Name: Creación de perfiles proteoma redox tiol Uso del etiquetado de espectrometría de masas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Aprende a realizar el perfilado del proteoma redox tiol mediante el etiquetado CysTMT y espectrometría de masas en plantas de tomate. Este método permite analizar proteínas reguladas por oxidación en respuesta a patógenos.

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Los autores desean agradecer al Dr. Greg Martin (Universidad de Cornell) y su grupo para proporcionar la cepa DC3000, semillas de tomate, y el asesoramiento. También quisiera agradecer al Dr. Zhonglin Mou busca de ayuda con el protocolo de DAB y la División de Proteómica del Centro Interdisciplinario de Investigación UF Biotecnología para la asistencia en el desarrollo del método. El protocolo para la extracción de proteína fue modificada de Hurkman y Tanaka 16. El protocolo sobre cysTMT etiquetado, los pasos 4 a 6 fue adaptado basado en el original producto de Thermo Fisher Scientific Pierce manual de 17. Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation (MCB 0,818,051 a S Chen).

1. Las plántulas en crecimiento y bacterias Preparación <ol><li> Las plántulas se germinaron en la mezcla del suelo Metromix 500 (Empresas ICM) en una cámara de crecimiento (160 mmol fotones m -2 s -1 con un fotoperíodo de luz de 8 horas a 22 ° C y 16 horas de oscuridad a 20 ° C durante 1 semana. Relativa humedad se fijó a 70%. Las plántulas fueron regadas con agua del grifo como sea necesario para mantener el suelo se seque. </li><li> Dos plantas de semillero de tamaño similar luego se trasplantan a 4 macetas de diámetro &quot;que contienen la Metromix 500 del suelo y se cultivaron durante 3 semanas en las mismas condiciones que 1,1. </li><li> Pseudomonas syringae (Pst) es inicialmente de T-sembró en B Reyes Medio (KBM) placas (por litro: 20 g de proteosa peptona, 0,1975 g de MgSO 4, 1% de glicerol, 1,5 g de K 2 HPO 4, 18 g de agar) y se cultivaron durante dos días a 28 ° C. Una sola colonia se recoge, se mezcla con 300μl Reyes líquido medio B (20 g peptona proteosa, 0,1975 g de MgSO 4 </sub&gt;, 10 ml de glicerina, 10 ml de 100x K 2 HPO 4 acciones (1,5 g de K 2 HPO 4 en 10 ml de H 2 O), y se extendió sobre una placa de los Reyes B Medio. Esto se cultivaron durante la noche a 28 ° C. </li><li> El inóculo se prepara bacterias raspando las bacterias cultivadas a partir de la placa KBM en 20 ml de H 2 O. Un diámetro exterior de 600 0,03 (~ 10 6 ufc / ml) se prepara en 1 l de tampón de inoculación (10 mM de MgCl 2 + 400 l Silwett-70). Tampón de inoculación menos bacterias se preparó para la solución de control. </li></ol> 2. La inoculación de tomate con Pst y H 2 O 2 tinción histoquímica <ol><li> Cuatro semanas de edad plantas se inocularon por inmersión en la solución por encima de la inoculación durante 30 segundos. Bolsas de plástico se coloca sobre las plantas inmediatamente después de la inoculación. </li><li> 3&#39;-3 &#39;diaminobencidina (DAB) mancha de 11 se preparó (1 mg / ml de DAB en H 2 O, pH 3,8 (HCl)) tres days antes de su uso para lograr la completa solubilización. La solución se sacudió para mezclar a temperatura ambiente. </li><li> Veinticuatro horas después del tratamiento, la hoja completamente expandida se separó, se colocaron en DAB mancha lado epidérmico, y vacío infiltrado durante 15 min. Las hojas se pusieron entonces en la oscuridad a temperatura ambiente durante una noche para la tinción. </li><li> Las hojas se hierven en etanol al 95% durante 10 minutos, y después se mantuvo en 75% de etanol. </li></ol> 3. La extracción de proteínas <ol><li> Después de la cosecha, las hojas de tomate se molieron a polvo fino con nitrógeno líquido que utiliza mortero y almirez. </li><li> Por 0,5 g de tejido, añadir 1,25 ml de Tris pH 8,8 fenol tamponado y 1,25 ml / 0,5 g de tampón de extracción (0,1 M Tris-HCl pH 8,8, 10 mM EDTA, 0,9 M de sacarosa) y luego continuar molienda durante unos minutos más en un campana extractora de humos. </li><li> Transferir el extracto a tubo de centrífuga Oakridge (Thermo Fisher Scientific Company Nalgene) y agitar durante 2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar a 5000 xgy 15 ° C durante 10 min. Transferir la fase fenol superior a un tubo limpio nuevo. </li><li> Volver a extraer la fase acuosa se extrajo con un volumen igual de fenol tampón; agitar en un agitador durante 30 minutos. Centrifugar y transferir el extracto a un nuevo tubo Falcon. </li><li> Repita el paso anterior, una vez más y transferir el extracto a las nuevas tubo de Oakridge. </li><li> Precipitar fenol proteínas extraídas mediante la adición de 5 volúmenes de acetato de amonio 0,1 M en metanol al 100% (almacenado a -20 ° C). Vortex y se incuba a -20 ° C durante la noche. </li><li> Recoger la proteína sedimento por centrifugación a 20.000 xg, 4 ° C durante 20 min. </li><li> Lavar el pellet 2 veces con el acetato de amonio 0,1 M en metanol frío y 2 veces con 80% de acetona fría. Añadir 1,5 ml de etanol al 70% en frío para que sedimenten y suspender. Transferir a un tubo de microcentrífuga de 2 ml (EE.UU. Científico) y se centrifuga a 14.000 rpm, 4 ° C durante 20 min. Eliminar el etanol. </li><li> Secar el precipitado brevemente en un concentrador SpeedVac y se disuelven en una proteína EXTRtampón acción, por ejemplo, la proteína ReadyPrep Extracción reactivo Kit 3 (8 M de urea, CHAPS 4%, 40 mM Tris-base, 2 M tiourea) (Bio-Rad). Centrifugar a 14.000 rpm y 20 ° C durante 30 minutos para formar un precipitado. Recoger el sobrenadante. </li><li> Medir la concentración de proteínas utilizando una proteína de ensayo CB-X de acuerdo al manual del fabricante (Geno Technology). </li></ol> 