Name: Ingeniería y Evolución de la sintética virus adeno-asociado (AAV) vectores de terapia génica a través de la familia transposición de ADN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: Aprende a generar bibliotecas diversas de cápsides de virus adeno-asociados sintéticos mediante fragmentación y reensamblaje de ADN. Este método permite evolucionar vectores AAV con propiedades mejoradas para aplicaciones de terapia génica.

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Los autores agradecen el apoyo sobresaliente de su laboratorio, los miembros del equipo y el trabajo del Cluster de Excelencia CellNetworks la Universidad de Heidelberg, así como por la Chica y Heinz Schaller (CHS) fundación. Somos conscientes de que la evolución molecular de AAV a través del ADN de la familia arrastrando los pies se ha convertido en un campo muy activo desde nuestra primera publicación hace tres años y por lo tanto, pedir disculpas a todos los autores de las publicaciones pertinentes, cuyo trabajo no podría ser citado aquí, debido a limitaciones de espacio.

<ol><li>Grimm, D., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+virus+evolution+to+vector+revolution%3A+use+of+naturally+occurring+serotypes+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+as+novel+vectors+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy.</a> Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+methods+for+gene+transfer+vectors+based+on+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Production methods for gene transfer vectors based on adeno-associated virus serotypes.</a> Methods. 28, 146-157 (2002).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+gene+therapy+vector+evolution+via+multispecies+interbreeding+and+retargeting+of+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses.</a> J. Virol. 82, 5887-5911 (2008).</li>
<li>Muller, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nat. Biotechnol. 21, 1040-1046 (2003).</li>
<li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism%3A+the+adeno-associated+virus+display%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Mol. Ther. 8, 151-157 (2003).</li>
<li>Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W. W., Guy, J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%22humanized%22+green+fluorescent+protein+cDNA+adapted+for+high-level+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells.</a> J. Virol. 70, 4646-4654 (1996).</li>
<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+the+adeno-associated+virus+type+2+%28AAV-2%29+capsid%3A+epitope+mapping+and+identification+of+capsid+domains+involved+in+AAV-2-cell+interaction+and+neutralization+of+AAV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection.</a> J. Virol. 74, 9281-9293 (2000).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatality+in+mice+due+to+oversaturation+of+cellular+microRNA%2Fshort+hairpin+RNA+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways.</a> Nature. 441, 537-541 (2006).</li>
<li>Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unrestricted+hepatocyte+transduction+with+adeno-associated+virus+serotype+8+vectors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice.</a> J. Virol. 79, 214-224 (2005).</li>
<li>Koerber, J. T., Jang, J. H., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+shuffling+of+adeno-associated+virus+yields+functionally+diverse+viral+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">DNA shuffling of adeno-associated virus yields functionally diverse viral progeny.</a> Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+selection+of+shuffled+AAV+genomes%3A+a+new+strategy+for+producing+targeted+biological+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Engineering and selection of shuffled AAV genomes: a new strategy for producing targeted biological nanoparticles.</a> Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008).</li>
<li>Ward, P., Walsh, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+AAV+Cap+sequences+alter+gene+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Chimeric AAV Cap sequences alter gene transduction.</a> Virology. 386, 237-248 (2009).</li>
<li>Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myocardium+tropic+adeno-associated+virus+%28AAV%29+evolved+by+DNA+shuffling+and+in+vivo+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3946-3951 (2009).</li>
<li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+engineering+of+a+gene+therapy+vector%3A+directed+evolution+of+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene.+Med%22%5BJournal%5D)">Combinatorial engineering of a gene therapy vector: directed evolution of adeno-associated virus.</a> J. Gene. Med. 8, 155-162 (2006).</li>
<li>Maheshri, N., Koerber, J. T., Kaspar, B. K., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+adeno-associated+virus+yields+enhanced+gene+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors.</a> Nat. Biotechnol. 24, 198-204 (2006).</li>
<li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotypes%3A+vector+toolkit+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Mol. Ther. 14, 316-327 (2006).</li>
<li>Kwon, I., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+gene+delivery+vectors%3A+molecular+engineering+and+evolution+of+adeno-associated+viral+vectors+for+enhanced+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer.</a> Pharm. Res. 25, 489-499 (2008).</li>
<li>Perabo, L., Huber, A., Marsch, S., Hallek, M., Buning, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+evolution+with+adeno-associated+viral+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High.+Throughput.+Screen%22%5BJournal%5D)">Artificial evolution with adeno-associated viral libraries.</a> Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 118-126 (2008).</li>
<li>McCarty, D. M., Monahan, P. E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+recombinant+adeno-associated+virus+%28scAAV%29+vectors+promote+efficient+transduction+independently+of+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis.</a> Gene Ther. 8, 1248-1254 (2001).</li>
</ol>

Todos los autores declaran que no tienen nada que revelar.

