Radioactivo In situ La hibridación para la detección de diversos patrones de expresión génica en el tejido

El objetivo general del siguiente experimento es identificar regiones de expresión génica particular y caracterizar el momento y los niveles de expresión génica para contribuir a la comprensión de la función génica. Esto se logra mediante la recolección y preparación rápida del tejido que se utilizará en el procedimiento para preservar la integridad del tejido. Como segundo paso, el tejido se trata para reducir la unión de fondo de las sondas ribográficas.

A continuación, las sondas ribo se hibridan con el tejido y se visualiza la unión de la sonda RIBA. Mediante el uso de películas de rayos X o emulsiones sensibles a la luz, se obtienen resultados que muestran la ubicación y el nivel de expresión génica basados en imágenes de rayos X o microscopía y análisis de campo oscuro y claro. Con el software Image J, hay varios pasos críticos que deben hacerse bien en los que muchas personas cometen errores y uno de ellos es evitar el fondo.

Por lo tanto, hay una serie de pasos que pueden darle antecedentes, como una mala sación o no hibridar a la temperatura adecuada. Otra es la contaminación por ARN que degradará su sonda de ARN. Por lo tanto, debe tener cuidado de mantener todo libre de ARN.

Y la tercera es que los portaobjetos cuando se sumergen en la emulsión, hay que asegurarse de que no hay fugas de luz en la habitación oscura o de la emulsión de exposición a lo largo de todas las etapas de ese proceso, que puede durar tres semanas. Así que la demostración de esta técnica estará a cargo de Hun Chen, que es un postdoctorado en mi laboratorio. Después de recolectar un cerebro fresco y enjuagarlo una vez, PBS incrusta el cerebro en medios de tecnología de tejido OCT sumergiendo el cerebro en un molde que contiene los medios a temperatura ambiente.

Asegúrese de que el cerebro esté orientado según sea necesario para seccionar. Luego, después de rociar el hielo seco con etanol, congele el tejido colocando el bloque en la mezcla de etanol y hielo seco. Teniendo cuidado de no meter el etanol dentro del bloque con un criostato, corte el tejido congelado en secciones de 10 a 12 micras de espesor y móntelo en portaobjetos súper plus para el cerebro y el tejido embrionario.

La mejor temperatura de corte está dentro del rango de menos 18 grados Celsius a menos 20 grados Celsius. Guarde las secciones en una caja deslizante a menos 80 grados centígrados. Transfiera los portaobjetos del almacenamiento de menos 80 grados Celsius a un estante de metal sobre hielo seco.

Luego, mientras trabaja en una campana extractora certificada, coloque la rejilla en una solución de 4% para formaldehído que haya sido advertida previamente de tres a cinco grados Celsius por encima de la temperatura ambiente. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente después de la incubación, retirar la rejilla del paraformaldehído y lavar los portaobjetos sumergiendo la rejilla en PBS 15 veces. Repita este paso de lavado dos veces con una solución fresca de PBS cada vez.

A continuación, sumerja los portaobjetos en un tampón de acetilación recién preparado durante 10 minutos para reducir la unión inespecífica de la sonda RIBA. A continuación, lave los portaobjetos como antes, pero esta vez utilizando dos veces SSPE como solución de lavado. Deshidratar el tejido a través de una serie de 70, 95 y 100% etanol durante dos minutos en cada solución.

A continuación, seque los portaobjetos en la campana extractora durante al menos 10 a 15 minutos. Después de sintetizar la sonda RIBA, de acuerdo con las instrucciones del protocolo escrito, calcule el volumen requerido de sonda RIBA y la solución de hibridación necesaria para todas las diapositivas. Precaliente la mezcla de hibridación de la sonda Ribo a 65 grados centígrados durante cinco minutos.

Para desnaturalizar la sonda Ribo, pipetea 100 microlitros de la solución de hibridación de sonda Ribo y alinearla a lo largo del cubreobjetos. A continuación, utilice un segundo cubreobjetos de vidrio para esparcir la solución de manera uniforme sobre el pañuelo y el cubreobjetos. Coloque el portaobjetos horizontalmente y mirando hacia arriba en una rejilla de metal y una vez que todos los portaobjetos estén listos, sumerja el portaobjetos lentamente en un baño de aceite a 65 grados centígrados durante un mínimo de cuatro horas y un máximo de 16 horas.

El aceite crea un sello hermético alrededor de los portaobjetos de la cubierta siguiendo el tejido de incubación para eliminar el exceso de aceite de la rejilla metálica que contiene los portaobjetos. Y luego coloque la rejilla en una bandeja de vidrio o metal que contenga cloroformo en una campana extractora. Repita el lavado con una segunda bandeja que contenga cloroformo fresco.