4. Preparación de muestras y etiquetado de péptidos con cysTMTs <ol><li> Preparar muestra de proteína a una concentración de 2-5 mg / l. Aquí usamos 100 g de proteína por cada etiqueta de masa, 20-l 50 muestras l. Para este experimento todas las etiquetas se utilizaron 6. </li><li> Añadir un volumen igual de tampón de alquilación (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 200 mM de yodoacetamida) a la muestra de proteína para bloquear el grupo tiol libre. Buffer debe estar preparado fresco. La alquilación se realiza a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Precipitar la proteína mediante la adición de 1 ml de acetona fría al 80% a -20 ° C durante la noche. Pellet la proteína por centrifugación a 14.000rpm, 4 ° C durante 20 min. Lavar el pellet 3 veces con 80% de acetona vórtex cada vez. Eliminar el sobrenadante y dejar secar al aire seco, mientras que en hielo. </li><li> Resuspender el sedimento en 50 l de tampón de lisis (6 M urea, 50 mM Tris base, 1 mM EDTA). 0,5 l de 100 mM de Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) se añade a continuación para reducir los enlaces disulfuro por incubación durante una hora a temperatura ambiente. </li><li> Preparar etiquetas mediante la adición de 20 l de acetonitrilo para los tubos de reactivos para solubilizar las etiquetas. Vortex y girar hacia la parte inferior. </li><li> Lavar TCEP la capacidad utilizando una centrífuga Microcon 3KD dispositivo de filtro (Millipore). Añadir 50 l de la muestra a la columna Microcon 3KD, y 50 l de tampón de lisis a la columna. Centrifugar durante 15 min a 10.000 xg y 4 ° C. Repita este paso para un total de tres veces. Quitar la columna y se invierte en un tubo limpio. Centrifugar durante 5 minutos a 1.000 xg y 4 ° C. </li><li> Comprobar el pH. Si es necesario, ajustar el pH a 7,0-8,0 con HCl 1 M. </li><li> Añadir 5 l de la cysTMReactivo T para cada muestra (El estuche de reactivos cysTMT proporciona etiquetas 20 l de hasta 500 mg de proteína. Este método utiliza 100 ug de proteína, por lo tanto, utilizar una quinta parte de la etiqueta.). Permitir que la reacción continúe durante 2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Las muestras se combinaron con tampón de muestra Laemmli (Bio-Rad) en una proporción de 1:1. </li></ol> 5. Remoción de los no reaccionó Fraccionamiento Etiqueta de muestra <ol><li> Las muestras se hirvieron durante 5 min y se separaron en un gel de poliacrilamida prefabricado 12% (Bio-Rad). El gel se lavó tres veces en intervalos de 5 minutos con filtró H 2 O y se tiñeron con azul de Coomassie (Bio-Rad) durante 1 hora. El gel fue teñido de noche a la mañana con H 2 O. </li><li> Doce fracciones se obtuvieron de cada carril del gel. Las fracciones se determina por las concentraciones de proteínas de la banda. Las fracciones se cortan en trozos de 1 mm y se recoge en un tubo de 1,5 ml. </li><li> Piezas de gel fueron de teñido utilizando 50% de acetonitrilo y 0,1 M de bicarbonato de amonio en H 2 </sub&gt; O. Este paso se debe repetir hasta que el color azul se quita de piezas de gel (aproximadamente 3-4 veces, 15 min cada vez). </li><li> De teñidos de piezas de gel se secó usando 100% de acetonitrilo (cubrir piezas de gel) durante 15 min, el sobrenadante eliminado, y las piezas se secaron utilizando un SpeedVac. </li><li> Disolver tripsina (Promega) a 1:10 (tripsina: proteína) proporción en el mismo volumen (muestra como combinaron etiquetados) de bicarbonato de amonio 25 mM. Por ejemplo, 600 g de la muestra de proteína con un volumen de 500 l necesita 60 mg de tripsina se disolvió en 500 l de 25 mM de bicarbonato de amonio. </li><li> Añadir la solución de tripsina a las piezas de gel y establecer en el hielo para rehidratar. Si las piezas no están cubiertos añadir 50 mM de bicarbonato de amonio. Después de la rehidratación, se incuba a 37 ° C durante 12-16 horas. </li><li> Quitar el extracto de proteína líquido de las muestras incubadas. </li><li> Se detiene la reacción y eliminar cualquier digerir proteína restante cubriendo piezas de gel con 5% de ácido fórmico, 50% de acetonitrilo .. Agitar piezas de gel durante 20 minutos en la sala de temperature. Transferir el sobrenadante a los tubos de muestra extraídos de proteínas de 5,7. Repita el procedimiento de extracción en dos ocasiones. Secar los péptidos extraídos utilizando el SpeedVac. </li></ol> 6. El enriquecimiento de la muestra cysTMT etiquetadas-péptidos <ol><li> Añadir un gradiente de anti-TMT resina para tubos de 0,5 ml de una suspensión al 50%. (Gradiente de concentración se determinó banda en gel de fraccionamiento. Si una colección fracción consiste en una banda oscura, más resina que se necesita. Fracciones con bandas más débiles requieren menos resina ya que hay menos proteína.) </li><li> La resina se lava luego tres veces con un volumen de columna de 1x tampón con Tris (TBS) (25 mM Tris, 0,15 M NaCl, pH 7,2) (Thermo Scientific Pierce Protein Research Products). </li><li> Añadir 200 1xTBS l para cada muestra. Las muestras se añade entonces a anti-TMT resina (Thermo Scientific Pierce Protein Research Products) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas seguido de balanceo durante la noche a 4 ° C. </li><li> Añadir la muestra a la columna (ElRMO científicos Pierce productos proteínicos de investigación). </li><li> Lavar cada columna tres veces con 1 200 l de TBS. Esto es seguido con el lavado tres veces con CHAPS 0,05% (disuelto en 1x TBS). </li><li> La columna se lava luego tres veces con 4 M urea en 1x TBS. Doscientos microlitros de H 2 O se utiliza entonces para lavar la columna tres veces. </li><li> Cada muestra se eluyó tres veces con 200 l tampón de elución 50% (50% de acetonitrilo, 