En este sentido, hemos delineado los pasos esenciales de experimentación y directrices para la AAV cápside de ingeniería a través de la familia de ADN revolver y para la evolución de las células o en animales. En esencia, estos protocolos son versiones estándar de los procedimientos se informó por primera en el campo de AAV en 2008 3. Mientras que un aluvión de estudios de seguimiento por otros han informado de numerosas modificaciones, por ejemplo, 10-13, nuestras versiones actuales repre...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DNasa I </td><td> Invitrogen </td><td> 18068-015 </td></tr><tr><td> Polietilenimina (PEI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 408727 </td></tr><tr><td> Las enzimas de restricción </td><td> NEB </td><td> Varios </td></tr><tr><td> T4 ADN ligasa </td><td> NEB </td><td> M0202T </td></tr><tr><td> Gel kit de extracción de </td><td> Qiagen </td><td> 28704 </td></tr><tr><td> Phusion II Juego de la polimerasa </td><td> Finnzymes (NEB) </td><td> F-540S </td></tr><tr><td> HotStar alta fidelidad Kit de la polimerasa </td><td> Qiagen </td><td> 202602 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Finnzymes (NEB) </td><td> F-540S (parte del kit) </td></tr><tr><td> EDTA (25 mM) </td><td> Invitrogen </td><td> 18068-015 (parte del kit) </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Roth </td><td> 4855.2 </td></tr><tr><td> Ampicilina sal de sodio </td><td> Roth </td><td> K029.2 </td></tr><tr><td> dNTP (10 mM, 100 l) </td><td> Invitrogen </td><td> 18427013 </td></tr><tr><td> Iodixanol (OptiPrep) </td><td> Axis-Shield </td><td> 1114739 </td></tr><tr><td> PHENOLRED </td><td> Merck </td><td> 107241 </td></tr><tr><td> Kit de preparación de plásmido Mega </td><td> Qiagen </td><td> 12181 </td></tr><tr><td> Ultracentrífuga </td><td> Beckman-Coulter </td><td> Optima L90K </td></tr><tr><td> Quick-Seal tubos de centrífuga </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 342414 </td></tr><tr><td> La electroporación unidad </td><td> Bio-Rad </td><td> GenePulserXcell </td></tr><tr><td> Termociclador </td><td> Eppendorf </td><td> Vapo Protect </td></tr><tr><td> Calefacción bloque </td><td> BIOER </td><td> MB-102 </td></tr><tr><td> Microscopio de fluorescencia </td><td> Olimpo </td><td> IX81 </td></tr><tr><td> Analizador de FACS </td><td> Beckman-Coulter </td><td> Cytomics FC500 MLP </td></tr><tr><td> MegaX DH10B T1R células </td><td> Invitrogen </td><td> C640003 </td></tr><tr><td> Benzonase </td><td> Merck </td><td> 101695 </td></tr><tr><td> Adenovirus-5 </td><td> ATCC </td><td> VR-5 </td></tr><tr><td> pBluescript II KS (+) plásmido </td><td> Stratagene </td><td> 212207 </td></tr><tr><td> cap5F (Pac sitio que en el amarillo, cap5 secuencias específicas en negrita): GACTCTTAATTAACAGGT ATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC </td><td> IDTDNA </td><td> Imprimación personalizada </td></tr><tr><td> cap5R (Asc que el sitio en verde, cap5 secuencias específicas en negrita): GTGAGGGCGCGCC TTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC </td><td> IDTDNA </td><td> Imprimación personalizada </td></tr></tbody></table>

ingeniería y evolución de la sintética virus adeno-asociado (aav) vectores de terapia génica a través de la familia transposición de adn

