Ingeniería y Evolución de la sintética virus adeno-asociado (AAV) vectores de terapia génica a través de la familia transposición de ADN

El objetivo general del siguiente experimento consiste en crear una biblioteca altamente diversa de cápsidas virales sintéticas asociadas a adenovirus, a partir de la cual se puedan seleccionar partículas con una propiedad deseada. Esto se logra fragmentando primero los genes de la cápside de aav, clonándolos y seleccionándolos mediante digestión controlada de ADN con una enzima de restricción, para permitir su posterior reensamblaje en secuencias quiméricas mediante dos reacciones de PCR. Como segundo paso, el producto de PCR resultante se clona nuevamente en un constructo de aav con capacidad de replicación, obteniendo así una biblioteca de plásmidos que comprende al menos un millón de genes diferentes de cápside de aav.

A continuación, esta biblioteca de plásmidos se transfecta en células 2 9 3 T, junto con un plásmido auxiliar adenoviral para producir una biblioteca de virus quiméricos que luego puede seleccionarse en células diana o en animales. Los resultados muestran la ingeniería molecular y evolución exitosas de nuevos vectores sintéticos de AAV basados en una expresión mejorada o más específica de genes reporteros en células cultivadas o en ratones adultos. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la presentación de péptidos es que el intercambio genético por familias tiene el potencial de alterar y mejorar simultáneamente múltiples características de la cápside del AAV, desde la unión a células y el tráfico intracelular hasta la desencapsidación y la expresión génica en el núcleo.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la terapia génica y la virología, como cómo obtener un vector ideal para una aplicación terapéutica determinada o cómo analizar los dominios de una cápside viral responsables de una propiedad específica. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de múltiples enfermedades humanas, incluyendo infecciones por patógenos virales, ya que nuestro método permite la evolución molecular de vectores A V que infectan de manera específica y potente células diana virales, como linfocitos T para el VIH o hepatocitos para los virus de la hepatitis. Aunque este método puede proporcionar información sobre la biología de los A V y puede utilizarse para mejorar los vectores AV para la terapia génica.

También puede aplicarse fácilmente a otras familias de genes de relevancia básica o aplicada, como fluorescencia con codificación de dosis, tres reporteros, enzimas celulares o proteínas implicadas en la interferencia de ARN. Tuvimos la idea original de este método cuando estábamos intentando encontrar un buen vector para transfectar fragmentos de ratones adultos con genes terapéuticos y nos dimos cuenta de que todos los serotipos virales adenoasociados (AV) que ocurren naturalmente presentaban desventajas, tales como una alta prevalencia en la población humana y, por consiguiente, una elevada incidencia de inmunidad preexistente, o un mal desempeño in vivo a pesar de una transducción eficiente en cultivo. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la fragmentación del gen de la cápside viral AV basada en ADN y algunos de los pasos de producción de la biblioteca viral son difíciles de aprender porque requieren experiencia y conocimiento de las etapas críticas, con el fin de facilitar la preparación rutinaria de cantidades suficientes de los diversos genes de la cápside del virus adenoasociado.

Para la reordenación de ADN, estos genes se subclonan inicialmente en un armazón común de plásmido. Para lograr esto, los genes cap deseados se amplifican primero mediante PCR a partir de plásmidos AAV comúnmente disponibles, utilizando los cebadores cap F y cap R. Luego, los genes cap se clonan en un plásmido diseñado para contener sitios específicos de unión de cebadores, así como sitios de restricción. En este ejemplo, el gen cap se clona en los sitios PAC uno y SC uno, que están presentes en los cebadores utilizados para la amplificación de cap y en el plásmido receptor, pero ausentes en la mayoría de los AAV. Tras generar los conjuntos de plásmidos que codifican los genes de la cápside AAV, inicie el procedimiento de reordenación de cap mediante PCR, amplificando los genes cap de elección utilizando los cebadores T tres y T siete.

Prepare una reacción de PCR de 50 microlitros que contenga 200 nanogramos de plásmido cap, cada cebador a una concentración final de dos micromolar, 10 microlitros de tampón five x high five y un microlitro de polimerasa high five. Esta reacción producirá aproximadamente tres microgramos de producto de PCR, cantidad suficiente para hasta seis reacciones de shuffling, dependiendo del número de genes cap que se incluyan en la biblioteca. Comience con cinco minutos a 95 grados Celsius y luego realice 40 ciclos de 15 segundos a 94 grados Celsius, 30 segundos a 57 grados Celsius y tres minutos a 68 grados Celsius, seguidos de un paso final de 10 minutos a 72 grados Celsius.