0,4% de TFA). </li><li> Las muestras se secan entonces en un concentrador de vacío. </li></ol> 7. Masa análisis de espectrometría <ol><li> Resuspender las muestras en 12 l de 3% de acetonitrilo con 0,1% de ácido fórmico y 5 l inyectar directamente en una Eksigent nanoLC-1D columna de cromatografía líquida de alta presión (AB Sciex, EE.UU.). </li><li> Los péptidos se separaron en un ID de Proteopep II columna C18 micras 75 x 20 cm (nuevo objetivo, EE.UU.) utilizando un gradiente de 4-60% (A: acetonitrilo 3%, 0,1% de ácido fórmico; B: 97% de acetonitrilo, 0,1% fórmico ácido)a 3 l / min durante 60 min. </li><li> Un Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL espectrómetro de masas se utilizó para detectar péptidos usando una tapa de 2 x 3 experimento consistente en una sola etapa MS seguido por la adquisición de tres espectros MS / MS con mayor energía C-trampa de la disociación (HCD) de la fragmentación seguido de 3 MS / MS con colisión inducida por la disociación (CID) para la identificación de proteínas. Parámetros en este modo fueron: anchura de aislamiento: 3,0 m / z; energía de colisión: 50% (10% con dos etapas). Sólo péptidos por partida doble y triplemente cargados fueron seleccionados para la fragmentación. Los parámetros dinámicos de exclusión se establece en: Repita cuenta = 1; duración de repetición = 60, el tamaño de la lista de exclusión = 500; Exclusión duración = 28. Los valores objetivo son las siguientes: EM = 5 e 5; MS / MS (HCD) = 1 e 5. Los tiempos de transferencia de iones se establece en 500 para FTMS y 300 para MS / MS (HCD). Dos microscans se requiere para los espectros de HCD. </li></ol> 8. Base de datos de la búsqueda y cuantificación <ol><li> Los datos adquiridos CID y HCD eran unanalizaron utilizando el software Thermo Scientific Discoverer Proteoma 1.2 (Thermo Scientific Pierce productos de la investigación de proteínas) a través de un flujo de trabajo ramificada que puso en práctica un reportero de iones de cuantificador (20 ppm de tolerancia de la masa de los fragmentos de iones) para cuantificar la relación. Un segmento aparte procesado la MS 2 espectros a través del espectro de selección, Normalizador del espectro, y los ganglios del espectro de mero. </li><li> Los datos se buscaron después contra el motor de búsqueda SEQUEST. Una tolerancia de 20 ppm en masa se utilizó. Modificaciones estáticas se establece en el reactivo cysTMT (304,18 Da) y modificaciones dinámicas incluyó la fosforilación y la oxidación de la metionina (15,99 Da). Una base de datos personalizada de Solanum lycopersicum fue compuesta utilizando ARN de datos (con cerca de 350.000 entradas de la Universidad de Harvard) 13 se utilizó en ambos casos. </li></ol> 9. Los resultados representativos Una imagen representativa de una hoja de control de la planta de tomate y una hoja de Pseudomonas es inoculadose muestra en la Figura 1. Una diferencia entre el control y tratados hojas Pseudomonas tratados se observa. Después de que las hojas se retiran y se tiñeron utilizando DAB, el proceso de tinción permite la tinción histoquímica a mostrar signos de ROS en el tejido de la hoja (Figura 2). Figura 2A es representativo de una hoja de control sin tinción. Figura 2B es representativa de una hoja tratada con tinción positiva para Pseudomonas y H 2 O 2 de producción. Un ejemplo de Proteoma Descubre salida de datos de una proteína redox diferencialmente regulada se muestra en la Figura 3. Esta proteína es un conocido ferredoxina-1 redox proteína regulada 14 y se ha demostrado que desempeñan un papel en la defensa contra Pseudomonas syringae pv tomate 15. Intensidad de pico entre el control y muestras inoculadas se utiliza para obtener la cuantificación relativa, que mostró cambios significativos en ferredoxen-1 de regulación de óxido-reducción (p &lt;0,05). Picos de alta intensidad sugieren que esta proteína se oxida en respuesta al tratamiento patógeno. Figura 4 es un ejemplo de Proteoma Descubre salida de datos de una proteína que tiene regulación similar redox de una proteína entre un control y muestra inoculada. Los picos de intensidad similar, sugieren la presencia de disulfuro de bonos no están regulados por un cambio en el tratamiento. El método va a revolucionar cómo los científicos detectar cisteínas redox sensibles y disulfuros 10. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig1.jpg" /> Figura 1. Una imagen representativa de tomate inoculado deja con solución de control (A) y Pseudomonas (B). &lt;la clase span = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig2.jpg" /> Figura 2. Una imagen representativa de la tinción de DAB de tomate inoculado deja con solución de control (A) y Pseudomonas (B). Las hojas fueron teñidas utilizando 3&#39;-3 &#39;diaminobencidina. La clorofila fue retirado de las hojas por ebullición en etanol al 95%. Coloración oscura indica la presencia de H 2 O 2. Sólo deja inoculado con cultivo de bacterias mostraron una coloración oscura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig3.jpg" /> Figura 3. Un ejemplo de Proteoma Descubre salida de datos de ferredoxina-1, proteína regulada diferencialmente redox 14. Intensidad máxima por encima de cada pico se utiliza para la cuantificación absoluta. Intensidad de pico entre el control y muestras inoculadas se utilizapara llevar a cabo la cuantificación relativa. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig4.jpg" /> Figura 4. Un ejemplo de Proteoma Descubre salida de datos de una proteína que tiene la intensidad de pico similar entre un control y muestra inoculada. Los picos de intensidad similar, sugieren la presencia de disulfuro de bonos no están regulados por un cambio en el tratamiento.