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Virales adeno-asociados (AAV) vectores representan algunos de los vehículos más potentes y prometedores para la transferencia de gen terapéutico humano debido a una combinación única de propiedades beneficiosas 1. Estos incluyen el apathogenicity de los virus de tipo salvaje subyacentes y las metodologías muy avanzadas para la producción de alto título, de alta pureza y de grado clínico vectores recombinantes 2. Una ventaja adicional particular del sistema de AAV sobre otros virus es la disponibilidad de una riqueza de origen natural serotipos que difieren en propiedades esenciales sin embargo, todos pueden ser fácilmente diseñado como vectores utilizando un protocolo común 1,2. Por otra parte, una serie de grupos, entre ellos el nuestro han creado recientemente las estrategias a utilizar estos virus naturales como plantillas para la creación de vectores sintéticos que, o bien se combinan los activos de los serotipos de entrada múltiples, o que mejorar las propiedades de un solo aislamiento. Las respectivas tecnologías para lograr estos objetivos are ADN de la familia ya sea arrastrando los pies 3, es decir, la fragmentación de los diversos genes de la cápsida AAV, seguida de su nuevo montaje basado en homologías parciales (normalmente&gt; 80% para la mayoría de los serotipos de AAV), o de visualización 4,5 péptido, la inserción es decir, que suele ser de siete aminoácidos en un bucle expuesta de la cápsida viral donde el péptido idealmente media re-dirigida a un tipo de célula deseado. Para el mayor éxito posible, ambos métodos se aplican de un modo de alto rendimiento por el que los protocolos están en mayor escala para producir las bibliotecas de alrededor de un millón de variantes diferentes cápside. Cada clon es entonces compuesto de una combinación única de numerosos virus parentales (ADN enfoque arrastrando los pies) o contiene un péptido distintivo en la columna vertebral misma viral (enfoque pantalla péptido). El paso final es iterativo subsiguiente selección de dicha biblioteca sobre las células diana a fin de enriquecer para cápsidas individuales que cumplan la mayoría o idealmente todos los requisitos del proceso de selección. Este último preferiblemente peineines presión positiva, como el crecimiento en un cierto tipo de células de interés, con selección negativa, por ejemplo la eliminación de todas las cápsidas que reaccionan con anticuerpos anti-AAV. Esta combinación aumenta las posibilidades de que cápsidas sintéticos que sobreviven a la selección coincidan con las necesidades de la aplicación dada de una manera que probablemente no se han encontrado en cualquier forma natural AAV aislar. Aquí, nos centramos en el método de ADN de la familia arrastrando los pies como la teórica y experimentalmente más difícil de las dos tecnologías. Se describe y demostrar todos los pasos esenciales para la generación y selección de las bibliotecas barajan AAV (Fig. 1), y luego discutir las dificultades y los aspectos críticos de los protocolos que hay que tener en cuenta a fin de tener éxito con la evolución molecular de AAV.

Se demuestra la técnica básica para diseñar y evolucionar molecularmente sintéticos virales adeno-asociados (AAV) vectores de terapia génica a través de la familia de ADN arrastrando los pies. Por otra parte, nos proporcionan las pautas generales y ejemplos representativos para la selección y el análisis de cada uno de cápsidas quiméricas con propiedades mejoradas en las células diana en la cultura o en ratones.

Ingeniería y Evolución de la sintética virus adeno-asociado (AAV) vectores de terapia génica a través de la familia transposición de ADN

Los vectores de virus adenoasociados (AAV) representan algunos de los vehículos más potentes y prometedores para la transferencia génica terapéutica en humanos debido a un único...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en crear una biblioteca altamente diversa de cápsidas virales sintéticas asociadas a adenovirus, a partir de la cual se puedan seleccionar partículas con una propiedad deseada. Esto se logra fragmentando primero los genes de la cápside de aav, clonándolos y seleccionándolos mediante digestión controlada de ADN con una enzima de restricción, para permitir su posterior reensamblaje en secuencias quiméricas mediante dos reacciones de PCR. Como segundo paso, el producto de PCR resultante se clona nuevamente en un constructo de aav con capacidad de replicación, obteniendo así una biblioteca de plásmidos que comprende al menos un millón de genes diferentes de cápside de aav.A continuación, esta biblioteca de plásmidos se transfecta en células 2 9 3 T, junto con un plásmido auxiliar adenoviral para producir una biblioteca de virus quiméricos que luego puede seleccionarse en células diana o en animales. Los resultados muestran la ingeniería molecular y evolución exitosas de nuevos vectores sintéticos de AAV basados en una expresión mejorada o más específica de genes reporteros en células cultivadas o en ratones adultos. La principal ve

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aquí, describimos una estrategia eficiente y reproducible para producir, título y lotes de control de calidad de vectores de virus adeno-asociado. Permite al usuario obtener una preparación de vector con alto título (≥1 x 1013 vector genomas/mL) y una alta pureza, para uso en vitro o en vivo .

