Name: Espacio-Temporal de manipulación de la actividad GTPasa pequeña en el nivel subcelular y en escala de tiempo de segundos en las células vivas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprende a controlar la actividad de pequeñas GTPasas con precisión espacio-temporal usando luz UV y rapamicina foto-encapsulada en células vivas. Este método permite manipular señalización celular a nivel subcelular.

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Este estudio fue apoyado por el NIH financiación de la investigación (DK090868 y GM092930 a TI). No es una patente pendiente en un análogo de la rapamicina enjaulado.

1. La transfección de ADN del plásmido <ol><li> Añadir ADN de plásmido, 0,5 g de membrana anclada FRB (en adelante, LDR) y 0,5 mg FKBP-Tiam1 (la invasión de las células T linfoma y metástasis de inducción de proteínas 1: Rac activador) marcados con la proteína fluorescente a 37,5 l O. DH 2 Añadir 1 l HD FuGENE. </li><li> Vortex y se incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos. Mientras tanto, siga con los pasos 1.3-1.8. </li><li> Lavar cada pocillo de una cámara de 8-bien con 50 l de poli-D-lisina. </li><li> Lavar el centro de cada pocillo con dH 2 O. </li><li> Trypsinize 80-85% confluentes células NIH-3T3 y diluir a 10 ml de medio de cultivo (DMEM con FBS al 10%). </li><li> Quitar 375 l de la suspensión y centrifugar a 1750 rpm durante 3 minutos. </li><li> Aspirar los medios de comunicación, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. </li><li> Añadir 750 l de FBS DMEM w / 10% y volver a suspender. </li><li> Añadir suspensión celular a DH 2 O / ADN / solución FuGENE HD y mezclar suavemente. </li><li> Añadir 250l de suspensión de células / ADN a cada pocillo (llenarán hasta 3 pocillos). </li><li> Se incuban las células transfectadas a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 15-18 horas. </li></ol> 2. Preparación de la CRB-Una solución <ol><li> Sintetizar enjaulado rapamicina-biotina aducto (CRB). Consulte la sección &quot;esquema de síntesis de la CRB&quot; para más detalles. Brevemente, restos enjaulamiento y biotina se preparan por separado. El resto enjaulamiento es entonces conjugado con rapamicina (LC laboratorio), el producto posteriormente acoplado al resto de biotina por un medio de reacción clic 7 para dar CRB. </li><li> Prepare una solución de 1 mM de valores de CRB en DMSO. </li><li> Disolver 1 mg avidina en 250 l de PBS en un tubo Eppendorf de 0,5 ml. </li><li> Añadir 1 l de solución madre CRB avidina disuelto. Mezclar invirtiendo varias veces. </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos para dar CRB-avidina conjugada (CRB-A) Solución. </li><li> Excluir las moléculas pequeñas no consolidados y purificar CRB-A. Utilizando una columna de exclusión por tamaño </li></ol> 3. Microscopía e iluminación de luz en el nivel subcelular <ol><li> Suero de hambre células transfectadas en DMEM sin FBS durante 12 horas. </li><li> Aspire con cuidado los medios de comunicación fuera de las células y añadir 250 ml del preparado 400 nM CRB-Una solución (desde el paso 2.6). </li><li> Para visualizar la dinámica de proteínas en las células vivas en la resolución subcelular antes y después del tratamiento de la luz, la microscopía de disco giratorio se utiliza (figura 2a). Iluminación UV se logró mediante el acoplamiento de la óptica de la luz UV LED (365 nm) con epi-fluorescencia de luz (Figura 2b). </li><li> MetaMorph software se utiliza para capturar imágenes de fluorescencia de las células transfectadas cada 15 segundos. </li><li> Definir las coordenadas y el tamaño de un punto de iluminación mediante el uso de una placa de vidrio recubierta con colorantes fluorescentes excitadas por la luz UV. El tamaño puedeser variada mediante la aplicación de la lente objetivo con diferentes aumentos y mediante la selección de las fibras ópticas con núcleo tamaño diferente. </li><li> Después de determinar los niveles de fondo de la membrana fruncido, la luz irradian rayos UV en la periferia de las células. Los siguientes dos pasos son para contrastar anteriores efectos localizados. </li><li> A nivel mundial irradiar las células con luz de 365 nm proporcionada por una lámpara de mercurio. </li><li> Disolver uncaged, por lo que la rapamicina original en DMSO y luego en PBS (400 mM final), y la solución a la cámara de imágenes para producir efectos globales. </li></ol> 4. Los resultados representativos Un ejemplo de resultados representativos se muestran