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No hay conflictos de interés declarado.

Este protocolo proporciona información sobre cómo realizar la tinción de DAB, así como la cuantificación cysTMT etiquetados cisteína redox. Estos procedimientos son beneficiosos en el examen de la producción de ROS, así como el efecto sobre la regulación de proteínas cuando Solanum lycopersicum se inocula con Pseudomonas syringae. Los métodos presentados en este protocolo de proporcionar una forma de examinar las ROS en muestras de hojas enteras de una manera que cause el mínimo de daño al tejido de la hoja. El procedimiento de etiquetado proporciona una forma de examinar las proteínas reguladas potencialmente redox mediante la utilización de un método de etiquetado cisteína. Esto es beneficioso cuando se examina una etapa temprana de la respuesta al estrés. Métodos tales como etiqueta de afinidad isótopo codificado (ICAT) y cysTMT se puede utilizar en el examen de potenciales redox proteínas reguladas en muestras biológicas. ICAT permite el etiquetado y la comparación de dos muestras de 12. Ambos métodos etiquetar cisteínas libres y se puede utilizar para la proteína quantificción 10,12. Sin embargo, el método cysTMT permite una disminución en la variación experimental, así como multiplexación 10. El número de etiquetas disponibles permite a los investigadores para incluir repeticiones o varias muestras de su diseño experimental. La función más muestras proporciona el potencial para un mayor número de proteínas identificadas. Una desventaja importante de la técnica cysTMT es que compromete la calidad general de la identificación de proteínas debido a los pasos de enriquecimiento selectivo para cysTMT etiquetados-péptidos (6.5 a 6.6). El número de péptidos para la identificación de proteínas depende en gran medida el número de residuos de cisteína en la secuencia de la proteína. Este problema se puede superar mediante la presentación de parte de la muestra antes de tríptico enriquecimiento para la identificación de masa de la proteína espectrometría. Debido a la naturaleza del diseño experimental, así como el mecanismo de etiquetado que utiliza el método cysTMT, ciertos pasos son críticos. Durante la realización de la proteína precisiónpitation y pellets de lavado (3,9) es importante para mantener las muestras refrigerados en hielo para reducir la degradación de proteínas. Durante etiquetado cysTMT, la eliminación del reactivo reductor (4,6) es importante porque las muestras pueden someterse etiquetado inverso. Etiquetado inversa es posible si la reducción de reactivo permanece en la muestra. Si las muestras se reduce después de etiquetado, la etiqueta cysTMT se puede quitar. Una vez que las etiquetas se añaden a las muestras, el nivel de pH debe ser revisado (4,7) con el fin de tener un rendimiento óptimo de etiquetado. Además, el análisis de datos depende de lo que se requiere del investigador y el objetivo final en el uso del protocolo. Es también depende del software utilizado, ya que cada software tiene diferentes algoritmos. Este experimento utiliza patógeno como un desencadenante de una mayor producción de especies reactivas de oxidación en el tomate, sin embargo, otras respuestas regulados redox se puede medir en consecuencia. Este diseño experimental es adaptable a otra planta y sistemas animales. </p&gt;

