución de paraformaldehído al 4 % que se haya precalentado a entre tres y cinco grados Celsius por encima de la temperatura ambiente. Incube durante cinco minutos a temperatura ambiente; tras la incubación, retire el portaobjetos del paraformaldehído y lave los portaobjetos sumergiendo el soporte en PBS 15 veces. Repita este paso de lavado dos veces utilizando cada vez una solución fresca de PBS.

A continuación, sumerja los portaobjetos en tampón de acetilación recién preparado durante 10 minutos para reducir la unión no específica de la sonda RIBA. Luego, lave los portaobjetos como antes, pero esta vez utilizando SSPE al doble de concentración como solución de lavado. Deshidrate el tejido mediante una serie de etanol al 70, 95 y 100 % durante dos minutos en cada solución.

Luego, seque las laminillas en la campana extractora durante al menos 10 a 15 minutos. Después de sintetizar la sonda RIBA, según las instrucciones del protocolo escrito, calcule el volumen requerido de la sonda RIBA y de la solución de hibridación necesarios para todas las laminillas. Precaliente la mezcla de hibridación de la sonda Ribo a 65 grados Celsius durante cinco minutos.

Para desnaturalizar la sonda Ribo, pipetee 100 microlitros de la solución de hibridación de la sonda Ribo y alinee sobre el cubreobjetos. Luego, utilice un segundo cubreobjetos de vidrio para distribuir la solución uniformemente sobre el tejido y el cubreobjetos. Coloque el portaobjetos en posición horizontal y orientado hacia arriba en un soporte metálico y, cuando todos los portaobjetos estén listos, sumerja lentamente el soporte en un baño de aceite a 65 grados Celsius durante un mínimo de cuatro horas y un máximo de 16 horas.

El aceite crea un sello hermético alrededor de las laminillas tras la incubación. Retire cualquier exceso de aceite del soporte metálico que contiene las laminillas. Luego coloque el soporte en una bandeja de vidrio o metal que contenga cloroformo, dentro de una campana extractora. Repita el lavado con una segunda bandeja que contenga cloroformo fresco.

A continuación, sumerja el portaobjetos en una solución de 0,1 % beta me cap en etanol más SSPE al doble de concentración para aflojar las laminillas y disolver el exceso de solución de hibridación. Luego transfiera los portaobjetos a una segunda solución fresca de 0,1 % beta me cap en etanol más SSPE al doble de concentración. Transfiera los portaobjetos descubiertos a un portaobjetos nuevo colocado en una bandeja que contenga 0,1 % beta macca en etanol TER en SSPE al doble de concentración, incubando esta solución durante una hora a temperatura ambiente para eliminar el exceso de sonda de ARN no unido.

Luego, transfiera el portaobjetos al baño precalentado de SSPE 2 veces más solución principal con 50% de formamida a 65 grados Celsius que contiene beta-ME (mercaptoetanol) a una concentración final de 0,1%, e incube a 65 grados Celsius durante una hora. Tras la incubación, deseche esta y todas las soluciones acuosas de lavado anteriores, así como las cubreobjetos, como residuo radiactivo. A continuación, lave los portaobjetos dos veces con SSPE 0,1 veces precalentado a 65 grados Celsius, durante 30 minutos cada vez.

Luego deshidrate el tejido mediante una serie de etanol al 70 %, 95 % y 100 % durante dos minutos en cada solución. Finalmente, seque las laminillas en una campana extractora durante al menos 30 minutos. Primero, determine si hay una señal radiactiva presente en el tejido.

Coloque las laminillas secas en una cubeta de película, trabajando en una habitación oscura con luz segura, y coloque una película de rayos X sobre las laminillas. Asegúrese de que las laminillas estén en contacto con el lado de la emulsión de la película y luego cierre la cubeta. Exponga las laminillas a la película durante uno a siete días, dependiendo de la abundancia esperada de los transcritos.

Una vez finalizada la exposición, revele la película de rayos X en revelador y fijador estándar. La señal de hibridación aparecerá como áreas negras en la película, resultado de los granos de plata expuestos en la emulsión, adyacentes a la resolución celular y para observar la señal en el tejido mismo. Las laminillas se sumergen en emulsión fotográfica y luego se tiñen de contraste.

Si las láminas deben contratinjirse con violeta de cresilo, entonces las secciones deben desparafinizarse según las instrucciones del protocolo escrito. En este momento, trabajando en la oscuridad, vierta agua destilada en un tubo. Tome la emulsión NTB uc y diluya la emulsión con agua destilada en una proporción uno a uno.

Después de fundir la emulsión en un baño de agua a 42 grados Celsius durante 20 a 30 minutos, transfiérala a un recipiente de vidrio para inmersión en un baño de agua a 42 grados Celsius durante 20 a 30 minutos. El nivel de la emulsión diluida ahora debe cubrir todas las secciones de un portaobjetos cuando se sumerge en ella. Si hay muchos portaobjetos, puede ser necesario agregar emulsión adicional.

Ahora sumerja los portaobjetos en la emulsión diluida en un baño de agua a 42 grados Celsius, y luego seque los portaobjetos sumergidos en un recipiente cerrado hermético durante la noche en la oscuridad o en un horno a 37 grados Celsius durante dos o tres horas con las luces apagadas. Después del secado, transfiera los portaobjetos a una caja para portaobjetos. Selle los bordes con cinta aislante negra y luego cúbralos con papel de aluminio.

Guarde las cajas a cuatro grados Celsius durante varios días o semanas hasta que estén listas para revelar; caliente las láminas a temperatura ambiente. Luego, trabajando en la oscuridad, retire el portaportaobjetos que contiene las láminas de las cajas y revélelas en el revelador codec D 19 a 16 grados Celsius durante tres a cinco minutos. A continuación, lave las láminas reveladas con agua del grifo a temperatura ambiente durante un minuto.