en la Figura 3. La irradiación de luz UV a una pequeña región cerca de un borde celular inducida rápidamente la formación de volantes localizada sólo en y cerca de la zona irradiada. Para confirmar que éste era de hecho la actividad local, luego a nivel internacional las células irradiadas con UV, o añadidos a los medios de rapamicina a granel, tanto de la WHIch inducida por la formación volante global a lo largo de la membrana. Para un análisis cuantitativo, hemos dividido las células diana en cuatro cuadrantes, y contó con la frecuencia de la formación de volantes en cada cuadrante al local, así como después de la estimulación global bajo diversas condiciones, incluyendo los controles (Figura 4). Es sólo que esta combinación de la radiación UV, CRB-A, y apropiadas FKBP-FRB construcciones que induce fruncido local. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de la dimerización de la proteína espacialmente confinados con enjaulado rapamicina-avidina conjugada (CRB-A) y la luz ultravioleta. Irradiación UV escinde el enlazador entre la rapamicina y la biotina, resultando en la liberación de productos químicos dimerizer (HE-rapa, C40-O-(2-hidroxietil) rapamicina) y su subproducto. El dimerizer luego liberado se difunde en las células e induce la dimerización entre FKBP-PDI (proteína de interés) y de plasma membRane anclado FRB sólo en la proximidad de la región irradiada (círculo azul). Sin la radiación UV, FKBP y FRB no asociado (cruz roja), por lo tanto, la producción de ningún efecto. (Derechos de Autor @ ACS2011) 6 <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig2.jpg" /> Figura 2. Imagen del microscopio de fluorescencia confocal personalizado. (A) Vista frontal del microscopio confocal (invertido Axiovert 200 de Zeiss). (B) Primer plano, vista desde arriba de una unidad de acoplamiento para el PAI de fluorescencia y luz UV. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig3.jpg" /> Figura 3. Formación espacialmente confinado en un volante transfectadas NIH3T3 celular inducida por la irradiación UV localizada. Confocal de imágenes de fluorescencia de un celular de fibroblastos NIH3T3 que se transfectaron con YFP de etiquetado FKBP-Tiam1 (Rac activador) y LDR (anclado a la membrana FRB) fueron sometidos a la irradiación en un área confinada cerca de su borde con LED luz a 365 nm durante 15 segundos a partir de 210 segundos en la presencia de CRB-Un conjugado en los medios a granel. Este tratamiento fue seguido por la iluminación global con lámpara de mercurio de 1 seg a 1063 Además seg y global de rapamicina finales 400 Nm a 1560 segundos. La célula casi no mostraron actividad alborotaba al principio (a), pero mostró espacialmente confinados revolviendo después de la iluminación localizada (círculo amarillo) (b). La célula mostró la formación de volante mundial después de la iluminación global y además de la rapamicina (cd), lo que indica que la formación volante local fue causada por la activación de Rac espacialmente confinados. Barra de escala: 10 m. (Derechos de Autor @ ACS2011) 6 <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig4.jpg" /> Figura 4. Frecuencia de la formación de volantes en los cuadrantes de transfectadas las células NIH3T3. La radiación UV local con CRB-A y después de la irradiación UV mundial se realizaron en 13 celdas. CRB-A </sAdemás Trong&gt; (sin irradiación UV), la irradiación UV local con o sin avidina se aplicaron en las células 13, 5 y 6, respectivamente. Ninguna de las células observadas mostró formación volante con CRB-A sin irradiación UV o irradiación UV local con o sin avidina en los medios a granel. Se recogieron los datos a partir de células con baja formación volante de fondo, pero que tenía la capacidad de la rapamicina inducida por la formación de volante, lo que nos marchamos después de cada experimento, al confirmar la formación de volante global como resultado de la suma de la rapamicina (finales de 400 nm). Estos resultados mostraron que CRB-A y la irradiación UV, son necesarias para la formación de volante local en las células. (Derechos de Autor @ ACS2011) 6 Abreviaturas: FKBP: FK506-proteína de unión FRB: FKBP-rapamicina-proteína de unión Tiam1: la invasión de las células T linfoma y metástasis que induce la proteína 1 (Rac FMAM) LDR: Lyn-DSAG enlazador-FRB (Lyn: N-terminal de 11 aminoácidos de Lyn-quinasa) HE-rapa: C40-O - (2-hidroxietil) rapamicina CRB: la rapamicina con el resto de biotina enjaulado CRB-A: CRB conjugado con avidina