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Metromix 500 </td><td> ICM Empresas </td><td> TX-500 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;-diaminobenzidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8001 </td></tr><tr><td> ReadyPrep extracción secuencial reactivo kit 3 </td><td> Bio-Rad </td><td> 163-2104 </td></tr><tr><td> CB-X de ensayo de proteínas </td><td> Geno Tecnología </td><td> 786-12x </td></tr><tr><td> cysTMT reactivos </td><td> Thermo Scientific Pierce productos proteínicos de investigación </td><td> 90071 </td></tr><tr><td> Laemmli tampón de muestra </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> Bio-Safe Comassie (G-250 mancha) </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> Microcon 3KD columna </td><td> Millipore </td><td> 42403 </td></tr><tr><td> Inmovilizado Anti-TMT resina </td><td> Thermo Scientific Pierce productos proteínicos de investigación </td><td> 90076 </td></tr><tr><td> Se centrifuga la columna </td><td> Thermo Scientific Pierce productos proteínicos de investigación </td><td> 89896 </td></tr><tr><td> Proteopep II columna C18 </td><td> Nuevo Objetivo </td><td> PFC7515-PP2-10 </td></tr><tr><td> NanoLC-1D HPLC </td><td> AB Sciex </td><td> 90389 </td></tr><tr><td> LTQ Orbitrap XL </td><td> Thermo Scientific </td><td> 0020137580 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> Labconco </td><td> 7812013 </td></tr><tr><td> Descubridor del Proteoma 1.2 del software </td><td> Thermo Scientific Pierce productos proteínicos de investigación </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Promega </td><td> V5111 </td></tr><tr><td> Oakridge tubo de centrífuga </td><td> Thermo Scientific Nalgene la empresa </td><td> 3139-0050 </td></tr><tr><td> Microcentrífuga tubo (2 ml) </td><td> EE.UU. Científico </td><td> 1620-2700 </td></tr><tr><td> 12% Mini-Protean TGX Prefabricados de Gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 456-1043 </td></tr><tr><td> Top of Form &gt; Bio-Safe Coomassie StainBottom del Formulario </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> TMT kit de enriquecimiento </td><td> Thermo Scientific Pierce productos proteínicos de investigación </td><td> 90077 </td></tr></tbody></table>

creación de perfiles proteoma redox tiol uso del etiquetado de espectrometría de masas

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. Tomate DC3000 cepa no sólo causa la enfermedad mancha bacteriana en Solanum lycopersicum sino también en especies de Brassica, así como en Arabidopsis thaliana, una planta huésped genéticamente 1,2 tratable. La acumulación de especies reactivas del oxígeno (ROS) en los cotiledones inoculados con DC3000 indica un papel de ROS en la modulación de la muerte celular necrótica durante la enfermedad mancha bacteriana del tomate 3. El peróxido de hidrógeno, un componente de ROS, se produce después de la inoculación de las plantas de tomate con Pseudomonas 3. El peróxido de hidrógeno puede ser detectado mediante una tinción histoquímica 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidina (DAB) 4. Tinción DAB reacciona con el peróxido de hidrógeno para producir una mancha marrón en el tejido de la hoja 4. ROS tiene un papel regulador del medio ambiente redox celular, que puede cambiar el estado redox de ciertas proteínas 5. La cisteína es un aminoácido importante sensible acambios redox. Bajo la oxidación leve, la oxidación reversible de los grupos sulfhidrilo de cisteína sirve como sensores y transductores de señal redox que regulan una variedad de procesos fisiológicos 6,7. De masas en tándem de etiquetas (TMT) los reactivos permite la identificación simultánea y multiplexado de la cuantificación de proteínas en diferentes muestras mediante espectrometría de masas 8,9. Los reactivos de cisteína-TMT (cysTMT) reactivos habilitar etiquetado selectiva y cuantificación relativa de cisteína que contiene péptidos de hasta seis muestras biológicas. Cada etiqueta cysTMT isobárica tiene la misma masa padre nominal y se compone de un grupo sulfhidrilo-reactiva, un brazo espaciador de MS-neutro y un reportero de MS / MS 10. Después de etiquetado, las muestras fueron sometidos a digestión con proteasa. Los péptidos marcados en cisteína se enriquecieron utilizando una resina que contiene anticuerpos anti-TMT. Durante MS / MS análisis, una serie de iones reportero (es decir, 126-131 Da) surgen en la región de baja masa, proporcionando información sobre la cuantificación relativa.El flujo de trabajo es eficaz para reducir la complejidad de la muestra, la mejora de rango dinámico y el estudio de las modificaciones de cisteína. Aquí presentamos el análisis de proteómica redox del tomate Pst DC3000 tratado (Río Grande) utilizando la tecnología deja cysTMT. Este método de alto rendimiento tiene el potencial de ser aplicado al estudio de otros redox reguladas procesos fisiológicos.