Después de purificar los productos de PCR, se utiliza una digestión controlada de ADN para crear fragmentos del gen cap que se volverán a ensamblar en Kyra. Uno de los aspectos más difíciles de este procedimiento consiste en obtener un rango útil determinado de fragmentos de ADN del gen cap digeridos para el reensamblaje en kyras. Con este fin, preparamos cantidades PLE de genes cap purificados para comenzar, y luego establecemos múltiples reacciones paralelas con condiciones variables. Para preparar la digestión de manera uniforme, mezcle los diversos productos de PCR del gen cap hasta alcanzar una cantidad total de cuatro microgramos en 54 microlitros de agua, y luego agregue seis microlitros de tampón de reacción DS y 0,5 microlitros de DNAsa I a la reacción. Vortexee el tubo tres veces, centrifugue brevemente e inmediatamente colóquelo en un bloque calefactor a 25 grados Celsius.

Incube esta primera reacción durante un minuto. A continuación, prepare una segunda reacción de digestión, pero incube a 25 grados Celsius durante un minuto y 15 segundos. De este modo, establezca múltiples reacciones paralelas con tiempos de incubación entre uno y dos minutos, variando el tiempo de incubación en incrementos de 15 segundos.

Detenga cada reacción añadiendo seis microlitros de EDTA 25 milimolar. Vortexe brevemente el tubo e incube durante 10 minutos a 75 grados Celsius. Las múltiples reacciones paralelas darán como resultado cinco muestras de cap digeridas con ADN, una para tiempos variables de incubación, y purifique los fragmentos de cap en un gel estándar de AROS al 1%.

Idealmente, se debería observar una banda difusa entre 100 y 500 pares de bases, como se muestra en este ejemplo con tiempos de incubación de un minuto, 45 segundos o dos minutos al inicio. Para reensamblar los fragmentos de cap en secuencias completas mediante PCR de fusión, primero se realiza una reordenación de la familia de ADN en la que los fragmentos se autoprimerizan basándose en homologías parciales. Prepare una reacción de 50 microlitros con 500 nanogramos de fragmentos purificados, 10 microlitros de tampón de fusión 10x, un microlitro de dNTPs 10 milimolares, 1,5 microlitros de DMSO y 0,5 microlitros de fusión.

Dos polimerasas se incuban durante 30 segundos a 98 grados Celsius y luego se realizan 40 ciclos de 10 segundos a 98 grados Celsius, 30 segundos a 42 grados Celsius y 45 segundos a 72 grados Celsius, seguidos por un paso final de 10 minutos a 72 grados Celsius. A continuación, amplifique los genes del casquete reensamblados para clonación posterior mediante una segunda PCR utilizando cebadores que se unen a las secuencias conservadas flanqueantes. Por ejemplo, SAF y SAR o CUF y CUR preparan una reacción de 50 microlitros que contiene dos microlitros de la primera PCR, cada cebador a una concentración final de dos micromolar, 0,5 microlitros de cloruro de magnesio, 10 microlitros de tampón cinco x high-FI y un microlitro de polimerasa high-FI.

Se recomiendan de 16 a 24 PCR para asegurar rendimientos suficientemente altos para la clonación posterior. Después de reunir los productos de PCR y purificar la banda completa del casquete, el siguiente paso consiste en digerir el grupo de genes del casquete purificado con PAC I y SC I para clonarlo en un plásmido de AAV con capacidad de replicación. El plásmido receptor lleva repeticiones terminales invertidas de AAV que flanquean el gen rep de AAV2 bajo el control del promotor P5 de AAV, PAC I y ASC I.

Los sitios de restricción ubicados aguas abajo de rep permiten la clonación en fase de la población de cap intercambiado. Los sitios de unión del cebador LSE indicados por flechas son útiles para la secuenciación del gen cap, ate los fragmentos de cap y el andamio del plásmido receptor cortado adecuadamente en una relación molar de tres a uno. Prepare una mezcla maestra con un volumen total de 40 microlitros, suficiente para 20 transformaciones, con una concentración final de ADN de 15 nanogramos por microlitro.

Incubar durante la noche a 16 grados Celsius al día siguiente, transformar la reacción de ligación en e coli. Mezclar dos microlitros de la reacción de ligación con 30 microlitros de e coli electrocompetente y transferir a cubetas de electroforesis previamente enfriadas sobre hielo. Aplicar electrochoque a 1,8 kilovoltios, 200 ohmios y 25 microfaradios. La constante de tiempo debe estar cercana a cinco milisegundos. Inmediatamente, añadir un mililitro de medio SOC precalentado y transferir a un matraz de 250 mililitros.