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Se describe una técnica que emplea un novedoso compuesto enjaulado junto con el sistema heterodimerización FKBP-FRB con el fin de manipular a la actividad GTPasa Rho en un lugar concreto subcelular en una escala de tiempo de segundos. Hay tres limitaciones del enfoque actual. En primer lugar, porque el método se basa en la prevención o permitiendo la difusión de dimerizer través de la membrana plasmática, la ubicación de destino celular necesita ser membrana plasmática o sus proximidades. Op...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> La rapamicina </td><td> Tecoland </td><td> RAPA99 </td></tr><tr><td> FuGENE HD </td><td> Roche </td><td> 04709691001 </td></tr><tr><td> Avidina </td><td> Sigma </td><td> A9275-10MG </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650-5X5ML </td></tr><tr><td> De exclusión por tamaño de columna </td><td> GE Healthcare </td><td> Giro Trampa G-25 </td></tr><tr><td> Con fondo de cristal y cámara de 8- </td><td> Thermo Scientific </td><td> 12-565-47 </td></tr><tr><td> Microscopio de fluorescencia invertido </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert200M </td></tr><tr><td> UV LED fuente de luz </td><td> Rapp optoelectrónica </td><td> UVILED </td></tr><tr><td> Disco giratorio confocal </td><td> Yokogawa Electric Corp. </td><td> CSU10 </td></tr><tr><td> CCD de la cámara </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> ORCA-ER </td></tr><tr><td> Lente objetivo 100x </td><td> Zeiss </td><td> Plan de Apochromat </td></tr></tbody></table> Esquema de síntesis de la CRB (Derechos de Autor ACS2011) 6 <a href="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1_lg.jpg"><img src="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1.jpg" alt="Esquema 1" /></a> Condiciones sintéticas: (a) BnBr, K 2 CO 3, DMF (b) f.HNO 3, AcOH (c) de TFA (d) propargílico-Br, K 2 CO 3, DMF, (e) de glicerol, gato. PTSA, tolueno (f) NaBH 3 CN, TiCl 4, MeCN (g) Tf 2 O, piridin (h) metanol HCl, (i) LiAlH 4, THF (j) TsCl, piridina, CH 2 Cl 2 (k) NaN 3, DMF (L) 8, 2,6-di-t-butilpiridina, CH 2 Cl 2 (m) 13, CuSO 4, ascorbato, 2-propanol, H 2 O, CH 2 Cl 2.

espacio-temporal de manipulación de la actividad gtpasa pequeña en el nivel subcelular y en escala de tiempo de segundos en las células vivas

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Regulación dinámica de la familia Rho de pequeños triphosphatases guanosina (GTPasas) con una precisión espacial y temporal grande es esencial para varias funciones celulares y los eventos 1 y 2. Su naturaleza dinámica espaciotemporalmente ha sido revelado por la visualización de su actividad y localización en tiempo real 3. Con el fin de obtener un mayor conocimiento de sus funciones en diversas funciones celulares a nivel molecular, el siguiente paso debería ser la perturbación de las actividades de la proteína en un lugar concreto subcelular y el tiempo. Para lograr este objetivo, hemos desarrollado un método para la inducida por la luz, espacio-temporalmente la activación controlada de pequeñas GTPasas mediante la combinación de dos técnicas: (1) inducida por la rapamicina FKBP-FRB heterodimerización y (2) un método foto-jaulas de la rapamicina. Con el uso de rapamicina mediada FKBP-FRB heterodimerización, hemos desarrollado un método para la rápida inducible activación o inactivación de pequeño includi GTPasasng Rac 4, 4 Cdc42, RhoA 4 y 5 de Ras, en el que la rapamicina induce la translocación de FKBP fusionados GTPasas o sus activadores, a la membrana plasmática, donde está anclado FRB. Para el acoplamiento con este sistema heterodimerización, también hemos desarrollado un sistema de foto-jaulas de los análogos de rapamicina. Un compuesto foto-enjaulado es una pequeña molécula cuya actividad se suprime con un grupo protector conocido photocleavable como un grupo enjaulamiento. Para suprimir la actividad heterodimerización completamente, hemos diseñado un rapamicina enjaulado que está atado a una macromolécula tal que el gran complejo resultante no puede atravesar la membrana plasmática, que conduce a prácticamente ninguna actividad de fondo como una dimerizer química dentro de las células 6. Figura 1 ilustra un esquema de nuestra sistema. Con la combinación de estos dos sistemas, contratación local un activador de Rac a la membrana plasmática en una escala de tiempo de segundos y alcanzar la luz inducida por la activación de Rac a niveles subcelularEl 6.

