Un sistema de neuronas cultivo primario para el estudio de la latencia del virus del herpes simple y Reactivación

El objetivo de este experimento es demostrar cómo puede utilizarse un sistema de cultivo celular de neuronas primarias para estudiar la latencia y la reactivación del virus del herpes simple. Esto se logra primero aislado neuronas de los ganglios cervicales superiores de embriones RA y cultivando las neuronas aisladas de ganglios disociados tras la eliminación de células no neuronales. Se establece una infección latente por HSV utilizando un virus EGFP para infectar neuronas en presencia de un inhibidor de la replicación lítica.

El siguiente paso consiste en inducir la reactivación de los cultivos infectados latentes. Finalmente, se evalúa la eficiencia de la reactivación mediante el monitoreo de la expresión de EGFP a lo largo del tiempo. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren cómo diferentes vías de señalización neuronal regulan la latencia y la reactivación del virus del herpes simple mediante el uso de inhibidores químicos, interferencia de ARN y entrega génica.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que permite estudios detallados de las interacciones que regulan la latencia del herpes simple en el neuron del hospedador a nivel molecular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la latencia del herpes simple, como cuáles son las señales que actúan para reprimir el genoma latente y cómo se desencadena la reactivación a nivel molecular. En neuronas, este método puede proporcionar información sobre la latencia del HSV-1.

También puede aplicarse a otros alfa herpesvirus neurotróficos. El procedimiento será demostrado por Marigo, Kochi y Julian Kim, ambos estudiantes de posgrado en nuestros laboratorios. Los ganglios cervicales superiores o neuronas SCG para este protocolo se aíslan de crías de rata E21 que fueron extraídas del útero de una rata hembra preñada. Trabajando en una campana de disección, sacrifique cada cría dirigiendo las tijeras hacia la base del cuello, justo por encima de los hombros, y separe la cabeza del tronco. Para exponer los ganglios, utilice agujas de calibre 23 para fijar la cabeza, con el cuello hacia arriba, en tres ubicaciones.

Primero, sujete la médula espinal. Segundo, tire de la piel anterior hacia la nariz y sujétela con una chincheta, y tercero, sujete el esófago y la tráquea alejándolos de la parte posterior del cuello. Busque el GCS localizando la bifurcación de la arteria carótida.

La arteria carótida es una estructura pareada. Hay dos bifurcaciones en cada lado del cuello, por lo tanto dos SCG por población. El SCG se encuentra justo debajo de la rama.

Separar el GCS de las arterias tirando de la bifurcación utilizando los dos extremos. El GCS es translúcido e incoloro en comparación con el tejido adiposo opaco y amarillento que rodea la bifurcación. Colocar los ganglios en 12 mililitros de L 15.

Medio suplementado con glucosa en un tubo cónico de 15 mililitros sobre hielo. Después de que todos los GCS se hayan obtenido de los embriones y se hayan centrifugado suavemente los ganglios durante un minuto. A 600 RPM, retire el medio en exceso de Reese.

Suspenda los ganglios en un mililitro de L-15. Medio que contiene tripsina y colagenasa. Incube durante 24 minutos a 37 grados Celsius.

Agite cada ocho minutos. A continuación, agregue 10 mililitros de medio marino para inactivar la centrifugación con tripsina durante un minuto. A 600 RPM, retire la mayor cantidad posible del medio de colagenasa con tripsina y lave los ganglios con 10 mililitros de medio C, centrifugando durante un minuto a 600 RPM.

Repita este lavado una vez. Retire el medio de lavado y resuspenda los ganglios en un mililitro de medio C para disociar mediante tritación usando una aguja de calibre 21 conectada a una jeringa de cinco mililitros durante un máximo de 15 ciclos hacia arriba y hacia abajo. Termine la tritación usando una aguja de calibre 23 hasta que la mayoría de los agregados se hayan disociado.

Elimine cualquier grumo restante de células filtrando los neuronas disociadas a través de un filtro de nailon de 70 micrones hacia un tubo cónico de 50 mililitros. Retire una alícuota de 10 microlitros de la suspensión celular filtrada, mezcle con azul de tripano para determinar el número de células viables. Cuente el número de células que excluyen activamente el colorante utilizando un hemocitómetro.

A continuación, distribuya de 5.000 a 6.000 células vivas totales en 100 microlitros de medio C en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pocillos previamente recubierta con colágeno y laminina, e incluya 50 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento nervioso en el medio C. Incube durante la noche a 37 grados Celsius. Al día siguiente, día uno in vitro o DIV uno, verifique la correcta adhesión de las neuronas y el crecimiento de algunas proyecciones axonales.

Sustituya el medio C en los pocillos por 50 microlitros de medio neurobasal o NBM que contenga NGF Acho y cinco fluoro dos deoxiuridina. Sustituya el medio una fila a la vez para asegurarse de que las células no se sequen. Incube los cultivos a 37 grados Celsius durante cinco días.

Monitoree el cultivo diariamente para confirmar la muerte de las células no neuronales y el crecimiento de las neuronas. Para comenzar esta parte del procedimiento en el día seis in vitro, verifique que la mayoría de las células de soporte no neuronales hayan sido eliminadas. Es sumamente importante minimizar en todo momento la manipulación física innecesaria de la neurona.