A continuación, sumerja la rejilla en una tapa de etanol al 0,1% más dos veces la solución de SSPE para aflojar los cubreobjetos y disolver el exceso de solución de hibridación. A continuación, transfiera los portaobjetos a una segunda solución de etanol TER fresco al 0,1%betta me cap más una solución SSPE dos veces. Transfiera los portaobjetos descubiertos a una rejilla nueva en una bandeja que contenga etanol beta macca TER al 0,1% en dos veces SSPE, incubando esta solución durante una hora a temperatura ambiente para eliminar el exceso de sonda de ARN no unido.

A continuación, transfiera el bastidor de portaobjetos para precalentar dos veces SSPE más 50% para la solución principal amplia a 65 grados Celsius que contiene beta-ME capto etanol a una concentración final de 0,1% e incubar a 65 grados Celsius durante una hora. Después de la incubación, deseche esta y todas las soluciones de lavado acuosas anteriores, así como los cubreobjetos como residuos radiactivos. A continuación, lave los portaobjetos dos veces en 0,1 veces antes de la guerra SSPE tiene 65 grados centígrados durante 30 minutos cada uno.

A continuación, deshidratar el tejido a través de una serie de etanol al 70%95% y al 100% durante dos minutos en cada solución. Por último, seque los portaobjetos en una campana extractora durante al menos 30 minutos. En primer lugar, determinar si hay una señal radiactiva en el tejido.

Coloque los portaobjetos secos en un casete de película, trabajando en una habitación oscura usando una película de rayos X de luz segura sobre los portaobjetos. Asegúrese de que las diapositivas estén orientadas hacia el lado de la emulsión de la película y, a continuación, cierre el casete. Exponga las diapositivas a la película durante uno a siete días, dependiendo de la abundancia esperada de las transcripciones.

Una vez completada la exposición, revele la película de rayos X en revelador y fijador estándar. La señal de hibridación aparecerá como áreas negras en la película como resultado de los granos de plata expuestos en la emulsión para determinar la resolución celular y ver la señal en el propio tejido. Las diapositivas se sumergen en emulsión fotográfica y luego se contramanchan.

Si los portaobjetos se van a teñir con violeta crestal, entonces las secciones deben ser licuadas de acuerdo con las instrucciones del protocolo escrito. En este punto, trabajando en el cuarto oscuro, vierta agua destilada en un tubo. Saque la emulsión uc NTB y diluya la emulsión con agua destilada hasta obtener uno a uno.

Después de derretir la emulsión en un baño de agua a 42 grados centígrados durante 20 a 30 minutos, transfiérala a un recipiente de vidrio en un baño de agua a 42 grados centígrados durante 20 a 30 minutos. El nivel de la emulsión diluida ahora debería cubrir todas las secciones de un portaobjetos cuando el portaobjetos se sumerge en él. Si hay muchos portaobjetos, es posible que se necesite una emulsión adicional.

Ahora sumerja los portaobjetos en la emulsión diluida en un baño de agua a 42 grados centígrados, y luego seque los portaobjetos de inmersión en un recipiente cerrado y hermético durante la noche en la habitación oscura o en un horno a 37 grados centígrados durante dos o tres horas con las luces apagadas. Después del secado, transfiera los portaobjetos a una caja de portaobjetos. Selle los bordes con cinta aislante negra y luego cúbralos con papel de aluminio.

Guarde las cajas a cuatro grados centígrados durante varios días o semanas, cuando estén listas para revelar, caliente los portaobjetos a temperatura ambiente. Luego, mientras trabaja en la sala oscura, retire el estante que contiene las diapositivas de las cajas y revele en el revelador del códec D 19 a 16 grados centígrados durante tres a cinco minutos. A continuación, lave los portaobjetos desarrollados en agua del grifo a temperatura ambiente durante un minuto.

A continuación, incubar los portaobjetos dos veces en solución de fijación a 19 grados centígrados durante seis minutos cada uno, las luces de la habitación se pueden encender durante la segunda incubación del fijador. Ahora lave los portaobjetos con agua corriente a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Luego, con una cuchilla de afeitar, raspe la emulsión de la parte posterior del portaobjetos mientras aún está húmedo.

Por último, contratinción con 0,3% de violeta crestal, luego deshidratar los portaobjetos de montaje de acuerdo con las instrucciones del protocolo escrito si es necesario. Limpie aún más cualquier exceso de emulsión en la parte posterior de los portaobjetos humedeciéndolos con agua y raspándolos con una cuchilla de afeitar. Enjuague los portaobjetos en una solución de etanol al 80% y limpie una o dos veces suavemente para eliminar los residuos y el polvo.