Un método para el control espacio-temporal de la actividad GTPasa pequeña luz se describe. Este método se basa en la rapamicina inducida FKBP-FRB heterodimerización y sistemas de enjaulamiento foto-. Optimización de la luz de la irradiación permite la activación espacio-temporalmente controlada de las pequeñas GTPasas a nivel subcelular.

Espacio-Temporal de manipulación de la actividad GTPasa pequeña en el nivel subcelular y en escala de tiempo de segundos en las células vivas

La regulación dinámica de la familia Rho de pequeñas guanosina trifosfatasas (GTPasas) con una gran precisión espaciotemporal es esencial para diversos procesos celulares...

Este video demuestra un método en el que se utiliza luz UV para manipular la actividad de una proteína en la membrana plasmática. Para ello, las células se transfectan simultáneamente con la proteína FRB anclada a la membrana y la proteína de interés fusionada a FK BP. Se añade un derivado de rapamicina fotoencapsulada al medio.Luego, durante la imagen de células vivas, se aplica luz UV a una región específica de la célula. El enlazador entre la rapamicina y la biotina se escinde, liberando el dimerizador químico y su subproducto; el dimerizador liberado difunde hacia el interior de las células e induce la dimerización entre la proteína de interés marcada con FKBP y la FRB anclada a la membrana plasmática en la región irradiada. Sin la radiación UV, FKBP y FRB no se asocian, por lo tanto no producen ningún efecto.El análisis de los datos revela un reclutamiento altamente localizado de la proteína de interés fusionada con FKBP, basado en su efecto fisiológico. La ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como los enfoques farmacológicos y genéticos, es la combinación de rapidez de acción, especificidad del blanco y resolución espacial. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia del cáncer metastásico, que es consecuencia de la migración de células cancerosas.Por lo tanto, la manipulación de la actividad de factores clave de migración puede revelar su mecanismo molecular preciso, lo cual es un requisito previo para su tratamiento y cura. El procedimiento demostrativo estará a cargo de Chris Paul Meyer, un estudiante de posgrado, y Bob de Rose, un técnico de mi laboratorio. Comience este protocolo combinando lo siguiente en un tubo estéril de microcentrífuga: plásmido, ADN, FRB anclado a la membrana marcado con fluorescencia, FKBP, TIA uno y agua desionizada; añada una microlitro de enzima HD al mezcla y vortexee.Incube el tubo a temperatura ambiente durante 20 minutos. Durante la incubación, agregue 50 microlitros de poli-L-lisina a cada pocillo de una cámara de vidrio de ocho pocillos e incube durante un minuto para recubrir la superficie; luego aspire la solución y lave el centro de cada pocillo con 50 µL de agua desionizada. A continuación, se utiliza tripsina en células NIH 3T3 con una confluencia del 80 al 85 %.Después de que las células se desprendan, agregue 10 mililitros de DMEM que contenga 10% FBS, transfiera 375 microlitros de la suspensión a un tubo estéril de 15 mililitros y centrifugue a 1.500 ×g durante tres minutos. Tras la centrifugación, aspire cuidadosamente el medio. Añada 750 microlitros de DMEM con 10% FVS y Resus.Suspenda el precipitado mezclando suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces con la pipeta. Finalmente, agregue la suspensión celular a la solución de transfección y, utilizando la punta de la pipeta para mezclar suavemente, añada 250 microlitros de la suspensión celular para transfección a cada pocillo de la cámara. Deslice e incube.37 grados Celsius durante 15 a 18 horas. Para sintetizar la rapamicina encapsulada, aducto de biotina. Comience preparando una solución stock de un milimolar de CRB en DMSO en un tubo fuge estéril; en un tubo microcentrífugo separado de 1,5 mililitros, disuelva un miligramo de avadon en 250 microlitros de PBS.A continuación, conjugar el grupo protector con la rapamicina. Añada 0,5 microlitros de la solución stock de CRB a AVID disuelto, mezclando mediante varias inversiones y luego incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Para obtener la solución conjugada de CRB-AVID, excluya las moléculas pequeñas no unidas y purifique CRBA equilibrando una columna de exclusión por tamaño G-25 con 300 microlitros de PBS.Repita cinco veces después de que la columna haya equilibrado. Aplique 125 microlitros de solución de CRBA sobre el lecho central de la columna. Luego, centrifugue la solución durante dos minutos a 800 G a