Espacio-Temporal de manipulación de la actividad GTPasa pequeña en el nivel subcelular y en escala de tiempo de segundos en las células vivas

Este vídeo muestra un método en el que se utiliza la luz ultravioleta para manipular la actividad de una proteína en la membrana plasmática. Para ello, las células se transfectan con la proteína FRB anclada a la membrana y la proteína FK BP fusionada de interés. Al medio se le añade un derivado de rapamicina fotoenjaulado.

Luego, durante la obtención de imágenes de células vivas, se aplica luz ultravioleta a una región específica de la célula. El enlazador entre la rapamicina y la biotina es un dimerizer químico liberador escindido y su subproducto, el dimerizer liberado, se difunde en las células e induce la dimerización entre la proteína de interés marcada con FKBP y la FRB anclada en la membrana plasmática en la región irradiada. Sin la radiación UV, FKBP y FRB no se asocian, por lo que no producen ningún efecto.

El análisis de los datos revela un reclutamiento altamente localizado de la proteína fusionada FKBP de interés en función de su efecto fisiológico. La ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la farmacología y el enfoque genético, es la combinación de la velocidad de acción, la especificidad del objetivo y la resolución espacial. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia del cáncer metastásico que es consecuencia de la migración de las células cancerosas.

Por lo tanto, la manipulación de la actividad de los factores clave de migración puede revelar su mecanismo molecular preciso, que es un requisito previo para su tratamiento y cura. Chris Paul Meyer, un estudiante de posgrado, y Bob de Rose, un técnico de mi laboratorio, harán una demostración del procedimiento. Comience este protocolo combinando lo siguiente en un plásmido estéril de tubo de microcentrífuga, ADN, FRB atado a la membrana FKBP marcado FLUORESCENTEMENTE, TIA uno y agua desionizada agregue un microlitro unos pocos genes HD a la mezcla y vórtice.

Incuba el tubo a temperatura ambiente durante 20 minutos. Durante la incubación, agregue 50 microlitros de poli de licina a cada pocillo de un lado de la cámara de vidrio de ocho pocillos e incube durante un minuto para cubrir la superficie, luego aspire la solución y lave el centro de cada pocillo con 50 de agua desionizada. A continuación, la tripsina es de 80 a 85% confluente NIH tres células T, tres células.

Después de que las células se separen, agregue 10 mililitros de DMEM que contengan 10%FBS, transfiera 375 microlitros de la suspensión a un tubo estéril de 15 mililitros y centrifugue a 1, 500 G durante tres minutos. Después del centrifugado, aspire con cuidado el medio. Añadir 750 microlitros de DMEM con 10%FVS y Resus.

Suspenda el pellet pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces. Finalmente, agregue la suspensión celular a la solución de transfección y, con la punta de la pipeta, revuelva suavemente, agregue 250 microlitros de la suspensión de transfección celular a cada pocillo de la cámara. Deslízalo e incuba.

37 grados centígrados durante 15 a 18 horas. Para sintetizar rapamicina de jaula, aducto de biotina. Comience preparando una solución madre de un milimolar de CRB en DMSO en un tubo de fuga estéril en un tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mililitros, disuelva un miligramo de avadon en 250 microlitros de PBS.

A continuación, conjuga la fracción de jaula con rapamicina. Añadir 0,5 microlitros de la solución madre de CRB a la AVID disuelta en la mezcla invirtiendo varias veces y luego incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Para producir CRB AVID en solución conjugada para excluir moléculas pequeñas no unidas y purificar CRBA, equilibre una columna de exclusión de tamaño G 25 con 300 microlitros de PBS.

Repita cinco veces después de que la columna se haya equilibrado. Cargue 125 microlitros de solución CRBA en el lecho central de la columna. A continuación, centrifugar la solución durante dos minutos a 800 g A temperatura ambiente, recoger el flujo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros después de la transfección de las células.

Cambie el medio a DMEM sin FBS para matar de hambre al suero, las células incuban durante 12 horas. Después de la incubación, aspire suavemente el medio y agregue 250 microlitros de la solución CRBA de un micromolar preparada. A continuación, para visualizar la dinámica de las proteínas en células vivas, utilice un microscopio confocal de disco giratorio con iluminación UV para acoplar la óptica de la luz LED UV a 365 nanómetros.

Con luz de epifluorescencia. Defina las coordenadas y el tamaño de un punto de iluminación mediante el uso de una placa de vidrio recubierta con tintes fluorescentes excitados por la luz ultravioleta. Esto permite un ajuste fino de la zona a irradiar.

Coloque el portaobjetos de la cámara con las células en la platina utilizando un objetivo de 100 x y epifluorescencia. Enfoca las células y encuentra una célula. Para la obtención de imágenes, comience a obtener imágenes de las células después de determinar los niveles de fondo del efecto fisiológico.

Aquí, se mide el ondulado de la membrana que irradia luz ultravioleta en un cuadrante elegido de la célula, se disuelve sin jaula, por lo tanto, rapamicina original en DMSO y luego en PBS hasta una concentración final de 400 nanomolares. Agregue 100 microlitros de la solución a la cámara de imágenes para inducir efectos globales. Capture imágenes de fluorescencia cada 15 segundos durante 20 minutos para determinar si la activación localizada de RAC puede inducir la formación de arrugas locales.

Se transfectaron tres células T tres de los NIH con el activador de RAC marcado con YFP FK BP, TIA one y LDR, que es una membrana anclada. La irradiación localizada de FRB en el borde de la célula indicado por el círculo amarillo, fue seguida por la iluminación global con una lámpara de mercurio durante un segundo a partir de los 1063 segundos. Como se puede ver aquí, casi no había ondulaciones en la membrana al principio.

Sin embargo, después de la iluminación localizada, se observaron ondulaciones confinadas espacialmente después de la iluminación global y la adición de rapamicina, lo que causa la translocación de FK bp TIA one a la membrana plasmática. La célula mostró una formación global de ondulaciones, lo que indica que la formación de ondulaciones locales observada anteriormente fue causada por la activación espacialmente confinada de la estantería. Para un análisis cuantitativo, las células objetivo se dividieron en cuatro cuadrantes y se determinó la frecuencia de formación de arrugas en cada cuadrante durante la estimulación local y global posterior, como se ve en este gráfico.

Ninguna de las células observadas mostró formación de arrugas con CRBA sin uva o uvé local, una radiación con o sin Adén en medio a granel. Sin embargo, cuando se agregó CRBA y se realizó la irradiación UV, se observó aproximadamente el mismo 90% en todos los cuadrantes con radiación global cuando solo se irradió el cuadrante uno, la frecuencia de formación de arrugas fue del 100% en comparación con el 30% 25% y el 30% en los cuadrantes dos a cuatro. Estos resultados indican que el desenjaulamiento localizado de rapamicina se puede utilizar para inducir efectos fisiológicos altamente localizados en una sola célula.

En este caso, ondulación de la membrana causada por la activación de la cremallera. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo lograr el control espacio-temporal de la actividad de los pequeños g TPA por la luz. Este método podría aplicarse a cualquier proceso fisiológico que dependa de proteínas específicas que se transloquen a la membrana plasmática.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe preparar soluciones, reactivos y células frescas para cada procedimiento. No olvide que trabajar con luz ultravioleta puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben usar precauciones como gafas UV.