Tome fotografías bajo iluminación de campo oscuro o de campo claro. Es posible que los pasos de raspado y limpieza deban repetirse dos o tres veces para obtener buenas imágenes sin partículas de polvo, que se ven fácilmente en el campo oscuro bajo un microscopio de disección. Las siguientes imágenes son ejemplos de autorradiografía de hibridación in situ a partir de películas de rayos X.

Esta imagen de película de rayos X muestra una sección sagital de la cabeza entera del pájaro cantor pinzón cebra en el día embrionario 10 que se ha híbrido con una sonda ribográfica antisentido a Fox P uno. Los granos negros expuestos en la película muestran mensajero, expresión de ARN, como se puede ver dentro de los cuatro cerebros Fox P, un mensajero, el ARN está enriquecido en el meso alium stri aum y el tálamo dorsal aquí. La imagen de la película de rayos X muestra una sección del mismo pájaro cantor pinzón cebra que se ha híbrido con la sonda RIBA de 90 centavos a Cuper.

TF dos Co.TF dos se enriquece en la necesidad de palam alium y tálamo más ventral. Las siguientes imágenes son ejemplos de autorradiografía de hibridación in situ a partir de portaobjetos de inmersión en emulsión. Esta imagen de campo oscuro tomada bajo un microscopio de disección muestra una sección sagital de la cabeza entera del pinzón cebra en el sexto día posterior a la eclosión que ha sido hibridada con una sonda RIBA antisentido a Fox P uno.

Los granos de plata blancos expuestos en la emulsión por encima del tejido muestran la expresión de ARN mensajero. El color rojo representa la mancha violeta de Kressel. La barra de escala representa un milímetro.

Aquí, la imagen muestra una sección del mismo pájaro cantor pinzón cebra que se ha hibridado con un ribo antisentido a prueba de cooperativo TF dos. Las siguientes imágenes comparan el etiquetado antisentido y sentido que muestra diferentes patrones mostrados en su autorradiografía en radiografías de cortes de cabeza de Saul tomados de pinzón cebra en el día embrionario 12. La línea discontinua indica el contorno de todo el cerebro y la C marca el cerebelo.

Se puede ver que la cadena antisentido de PAC seis se expresa en el cerebro, especialmente en la zona ventricular. Esta sección adyacente hibridada con la hebra olfativa del paquete seis no revela ninguna expresión de fondo en toda la cabeza del embrión, pero sí una expresión aparente en la capa de pigmento de la retina como la hebra antisentido. Las siguientes imágenes muestran en C dos señales de expresión génica y portaobjetos sumergidos en emulsión tomados del cerebro de un pinzón cebra durante las últimas etapas embrionarias bajo vistas de campo claro y campo oscuro.

Esta imagen de campo claro muestra la expresión de D uno B en el día embrionario 10. A partir de una exposición normal a la emulsión, la etiqueta, que parece negra, apenas se puede ver con este aumento. Esta imagen muestra una sección y un aumento idénticos a los vistos en la imagen anterior, pero cambiados a la vista de campo oscuro que muestra el etiquetado en blanco en el cuerpo estriado y el tálamo.

Esta imagen de campo claro muestra la expresión de tres hendiduras en el día embrionario 12. Después de una sobreexposición a la emulsión, la etiqueta negra se puede ver fácilmente. El SC marca la posición de la médula espinal y el CB marca la posición del cerebelo.

Rostral está orientado hacia la izquierda. La imagen que se muestra aquí es la misma sección y la ampliación se acaba de ver, pero cambiada a la vista de campo oscuro que muestra el etiquetado en blanco en la médula espinal que coincide con la imagen de campo claro. Las siguientes imágenes muestran la resolución del grano de plata a nivel celular.

Aquí se muestra el marcaje de un mensajero de Fox P, ARN, en el prosencéfalo del pinzón cebra, los granos de plata aparecen como manchas negras sobre la célula teñidas con violeta crestal. Esta imagen muestra la expresión de alta abundancia sobre células individuales en el pinzón cebra adulto meso alium. Esta imagen muestra una expresión de baja abundancia sobre células individuales en el alium adyacente de la misma sección aquí.

Hola Fox. P un mensajero. La expresión de ARN sobre las células se observa en el meso alio embrionario del día 12.

Las células embrionarias que se ven aquí son más pequeñas y están más compactas en comparación con las células adultas que se ven en las dos imágenes anteriores. Finalmente, esta imagen muestra una expresión de baja abundancia sobre las células en el alium adyacente de la misma sección. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inmunoquímica, para responder a preguntas adicionales, como en qué tipo de célula se expresa el gen diana.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo hacer la hibridación del instituto. No olvide que trabajar con reactivos radiativos puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como las protecciones personales durante este procedimiento.