temperatura ambiente y recoja el flujo que atraviesa en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros tras la transfección de las células.Cambie el medio a DMEM sin FBS para privar de suero a las células e incube durante 12 horas. Después de la incubación, aspire suavemente el medio y agregue 250 microlitros de la solución de CRBA preparada de un micromolar. A continuación, para visualizar la dinámica de proteínas en células vivas, utilice un microscopio confocal de disco giratorio con iluminación UV para acoplar la óptica a una luz LED UV de 365 nanómetros.Con luz de fluorescencia epi. Defina las coordenadas y el tamaño de un punto de iluminación utilizando una placa de vidrio recubierta con colorantes fluorescentes excitados por luz UV. Esto permite un ajuste fino del área que se irradiará.Coloque el portaobjetos con cámara que contiene las células sobre la platina utilizando un objetivo de 100 x y fluorescencia epipolarizada. Enfoque las células y localice una célula. Para la adquisición de imágenes, comience a obtener imágenes de las células tras determinar los niveles de fondo del efecto fisiológico.Aquí, se mide el ondulado de la membrana irradiando luz UV en un cuadrante elegido de la célula, se disuelve el compuesto liberado, así como el rapamicina original en DMSO y luego en PBS hasta una concentración final de 400 nanomolares. Añada 100 microlitros de la solución a la cámara de imagen para inducir efectos globales. Capture imágenes de fluorescencia cada 15 segundos durante 20 minutos para determinar si la activación localizada de RAC puede inducir la formación local de ondulaciones.Las células NIH three T three fueron transfectadas con el activador de RAC marcado con YFP, FK bp, TIA one y LDR, que es un anclaje a la membrana. La irradiación localizada en FRB en el borde de la célula, indicada por el círculo amarillo, fue seguida por una iluminación global con una lámpara de mercurio durante un segundo a partir de los 1063 segundos. Como puede observarse aquí, casi no se presentó ondulación de la membrana al principio.Sin embargo, tras la iluminación localizada, se observó ondulación espacialmente confinada tras la iluminación global y la adición de rapamicina, que provoca la translocación de FK bp TIA uno hacia la membrana plasmática. La célula mostró formación de ondulaciones generalizadas, lo que indica que la formación de ondulaciones locales observada previamente fue causada por la activación espacialmente confinada de rack. Para un análisis cuantitativo, las células diana se dividieron en cuatro cuadrantes y se determinó la frecuencia de formación de ondulaciones en cada cuadrante tras la estimulación local y tras la estimulación global, como se muestra en este gráfico.Ninguna de las células observadas mostró formación de ruffles con CRBA sin irradiación UV o UV local, una irradiación con o sin Aden en medio masivo. Sin embargo, cuando se agregó CRBA y se realizó la irradiación UV, se observó formación de ruffles en aproximadamente el mismo porcentaje, alrededor del 90 % en todos los cuadrantes con irradiación global; cuando solo se irradió el cuadrante uno, la frecuencia de formación de ruffles fue del 100 % en comparación con 30 %, 25 % y 30 % en los cuadrantes dos a cuatro. Estos resultados indican que la desprotección localizada de rapamicina puede utilizarse para inducir efectos fisiológicos altamente localizados en una sola célula.En este caso, el arrugamiento de la membrana causado por la activación de rack. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo lograr un control espaciotemporal de la actividad de las proteínas pequeñas GTPasas mediante la luz. Este método podría aplicarse a cualquier proceso fisiológico que dependa de la translocación específica de proteínas hacia la membrana plasmática.Al realizar este procedimiento, es importante recordar preparar siempre soluciones, reactivos y células frescos para cada ensayo. No olvide que trabajar con luz ultravioleta puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de gafas protectoras contra la UV.

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Análisis espacio-temporal de cytokinetic Eventos en la levadura de fisión

Describimos cómo técnicas de micro - y Fotomanipulación como FRAP y fotoactivación permiten la determinación de los parámetros de motilidad y la dinámica espacio-temporal de las proteínas a migración de las células. Lecturas experimentales incluyen la dinámica subcelular y facturación de los reguladores de la motilidad o subyacente del citoesqueleto de actina.