Nivel de especies reactivas del oxígeno se eleva cuando las células encuentran condiciones de estrés. Aquí se muestra el ejemplo de la tinción Diaminobencidina 3&#39;-3 &#39;, así como el etiquetado cysTMT y espectrometría de masas para perfilar el proteoma redox en<em&gt; Pseudomonas syringae</em&gt; Tratar las hojas de tomate.

Creación de perfiles proteoma redox tiol Uso del etiquetado de espectrometría de masas

La cepa DC3000 de Pseudomonas syringae pv. tomato no solo causa la enfermedad de la mancha bacteriana en Solanum lycopersicum, sino también en especies de Brassica, así como en...

El objetivo general de este experimento es observar los efectos de Pseudomonas syringae pv. tomato en proteínas reguladas por redox en plantas de tomate. Primero, inocule las plantas de tomate con Pseudomonas syringae pv. tomato para inducir la infección por patógenos y la respuesta proteica. A continuación, tiña con DAB (diaminobencidina) para observar los cambios en las especies reactivas de oxígeno.Luego realice la etiquetación con TMT de cisteínas para examinar las cisteínas reguladas por redox en las proteínas. Los resultados obtenidos pueden medir los cambios entre muestras tratadas y controles. Hola, soy Chen del departamento de biología y de la instalación de proteómica aquí en la Universidad de Florida.La ventaja de nuestra etiquetado CTMT frente al método existente como la etiqueta de aleta recubierta con isótopo, también conocida como ASCA, es la capacidad de multiplexar mientras se analizan proteínas responsivas al redox a gran escala. Aunque esta demostración proporcionará información sobre las proteínas reguladas por redox en el tomate en respuesta a la infección por patógenos, el experimento puede aplicarse a otros sistemas como joof, ratones cu y otras plantas, así como al control de condiciones de estrés. Tuvimos por primera vez la idea de este método tras observar variaciones notables entre experimentos ICAD porque solo hay dos etiquetas disponibles.La demostración VIR de este método es fundamental, ya que los pasos de marcado y enriquecimiento son difíciles de aprender. Es necesario minimizar las variaciones experimentales entre muestras marcadas y eliminar las regiones reductoras para garantizar un marcado eficiente. Comencemos. Cultive dos plántulas de tomate trasplantadas de tamaño similar en macetas de cuatro pulgadas de diámetro para el cultivo del inóculo.Una capa continua de pseudomona singe en una placa A KBM. Raspar las bacterias en 20 mililitros de agua y preparar un inóculo bacteriano de aproximadamente 10 a la seis unidades formadoras de colonias por mililitro. En un litro de tampón de inoculación, sumergir las plantas de cuatro semanas de edad en la solución de inoculación bacteriana durante 30 segundos.Luego, cúbralo inmediatamente con bolsas de plástico transparentes. Después del tiempo de inoculación deseado, recolecte la hoja completamente expandida colocando la epidermis hacia arriba en una solución de un miligramo por mililitro de colorante DAB y realice una infiltración al vacío durante 15 minutos. A continuación, incube las hojas en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche.Ahora hierva las hojas teñidas en etanol al 95 % durante 10 minutos y almacénelas en etanol al 75 % utilizando un mortero para moler. Recolecte las hojas y tritúrelas hasta obtener un polvo fino en nitrógeno líquido. Luego realice extracciones con fenol según se describe en el texto adjunto.A continuación, precipite las proteínas extraídas con fenol utilizando cinco volúmenes de acetato de amonio 0,1 molar frío en metanol al 100 %. Recupere las proteínas por centrifugación y realice lavados del precipitado. Luego, re suspenda las muestras en 1,5 mililitros de etanol frío al 70 % y transfiera a un tubo microcentrífugo de dos mililitros.Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante de etanol y seque brevemente el pellet en un evaporador al vacío. Disuelva las muestras en un tampón de extracción de proteínas desnaturalizante tras centrifugar para formar un pellet, recoja el sobrenadante y mida la concentración de proteína según el manual del fabricante. Para cada una de las seis etiquetas de masa, comience con 100 microgramos de muestra de proteína en un volumen igual de tampón de alquilación de acetamida IO 200 milimolar recién preparado para bloquear los grupos tiol libres; incube a 37 grados Celsius durante una hora. Luego, para precipitar las proteínas, agregue un mililitro de acetona fría al 80 % y coloque a menos 20 grados Celsius durante la noche.Centrifugue la proteína para obtener el precipitado y realice tres lavados con acetona al 80 %. Después de secar las muestras al aire sobre hielo, vuelva a suspender el precipitado en 50 microlitros de tampón de lisis. Luego, para reducir los enlaces disulfuro, agregue 0,5 microlitros de TCEP 100 milimolar e incube durante una hora a temperatura ambiente.Disuelva las etiquetas añadiendo 20 microlitros de acetonitrilo a los tubos de reactivo. Vortexee y centrifugue brevemente para eliminar el exceso de TCEP. Cargue 50 microlitros de muestra en una columna MicroCon de tres KD. Añada 50 microlitros de tampón de lisis y centrifugue durante 15 minutos a 10 000 ×g y 