20 electroporaciones de este tipo producirán una biblioteca con una diversidad de aproximadamente uno por diez elevado a seis clones diferentes. Añada un volumen de medio SOC precalentado a las transformaciones agrupadas y agite a 37 grados Celsius y 180 RPM durante una hora. Luego, añada 40 mililitros de las transformaciones agrupadas a 800 mililitros de medio lb más ampicilina e incube durante otras 16 horas en las mismas condiciones; después, el ADN plasmídico de la biblioteca se purifica utilizando un kit disponible comercialmente.

La producción de la biblioteca viral comienza con la transfección de células HEC 2 9 3 T con la biblioteca a a v. Para iniciar este procedimiento, siembre células HEC 2 9 3 T en placas cuadradas de 10 a 15 centímetros y cultívelas durante 48 horas a 37 grados Celsius. Para cada transfección, prepare las siguientes dos mezclas de reactivos en dos tubos separados. Las siguientes cantidades se indican por cada 10 placas en el primer tubo.

Mezcle 7,9 mililitros de cloruro de sodio y ADN, y agregue agua hasta un volumen total de 15,8 mililitros. En el segundo tubo, agregue 3,52 mililitros de polietilenoamina, 7,9 mililitros de cloruro de sodio y 4,38 mililitros de agua. Combine las mezclas, vortexee e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Distribuya la solución uniformemente en cada placa de células HEK 293T. Incube a 37 grados Celsius.

Después de 48 horas, se puede recolectar la biblioteca viral. Raspe las células hacia el medio, reúna las células de todos los cultivos en un solo tubo y centrifugue a 1200 RPM durante 15 minutos. Reuspenda el botón celular en seis mililitros de tampón de lisis y luego someta a cinco ciclos de congelación-descongelación; después de los cinco ciclos de congelación-descongelación, incube con Ben Nase durante una hora a 37 grados Celsius.

A continuación, centrifugue los restos celulares a 3.750 RPM durante 20 minutos. Prepare un gradiente para una purificación por gradiente al usar una pipeta Pasteur para añadir cinco mililitros de suspensión viral en un tubo de centrífuga Beckman Quick-Seal, seguido de 1,5 mililitros de cada solución de sacarosa al 15%, 25% y 40%. Complete el gradiente con tampón de lisis y ultracentrifugue a 50.000 × g durante dos horas a cuatro grados Celsius.

Al finalizar la ultracentrifugación, retire el tubo del rotor y limpie el exterior del tubo con etanol al 70%. Introduzca una aguja en la parte superior del tubo para ventilación y utilice otra aguja para extraer 1,2 mililitros de la fracción de IOL al 40%. Tenga cuidado de no extraer de la fracción al 25%, ya que contiene partículas vacías.

Los capides de AAV. Se analizan clones individuales de la biblioteca original de plásmidos en cuanto a su funcionalidad y diversidad, utilizando cada uno para producir vectores recombinantes. Luego, células cultivadas o animales que expresan un gen reportero se infectan con diferentes cantidades del virus purificado y se determina la eficiencia de transducción.

Se muestran aquí resultados de microscopía de fluorescencia de tres líneas celulares humanas infectadas con cinco vectores recombinantes diferentes que expresan YFP con genes cap reordenados. Un método alternativo para analizar la eficiencia de transducción es la medición basada en hechos de la expresión del gen reportero fluorescente. Esta figura muestra un resultado típico de cuatro tipos celulares: células humanas de riñón, cérvix humano, fibroblastos murinos y linfocitos T humanos, infectados con 18 vectores recombinantes diferentes que expresan YFP con genes cap reordenados, seleccionados al azar a partir de una biblioteca original.

La expresión de YFP fue codificada por colores para facilitar la visualización. Los porcentajes representados corresponden a células transducidas, donde el color negro indica 0 % y el blanco indica el número más alto medido en cada clon de tipo celular. El clon B dos rojo ejemplifica un clon con baja eficacia general, tal como se esperaría de cápsidas no seleccionadas. Luego, la biblioteca viral puede ser analizada para identificar partículas individuales que exhiban la mayoría o todas las propiedades deseadas en una línea celular determinada o en animales, para selección.

En células cultivadas, primero se infectan conjuntamente con diversas alícuotas de la biblioteca y el virus ENO cinco para favorecer un crecimiento de a a v; luego, se recolectan las células y se extrae el a a v amplificado, que se utiliza para reinfectar células nuevas. Determinar las relaciones óptimas de adenovirus a a v para la coinfección de células es importante, y un buen indicador de una infección potente por arius es la aparición de efectos citopáticos tres días después de la inoculación del virus, evidenciados por el redondeo y desprendimiento celular. En esta figura, el panel superior izquierdo muestra células no infectadas, mientras que los otros paneles muestran células infectadas con las cantidades indicadas, en partículas por célula, de adenovirus. Otra lectura útil para la infección y amplificación de a a v es la detección de proteínas de la cápside mediante inmunotransferencia (western blot) usando el anticuerpo B uno, que reconoce un epítopo altamente conservado de la cápside de a a v.