Técnicas de micromanipulación que permite el análisis de las dinámicas morfogenéticas y facturación de los reguladores citoesqueléticos

Aquí se describe un protocolo para investigar la Prenilación y guanosina-5'-trifosfato (GTP)-carga de la GTPasa Rho. Este protocolo consta de dos métodos detallados, es decir, ensayo de fraccionamiento de la membrana y un GTPasa-ligado del inmunosorbente. El protocolo puede ser usado para medir la Prenilación y GTP carga de diferentes otras GTPasas pequeñas.

Detección de la pequeña GTPasa Prenilación y GTP obligatorio usar membrana fraccionamiento y GTPasa-linked Immunosorbent Assay

Las interacciones proteína-proteína son críticas para los sistemas biológicos, y estudios de la cinética de Unión proporcionan penetraciones en la dinámica y función de complejos de la proteína. Se describe un método que cuantifica los parámetros cinéticos de una proteína compleja mediante la transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia y la técnica de flujo detenido.

Uso en transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de Vitro para el estudio de la dinámica de los complejos de la proteína en una escala de tiempo de milisegundos

Las fuerzas mecánicas son importantes para controlar la migración celular. Este protocolo demuestra el uso de hidrogeles elásticos que se pueden deformar utilizando una micropipeta de vidrio y un micromanipulador para estimular las células con un gradiente de rigidez local para provocar cambios en la estructura celular y la migración.

Ensayo Desafiador durotaxis de una sola célula para evaluar el control mecánico del movimiento celular y los eventos de señalización relacionados

Aquí describimos un protocolo para la toma de imágenes de células vivas del citoesqueleto de microtúbulo cortical en el brote de meristem apical y el seguimiento de su respuesta a los cambios en las fuerzas físicas.

Imágenes de células vivas de citoesqueleto de microtúbulo y manipulación micromecánica del Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Se presenta aquí un protocolo para la proyección de imagen de la vivir-célula de la super-resolución en tejido intacto. Hemos estandarizado las condiciones para la obtención de imágenes de una población de células madre adultas altamente sensibles en su entorno de tejido nativo. Esta técnica consiste en equilibrar la resolución temporal y espacial para permitir la observación directa de fenómenos biológicos en tejidos vivos.

Super-Resolución De Imágenes De Células Vivas De Estructuras Subcelulares

Los inhibidores típicos de los microtúbulos, utilizados ampliamente en la investigación básica y aplicada, tienen efectos de gran alcance en las células. Recientemente, las fotostatinas surgieron como una clase de inhibidores de microtúbulos fotoconmutables, capaces de manipular instantáneamente, reversible y espaciotemporalmente precisa de microtúbulos. Este protocolo paso a paso detalla la aplicación de fotostatinas en un embrión de ratón preimplantacional vivo en 3D.

Manipulación subcelular espaciotemporal del citoesqueleto de microtúbulos en el embrión de ratón vivo preimplantacional utilizando fotostatinas

Aquí, se presenta un ensayo de reconstitución in vitro basado en microscopía TIRF para cuantificar y comparar simultáneamente la dinámica de dos poblaciones de microtúbulos. Se describe un método para ver simultáneamente la actividad colectiva de múltiples proteínas asociadas a microtúbulos en haces de microtúbulos reticulados y microtúbulos individuales.

Visualización simultánea de la dinámica de microtúbulos reticulados y únicos in vitro mediante microscopía TIRF

Este protocolo describe la aplicación de un dominio de interruptor alostérico activado por luz azul (LightR) para el control espacio-temporal reversible de la actividad de las proteínas. Utilizando la tirosina quinasa Src como modelo, este estudio ofrece un protocolo elaborado para desarrollar y caracterizar Src regulado por luz (LightR-Src). Demuestra la versatilidad de este enfoque en todas las clases de enzimas.

Control espacio-temporal de la actividad proteica a través de la regulación alostérica optogenética

Aprende a controlar la actividad de pequeñas GTPasas con precisión espacio-temporal usando luz UV y rapamicina foto-encapsulada en células vivas. Este método permite manipular señalización celular a nivel subcelular.

Espacio-Temporal de manipulación de la actividad GTPasa pequeña en el nivel subcelular y en escala de tiempo de segundos en las células vivas (Video) | JoVE Journal

Espacio-Temporal de manipulación de la actividad GTPasa pequeña en el nivel subcelular y en escala de tiempo de segundos en las células vivas

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