4 °C.Para recoger la muestra, retire la columna, inviértala en un tubo limpio y centrifugue. Verifique el pH de la muestra si es necesario. Ajuste el pH entre siete y ocho con ácido clorhídrico uno molar.Añada cinco micro de liberación del reactivo TMT de cisteína e incube la reacción durante dos horas a temperatura ambiente, combine las muestras y agregue un volumen igual de tampón de muestra Laemmli, hiérvalo durante cinco minutos y separe en un gel precolado de poliacrilamida al 12 %. Después de lavar el gel tres veces con agua filtrada, tiña con azul de Coomassie durante una hora y desactive la tinción durante la noche en agua según las concentraciones de las bandas proteicas. Divida 12 fracciones por carril del gel. Corte cada fracción en trozos de un milímetro y colóquelos en un tubo de 1,5 mililitros.Retenga completamente los trozos de gel con bicarbonato de amonio 0,1 molar en acetonitrilo al 50%. Ahora cubra los trozos con acetonitrilo al 100% durante 15 minutos. Retire el líquido y seque los trozos utilizando un vacío rápido.A continuación, agregue un volumen igual de solución de tripsina y coloque en hielo para rehidratar. Luego, incube a 37 grados Celsius durante 12 a 16 horas para la digestión con tripsina. A continuación, retire el extracto proteico líquido de las muestras incubadas.Detenga la reacción y elimine cualquier digestión proteica residual cubriendo los trozos de gel con ácido fórmico al 5 % y acetonitrilo al 50 %. Luego agite los trozos de gel durante 20 minutos a temperatura ambiente. Transfiera el sobrenadante a los tubos de muestra de proteína extraída tras dos extracciones adicionales.Seque las muestras bajo vacío rápido en tubos de 0,5 mililitros. Prepare una suspensión al 50 % de resina anti-TMT en TBS a una concentración proporcional a la intensidad de la banda proteica respectiva. Lave la resina tres veces con un volumen de columna de TBS 1× y continúe agregando 200 microlitros de TBS a cada muestra.Luego, transfiera a resina anti-TMT y agite a temperatura ambiente durante dos horas, seguido de agitación lenta durante la noche a cuatro grados Celsius. Cargue cada muestra en una columna. Realice lavados de columna de 200 microlitros cada uno.Luego, eluir cada muestra tres veces con 200 microlitros de tampón de elución al 50% y secar al vacío. Resuspender las muestras en 12 microlitros de acetonitrilo al 3% con ácido fórmico al 0,1% e inyectar cinco microlitros directamente en una columna de HPLC. Eluir los péptidos utilizando un gradiente de aumento de acetonitrilo según se detalla en el texto adjunto.Utilice espectrometría de masas para detectar péptidos en un flujo de trabajo superior dos por tres. Comience con un MS de una sola etapa. Luego adquiera tres espectros MS/MS con disociación por captura de iones de mayor energía seguidos de tres.Ms.MS con disociación inducida por colisión para la identificación de proteínas. Analice los datos de espectrometría de masas utilizando un flujo de trabajo ramificado. Implemente un cuantificador de iones marcadores para cuantificar la relación.Asimismo, procese el espectro MS de MSM mediante los nodos selector de espectro, normalizador de espectro y agrupador de espectros, y consulte los datos contra el motor de búsqueda Seaquest. Esta imagen muestra ejemplos de una hoja de planta de tomate controlada a la izquierda y una hoja inoculada con Pseudomonas a la derecha, tras teñir las hojas con DAB. El proceso de tinción con DES permite que la tinción histoquímica revele signos de especies reactivas de oxígeno en el tejido foliar.Como era de esperar, el control no muestra una tinción significativa, mientras que las hojas tratadas con Pseudomonas presentan tinción positiva para la producción de peróxido de hidrógeno. Este ejemplo muestra la salida de datos de Proteome Discover de un pico de área proteínica regulado diferencialmente por redox para cada muestra, lo que permite la cuantificación absoluta. El área del pico entre las muestras de control y las inoculadas indica cantidades relativas.Aquí, la regulación redox de una proteína entre una muestra control y una inoculada es similar. Picos de intensidad semejante sugieren la presencia de enlaces disulfuro no regulados por un cambio en el tratamiento. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse correctamente en una semana.Recuerde mantener las muestras frías y las etiquetas organizadas. Además, use precauciones al manipular fenol, como guantes resistentes a productos químicos y trabajar en la campana extractora siguiendo este procedimiento. Otras medidas, como el análisis específico mediante espectrometría de masas de modificaciones postraduccionales, pueden realizarse para determinar otras modificaciones del sistema, como el ácido único y la simulación de gluten.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la CTMD de pie mediante DIB, habilitación y calificación redox 16.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Los compuestos de captura se trifuncional pequeñas moléculas para reducir la complejidad del proteoma de funcionamiento reversible de moléculas pequeñas, la interacción de proteínas seguido por foto-reticulación y la purificación. Aquí se utiliza un compuesto de captura...