La eliminación y sustitución del medio debe realizarse de forma muy suave y lenta, ya que el estrés mecánico resultante puede afectar la viabilidad neuronal. Añada aciclovir o un CV al medio existente en cada pocillo hasta alcanzar una concentración final de 100 micromolar. Añada el CV lentamente y con suavidad para asegurarse de que la fuerza mecánica no afecte negativamente a las células al día siguiente.

En el día in vitro siete, infecte las culturas de GCS con un HSV uno recombinante que expresa un reportero de EGF fusionado a la proteína viral lítica US 11, con una multiplicidad de infección entre uno y dos. Añada el virus diluido directamente al medio existente en la placa. Incluya un control infectado con placebo y una infección lítica.

Control positivo en medio sin CV. Deje que la infección transcurra durante dos o tres horas a 37 grados Celsius. A continuación, sustituya el medio de infección por NBM fresco que contenga NGF y un CV. Es fundamental ser extremadamente cuidadoso al cambiar el medio de infección. Incline la placa hacia usted y retire lentamente el medio desde la parte inferior del pocillo.

Luego dirija la punta de la pipeta hacia la pared del pocillo, en lugar de hacia el fondo del mismo, y permita que el medio baje suavemente hasta las células. Reemplace una fila de medio a la vez para evitar que las células se sequen. Devuelva los cultivos al incubador, manipulándolos con la mayor suavidad posible para no comprometer su capacidad de mantener la latencia del VHS-1.

Mantenga los cultivos durante seis días a 37 grados Celsius, período durante el cual el virus establecerá la latencia. Durante este tiempo, utilice un microscopio fluorescente para monitorear la expresión de us 11 EGFP como indicador de la replicación lítica.

Como era de esperar, no debería haber expresión de GFP en el control infectado simulado. S 11 EGFP debería detectarse únicamente en la infección. Los pocillos del control positivo que carecen de un tratamiento CV indican una infección primaria exitosa y una replicación lítica productiva.

Para evaluar la reactivación en DIV 14, reemplace cuidadosamente el medio que contiene CV con medio fresco sin CV como antes. Dirija la punta de la pipeta hacia la pared del pocillo en lugar de hacia el fondo del pocillo y permita que el medio descienda suavemente sobre las células, si es apropiado. Incluya variables farmacológicas o biológicas tales como LY 2 9 0 0 4 a 20 micromolar.

No se debería detectar expresión de GFP en los cultivos infectados de forma latente tratados con A CV. Devuelva las células a 37 grados Celsius durante un período de cinco a seis días. Monitoree los cultivos vivos utilizando un microscopio fluorescente para detectar neuronas que estén experimentando reactivación.

La frecuencia de reactivación se calcula contando el número de pocillos que contienen neuronas positivas para EGFP y expresando este valor como una proporción del número total de pocillos de la muestra. Esta figura ilustra un ejemplo en el que se aplica estatina desencadenante, un inductor conocido de la reactivación, a cultivos de ganglios cervicales superiores infectados en fase tardía. La reactivación se monitoreó y evaluó mediante microscopía de fluorescencia cada día tras el tratamiento con el fármaco durante un período de cinco días.

Con TSA, la reactivación alcanza el 50 % del máximo en dos días y, en cinco días, alcanza el 60 % de la línea base o reactivación espontánea representada por el DMSO. Las cultivos control tratados alcanzan aproximadamente el 10 % en este experimento y generalmente varían entre el 5 % y el 20 % utilizando este sistema in vitro. Posteriormente, los cultivos de SCG infectados también fueron tratados con LY 2 9 0 0 4.

Se compararon cultivos con reactivación inducida por LY, un inductor conocido, con aquellos tratados con el inhibidor de la síntesis del ADN viral, ácido fóforo-acético, y con ambos compuestos juntos, como se ilustra aquí. La expresión de US 11 EGFP se ve afectada por el ácido fóforo-acético en cultivos inducidos a reactivarse con LY 2 9 4 0 0 2, lo que indica que la expresión de US 11 EGFP depende de la replicación del ADN viral. Al realizar este procedimiento, es importante prestar mucha atención a la técnica estéril y manipular el cultivo de GC con la mayor delicadeza posible para evitar una mayor reactivación espontánea inducida por estrés o movimientos mecánicos. Tras seguir este procedimiento para establecer infecciones latentes por HSV-1 y neuronas en cultivo, se pueden realizar otros métodos como el silenciamiento por S-H-R-N-A, y la expresión ectópica de genes salvajes y mutantes, con el fin de caracterizar las funciones neuronales que regulan la latencia y la reactivación del HSV-1.

No olvide que el HSV tipo 1 es un patógeno humano que requiere precauciones de seguridad de nivel de contención biológica 2 (PSL 2). Debe estar familiarizado con el trabajo bajo condiciones de PSL 2 antes de realizar este procedimiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo establecer cultivos de ganglios cervicales superiores (SCG) para establecer infecciones latentes por HSV tipo 1, y cómo inducir eficazmente la reactivación en las neuronas.