La tinción izquierda muestra células co-infectadas con diversos volúmenes en microlitros de una biblioteca a a V y el virus auxiliar ENO vir. Las dos primeras bandas son buenos ejemplos de condiciones que producen una expresión de la proteína a a v apenas detectable, lo que indica una infección y amplificación de a a v suficiente pero no excesiva, y por lo tanto, un acoplamiento genotipo-fenotipo deseado. Por consiguiente, se utilizaron 0,11 o 10 microlitros de estos sobrenadantes para la reinfección de células frescas.

Los resultados del inmunotransferencia se muestran en las celdas de la derecha. En LA c se infectaron con una a v sola como control negativo. También es fundamental monitorear la diversidad de la biblioteca durante rondas repetidas de infección mediante secuenciación de ADN.

Este diagrama muestra las comparaciones de las secuencias de proteínas de clones de AAV a partir de una biblioteca basada en AAV dos, ocho y nueve, antes y después de la selección; las secuencias por encima de la línea roja muestran los AAV parentales. Las flechas moradas indican eventos de recombinación homóloga. La flecha roja marca un entrecruzamiento entre AAV dos y AAV nueve observado en todos los clones seleccionados. Para la selección en animales, la biblioteca de a a V se infunde en los animales, se recupera de las células o tejidos diana mediante PCR y luego se reclona y vuelve a empaquetar para una nueva ronda de infección.

Se muestra aquí un ejemplo de rescate de clones de aav exitosamente infectados a partir de hígados de ratón una semana después de la infusión periférica de la biblioteca. La calle uno muestra la banda esperada de 2,2 kilobases, mientras que la calle dos es un control sin molde; los tamaños de las bandas del marcador de ADN en la calle M se indican en kilobases. Independientemente del procedimiento de selección, la variante de cápside enriquecida debe validarse finalmente en sistemas adecuados.

Un ejemplo del rendimiento superior de una quimera a a V enriquecida en células cultivadas se muestra aquí. Los colores más oscuros indican una mayor infectividad por número de partículas, y por tanto por clon. A-A-V-D-J supera a una colección de ocho tipos silvestres naturales a a v en una amplia gama de líneas celulares.

Finalmente, se muestra un análisis de un a a V KYMERA seleccionado en hígado de ratón clonado. Se seleccionó un A A V DN basado en células de hepatoma reflectantes y luego se utilizó para producir vectores recombinantes expresando un soporte lucido, mostrados en nuestros ratones representativos, tres por grupo, una semana después de la infusión periférica de dosis iguales de este vector o un control basado en AAV tipo salvaje ocho, uno de los aislamientos naturales más potentes conocidos en hígado de ratón. Obsérvese que, aunque el clon A VDN produce ligeramente menos expresión general en el hígado, es más específico para este órgano, ya que exhibe una desviación sustancialmente menor hacia tejidos no hepáticos una vez que los niveles de expresión hepática se han ajustado mediante el software de imagenología.

Esta técnica puede realizarse en una semana, comenzando con la amplificación de los genes de la cápside de a a V y terminando con la biblioteca viral, siempre que se realice adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el protocolo proporcionado aquí se ha derivado de nuestras experiencias con la selección de serotipos naturales de AV y que es muy posible que algunas condiciones deban adaptarse y ajustarse cuando otros usuarios realicen sus propias bibliotecas personalizadas. Además de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la presentación de péptidos mediante mutagénesis dirigida con AGENESIS o la aleatorización basada en PCR, con el fin de generar también bibliotecas altamente diversas o intentar mejorar aún más las propiedades de las cápsides que se hayan creado y enriquecido mediante el intercambio genético familiar después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la entrega génica viral exploraran estrategias terapéuticas para enfermedades y células diana relacionadas, para las cuales los tipos convencionales de A VC ofrecían resultados insatisfactorios, como la infección por VIH y las células T, así como para explorar la transferencia génica mediada por vectores en células madre humanas y otras células cardíacas para infectar células en cultivo. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo diseñar y evolucionar bibliotecas altamente diversas de vectores virales adenoasociados sintéticos mediante una combinación de fragmentación y reensamblaje génico, así como de cómo seleccionar estos bancos de manera adecuada en células cultivadas o en animales, con el fin de enriquecer cápsides individuales con propiedades específicas deseadas para su uso como vectores de transferencia génica. No olvides que trabajar con adenovirus puede ser peligroso y que se deben tomar muchas precauciones durante la realización de este procedimiento.