Perfiles de metiltransferasas y Otros S-Adenosil- L-Homocisteína proteínas que se unen mediante espectrometría de masas de captura compuesto (MCP)

Etiquetado de isótopos estables de péptidos por dimethylation reductora (etiquetado REDI) es una estrategia rápida, de bajo costo para la proteómica precisas de masa basados ​​en espectrometría cuantitativos. Aquí se demuestra un método robusto para la preparación y el análisis de mezclas de proteínas utilizando el enfoque Redi que se puede aplicar a casi cualquier tipo de muestra.

Proteómica cuantitativos utilizando reductiva dimethylation de isótopos estables de etiquetado

Combinado precursor de marcaje isotópico y etiquetado isobárico (cPILOT) es una estrategia proteómica cuantitativa que mejora las capacidades de multiplexación de muestra de las etiquetas isobáricas. Este protocolo describe la aplicación de cPILOT a los tejidos de los controles de modelo de ratón de la enfermedad y de tipo salvaje de un Alzheimer.

Muestra mejorada Multiplexing de tejidos usando combinada Precursor isotópico etiquetado y isobárico Tagging (cPILOT)

Presentamos un protocolo para cuantificar con precisión las proteínas con etiquetado isobárico, fraccionamiento extensa, herramientas bioinformáticas y pasos de control de calidad en combinación con interfaz a un espectrómetro de masas de alta resolución de la cromatografía líquida.

Proteoma profundo perfiles de etiquetado isobárico, extenso de la cromatografía líquida, espectrometría de masas y asistida por el Software de cuantificación

Presentamos un protocolo de etiquetado optimizado de etiquetas de masa en tándem (TMT) que incluye información detallada para cada uno de los siguientes pasos: extracción de proteínas, cuantificación, precipitación, digestión, etiquetado, envío a una instalación proteómica y análisis de datos.

Preparación de muestras TMT para la presentación de instalaciones proteómicas y análisis de datos posteriores

El protocolo descrito proporciona un análisis proteómico cuantitativo optimizado de muestras de tejido utilizando dos enfoques: cuantificación basada en etiquetas y sin etiquetas. Los enfoques basados en etiquetas tienen la ventaja de una cuantificación más precisa de las proteínas, mientras que un enfoque sin etiquetas es más rentable y se utiliza para analizar cientos de muestras de una cohorte.

Flujo de trabajo integral de proteómica de escopeta basada en espectrometría de masas de muestras de tejido

La proteína arginina (R)-metilación es una modificación postraduccional muy extendida que regula múltiples vías biológicas. La espectrometría de masas es la mejor tecnología para perfilar globalmente el R-metil-proteoma, cuando se combina con enfoques bioquímicos para el enriquecimiento peptídico modificado. El flujo de trabajo diseñado para la identificación de alta confianza de la R-metilación global en células humanas se describe aquí.

Un enfoque proteómico basado en espectrometría de masas para el análisis global y de alta confianza de la proteína R-metilación

La oxidación de la proteína tiol tiene implicaciones significativas en condiciones fisiológicas y fisiopatológicas normales. Describimos los detalles de un método cuantitativo de proteómica redox, que utiliza captura asistida por resina, etiquetado isobárico y espectrometría de masas, lo que permite la identificación y cuantificación de proteínas de cisteína oxidadas reversibles.

Captura asistida por resina junto con etiquetado de etiqueta de masa isobárica en tándem para la cuantificación multiplexada de la oxidación de la proteína tiol

Este artículo describe un método de preparación de muestras basado en la inactivación por calor para preservar los péptidos endógenos evitando la degradación post mortem, seguido de una cuantificación relativa utilizando el etiquetado isotópico más LC-MS.

Preparación de muestras y cuantificación relativa mediante metilación reductiva de aminas para estudios de peptidómica

Este video demuestra la preparación de un diseño ultra-delgado de matriz / analito capa para el análisis de péptidos y proteínas por láser asistida por matriz de desorción ionización espectrometría de masas (MALDI-MS).

MALDI preparación de la muestra: el método de ultra capa fina

Aprende a realizar el perfilado del proteoma redox tiol mediante el etiquetado CysTMT y espectrometría de masas en plantas de tomate. Este método permite analizar proteínas reguladas por oxidación en respuesta a patógenos.

Creación de perfiles proteoma redox tiol Uso del etiquetado de espectrometría de masas

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