Producción, purificación y Control de calidad de vectores de base de Virus Adeno-asociado

Aquí proporcionamos un procedimiento detallado para la producción a gran escala de vectores AAV de grado de investigación utilizando células HEK 293 adherentes cultivadas en pilas celulares y purificación por cromatografía de afinidad. Este protocolo produce consistentemente &gt;1 x 1013 genomas vectoriales / ml, proporcionando cantidades vectoriales apropiadas para estudios con animales grandes.

Producción de vectores de virus adenoasociados en pilas celulares para estudios preclínicos en modelos animales grandes

Generación de la biblioteca de visualización de péptidos AAV y posterior validación a través del código de barras de candidatos con propiedades novedosas para la creación de AAV de próxima generación.

Aislamiento de vectores de terapia génica de próxima generación a través de ingeniería, códigos de barras y detección de variantes de cápside del virus adenoasociado (AAV)

Aquí, presentamos un protocolo para el desarrollo y validación de buenas prácticas de laboratorio en la detección compatible de vectores virales adenoasociados en lágrimas humanas por reacción en cadena de la polimerasa digital de gotitas en apoyo del desarrollo clínico de vectores de terapia génica.

Un ensayo validable de reacción digital de la polimerasa en cadena de gotas para la detección de vectores virales adenoasociados en estudios de bioderramamiento de lágrimas

El virus adenoasociado recombinante (rAAV) se usa ampliamente para la administración clínica y preclínica de genes. Un uso poco apreciado de los rAAV es la transducción robusta de células cultivadas sin necesidad de purificación. Para los investigadores nuevos en rAAV, proporcionamos un protocolo para la clonación de casetes transgénicos, la producción de vectores crudos y la transducción de cultivos celulares.

Expresión de transgenes en células cultivadas utilizando vectores virales adenoasociados recombinantes no purificados

El virus adenoasociado se produce en cultivo celular en suspensión y se purifica mediante centrifugación de doble gradiente de densidad de yodixanol. Se incluyen medidas para aumentar el rendimiento total del virus, disminuir el riesgo de precipitación del virus y concentrar aún más el producto final del virus. Los títulos finales esperados alcanzan las 1012 partículas virales/ml y son adecuados para el uso preclínico in vivo .

Producción de cultivos en suspensión y purificación de virus adenoasociados mediante centrifugación en gradiente de densidad de yodixanol para aplicaciones in vivo

Este manuscrito describe un protocolo detallado para la generación y purificación de vectores virales adenoasociados utilizando un método optimizado de cromatografía de afinidad basado en heparina. Presenta un enfoque simple, escalable y rentable, que elimina la necesidad de ultracentrifugación. Los vectores resultantes exhiben una alta pureza y actividad biológica, lo que demuestra su valor en estudios preclínicos.

Aislamiento de vectores virales adenoasociados mediante un protocolo de cromatografía de afinidad con heparina semiautomatizado y de un solo paso

La cuantificación precisa de las copias del genoma del vector de virus adenoasociados (AAV) es fundamental, pero aún no se ha establecido un protocolo estandarizado. Este protocolo describe un método validado para preparar muestras purificadas de AAV y realizar una reacción en cadena de la polimerasa (dd_PCR) digital para cuantificar de forma fiable el título del genoma viral.

Cuantificación de genomas virales adenoasociados en muestras de vectores purificadas mediante reacción en cadena de la polimerasa por gotas digitales

Este protocolo tiene como objetivo introducir un método para producir y purificar biomiméticos extracelulares derivados de células madre mesenquimales (MSC) para la terapia génica. La nanovesícula está confinada con bicapas lipídicas derivadas de MSC y encapsula los AAVs recombinantes que portan el gen de interés en la luz. Esta nanovesícula ofrece un vector mejorado para la entrega de genes in vivo .

Desarrollo de nanovesículas envueltas en membrana de células madre mesenquimales para mejorar la entrega génica

Rescate de virus de gripe A a partir del ADN plásmido es una técnica experimental básica y esencial que permite a los investigadores de la gripe para generar virus recombinantes para estudiar múltiples aspectos de la biología de los virus de la influenza, y para ser utilizado como vectores potenciales o vacunas.

Generación de recombinantes del virus de influenza a partir del ADN plásmido

Aprende a generar bibliotecas diversas de cápsides de virus adeno-asociados sintéticos mediante fragmentación y reensamblaje de ADN. Este método permite evolucionar vectores AAV con propiedades mejoradas para aplicaciones de terapia génica.

Ingeniería y Evolución de la sintética virus adeno-asociado (AAV) vectores de terapia génica a través de la familia transposición de ADN (Video) | JoVE Journal

Ingeniería y Evolución de la sintética virus adeno-asociado (AAV) vectores de terapia génica a través de la familia transposición de ADN

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