A continuación, incubar las laminillas dos veces en solución fijadora a 19 grados Celsius durante seis minutos cada vez; las luces del cuarto pueden encenderse durante la segunda incubación en el fijador. Ahora lavar las laminillas con agua corriente a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Luego, utilizando una cuchilla de afeitar, raspar la emulsión desde la parte posterior de la laminilla mientras aún esté húmeda.

Finalmente, contratiña con violeta de genciana al 0,3 %, luego deshidrate y monte las laminillas según las instrucciones del protocolo escrito, si es necesario. Limpie adicionalmente cualquier exceso de emulsión en la parte posterior de las laminillas humedeciéndolas con agua y raspando con una hoja de afeitar. Enjuague las laminillas en solución de etanol al 80 % y limpie suavemente una o dos veces para eliminar residuos y polvo.

Tome imágenes bajo iluminación de campo oscuro o campo claro. Puede ser necesario repetir los pasos de raspado y limpieza dos o tres veces para obtener buenas imágenes sin partículas de polvo, que son fácilmente visibles en campo oscuro bajo un microscopio estereoscópico. Las siguientes imágenes son ejemplos de auto radiografía de hibridación in situ procedentes de películas de rayos X.

Esta imagen de película de rayos X muestra una sección sagital de toda la cabeza del pájaro cantor de pecho rayado en el día embrionario 10, hibridada con una sonda ribo antisentido para Fox P1. Los granos negros expuestos en la película indican la expresión de ARN mensajero, observable dentro del cerebro. El ARN mensajero de Fox P1 está enriquecido en el mesoalioestriado y el tálamo dorsal aquí. La imagen de película de rayos X muestra una sección del mismo pájaro cantor de pecho rayado que ha sido hibridada con la sonda RIBA de 90 centavos para Cuper.

TF dos Co.TF dos está enriquecido en la región del palam alium y del tálamo más ventral. Las siguientes imágenes son ejemplos de auto radiografía de hibridación in situ a partir de portaobjetos tratados con emulsión. Esta imagen de campo oscuro, tomada bajo un microscopio de disección, muestra una sección sagital de toda la cabeza de un pinzón cebra en el sexto día posterior a la eclosión, que ha sido hibridada con una sonda de ARN antisentido para Fox P uno.

Los granos de plata blancos expuestos en la emulsión por encima del tejido muestran la expresión del ARN mensajero. El color rojo representa la tinción con violeta de kreosol. La barra de escala representa un milímetro.

Aquí la imagen muestra una sección del mismo pájaro cantor, el pinzón cebra, que ha sido hibridado con una sonda de ARN antisentido para el factor de transcripción Coop TF dos. Las siguientes imágenes comparan la marcación con sondas antisentido y sentid, que muestran patrones diferentes en la auto radiografía sobre películas de rayos X de cortes de cerebro de pinzones cebra tomados en el día embrionario 12. La línea discontinua indica el contorno de todo el cerebro y la C marca el cerebelo.

Puede observarse que la hebra antisentido de PAC seis se expresa en el cerebro, especialmente en la zona ventricular. Esta sección adyacente hibridada con la hebra sentido de PAC seis no revela expresión de fondo en toda la cabeza del embrión, pero sí una expresión aparente en la capa de pigmento de la retina, al igual que la hebra antisentido. Las siguientes imágenes muestran en C dos señales de expresión génica y portaobjetos recubiertos con emulsión tomados del cerebro de pinzón cebra durante etapas embrionarias tardías, observados en vistas de campo claro y campo oscuro.

Esta imagen de campo claro muestra la expresión de D one B en el día embrionario 10. Tras una exposición normal a la emulsión, la marca que aparece negra apenas puede verse a este aumento. Esta imagen muestra una sección e aumento idénticos a los observados en la imagen anterior, pero cambiada a la vista de campo oscuro, mostrando la marcación en blanco en el estriado y el tálamo.

Esta imagen de campo brillante muestra la expresión de slit tres en el día embrionario 12. Tras una sobreexposición a la emulsión, la etiqueta negra puede observarse fácilmente. SC marca la posición de la médula espinal y CB marca la posición del cerebelo.

La orientación rostral está hacia la izquierda. La imagen mostrada aquí corresponde a la misma sección y la magnificación es idéntica, pero se ha cambiado a vista de campo oscuro, mostrando la marcación en blanco en la médula espinal que coincide con la imagen de campo claro. Las siguientes imágenes muestran la resolución de granos de plata a nivel celular.

Se muestra aquí la etiqueta del mensajero de Fox P uno, ARN, en el prosencéfalo del pinzón cebra; los granos de plata aparecen como puntos negros sobre células teñidas con violeta de genciana. Esta imagen muestra una expresión de alta abundancia sobre células individuales en el mesoalio del pinzón cebra adulto. Esta imagen muestra una expresión de baja abundancia sobre células individuales en el alio adyacente de la misma sección aquí.

Hola Fox. La expresión del ARNm del gen P uno se observa en las células del mesénquima del día embrionario 12.

Las células embrionarias que se observan aquí son más pequeñas y están más densamente empaquetadas en comparación con las células adultas vistas en las dos imágenes anteriores. Finalmente, esta imagen muestra una expresión de baja abundancia en células del alium adyacente de la misma sección. Tras seguir este procedimiento, se puede realizar otro método, como la inmunoquímica, con el fin de responder preguntas adicionales, como en qué tipo celular se expresa el gen diana.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la hibridación in situ. No olvide que trabajar con reactivos radiactivos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de protecciones personales, durante este procedimiento.